甲狀旁腺素類似物，它們的生產方法和含有它們的藥物組合物的製作方法

2023-06-12 23:56:16

專利名稱：甲狀旁腺素類似物，它們的生產方法和含有它們的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及甲狀旁腺素(PTH)的變異體、其生產方法、含有他們的藥物製劑以及藥物用途。
本文所使用的術語「PTH」指任何一種遺傳編碼形式的甲狀旁腺激素，包括含有84個胺基酸的成熟形式脊椎動物，如，人、豬、鼠、牛、雞的PTH，及其片斷以及其具有PTH樣活性的類似物和衍生物。按國際上認可的方法給包含在該PTH序列中的每一胺基酸位置編號。為了一致並按慣例，在以下描述中，將同樣的編號體系用於PTH序列的胺基酸。而不隨分子中取代模式而變化。
更具體地說，本發明提供一種具有PTH樣活性並含至少一種修飾的以游離形式或鹽形式或配合物形式的PTH化合物，所說的修飾是或者為1.至少一個選自L-或D-α-胺基酸、C2-6烷氧基羰基和可能被取代或不取代的C1-8烷基、C2-8鏈烯基、C2-8炔基、芳烷基、芳烯基(aralkenyl)或C3-6環烷基-C1-4烷基的基團並與PTH化合物末端氨基相連，和/或至少一個基團選自C2-6烷氧基羰基和可能被取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基、C2-8炔基、芳烷基、芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物的一個或多個側鏈氨基相連，或者為2.在天然存在的PTH序列的1到38位中至少一個α-胺基酸單位可以被天然的或非天然的胺基酸以保護的形式置換或不置換，藉此，在PTH序列氨基末端的1和2位中的胺基酸單位一起可被一種假肽所置換，或者是這些修飾的組合先決條件是當該PTH化合物從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸或從C2-6烷氧基羰基或可能被取代或不取代的C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳烷基、C2-8炔基、芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它就不是一種具有天然來源的α-胺基酸序列的PTH化合物;或者該PTH化合物不為這樣的PTH(1-34)，其中ⅰ.在1位的α-胺基酸為Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr;或ⅱ.在2位的α-胺基酸為Ala，D-Val，Lys，Arg或Cit且在34位的α-胺基酸為Tyr;或在2位的α-胺基酸為D-Val且34位的α-胺基酸為D-Tyr;或在2位的α-胺基酸為D-Val，且34位的α-胺基酸為D-Tyl和可選擇地8位和18位α-胺基酸各自可以為Nle;或ⅲ.在3位和/或6位和/或9位的α-胺基酸被一個天然或非天然胺基酸置換;或ⅳ.在23位的α-胺基酸被Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置換;或ⅴ.在25位和/或26位和/或27位的α-胺基酸被Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置換;或ⅵ.在8和18位的α-胺基酸各自為Nle或各自為Met(O)且34位α-胺基酸可以是Tyr;或8和18位α-胺基酸各自為Nle且34位的α-胺基酸為Tyr和或者12位的α-胺基酸為L-或D-Pro，L-或D-Ala，Aib或Nme Gly或者23位的α-胺基酸為Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或B-Nal;或ⅶ.在28位的α-胺基酸為Lys且30位的α-胺基酸為Leu;或ⅷ.在1位的α-胺基酸為Aib;和/或在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp;和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Llys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr;和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁酯)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn;和/或在13位的α-胺基酸為Leu;和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His;和/或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp;和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His;和/或在27位的α-胺基酸為Gln或Leu;或
ⅸ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala或Ser;或在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp且在34位的α-胺基酸為Tyr;或者該PTH化合物不為這樣的PTH(1-84)其中ⅰ.在1位的α-胺基酸為Tyr，Val，Pro，Asp或Cys;或ⅱ.2位的α-胺基酸為Ala，Glu，Leu，Ser或Arg;或ⅲ.3位的和/或6位和/或9位α-胺基酸被一種天然或非天然胺基酸置換，或ⅳ.在23位的胺基酸由Ala，Arg，Asn，Asp，CLys，.Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置換;或ⅴ.在25位和/或26位和/或27位的胺基酸由Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置換;或ⅵ.在8位的α-胺基酸為Met，Met(O)，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly且18位的α-胺基酸為Leu;或8位和/或18位α-胺基酸為Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp，且34位α-胺基酸可以是Tyr;
或8位和18位的α胺基酸各自為Met(O);
或8位的α-胺基酸為Leu且18位的α-胺基酸為Met(O);或ⅶ.26位的α-胺基酸為Gln;
該化合物不是Pro°PTH(1-84)或[Met°，Leu8，Leu18]PTH(1-84);或該PTH化合物不是，在36位的α-胺基酸是Leu的hPTH(1-36)，當PTH序列是從一個PTH片斷得到時，它是一種具有PTH樣活性的片斷並含有PTH的N-末端的至少27個胺基酸單位(優選高達PTH N-末端前38個胺基酸單位，如，1-34到1-38，如1-34，1-36，1-37或1-38PTH)、該α-胺基酸中至少一個按本發明被取代的PTH片斷。一般存在於天然產生的PTH序列中的一個或幾個α-胺基酸單位也可被刪去。hPTH片斷，尤其是hPTH(1-34)和hPTH(1-36)，是優選的。
PTH化合物的C-末端可以是-COOH，酯化的-COOH(如-COORa其中Ra為低級烷基，例如C1-4烷基)，-CONH2或一種單或雙取代的醯胺，如-CONRbRc其中Rb和Rc之一為H而另一個為脂族殘基，如C1-6烷基或兩個均為脂族殘基，或Rb和Rc與連結它們的氮原子一起形成一個雜環殘基，如吡咯烷基或哌啶子基(piperidinyl)。
在下文中，把這些化合物均歸為本發明的化合物。
「天然胺基酸」指本領域中公知的那些。在U.S.P.T.O發行的Tradmark Official Gazette(出版於May 15，1990，p.33at 46)中已被列出並提供了標準縮寫。這些胺基酸和縮寫特收入本文中作參考。
以下列出了天然胺基酸A Ala 丙氨酸D Asp 天門冬氨酸E Glu 穀氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 組氨酸I Ile 異亮氨酸K Lys 賴氨酸L Leu 亮氨酸M Met 蛋氨酸N Asn 天門冬醯胺Q Gln 穀氨醯胺R Arg 精氨酸S Ser 絲氨酸T Thr 蘇氨酸V Val 纈氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr 酪氨酸「非天然胺基酸」單位一詞意指不是遺傳學上編碼的胺基酸單位。非天然胺基酸單位的例子包括如按以上表明的天然α-胺基酸的D異構體，Aib(氨基-異丁酸)，bAib(3-氨基異丁酸)，NVa(正纈氨酸)，β-Ala，Aad(2-氨基-己二酸)，bAad(3-氨基己二酸)，Abu(2-氨基丁酸)，Gaba(γ-氨基丁酸)，Acp(6-氨基己酸)，Dbu(2，4-二氨基丁酸)，TMSA(三甲基矽烷基-Ala)，aIle(別異亮氨酸)，Nle(正亮氨酸)，ten、Leu，(特亮氨酸)，Cit(瓜氨酸)，Orn，Dpm(2，2′-二氨基庚二酸)，Dpr(2，3-二氨基丙酸)，α-或β-Nal，Cha(環己基-Ala)，羥基-脯氨酸，Sar(肌氨酸)等，環胺基酸單位和Nα-烷基化的胺基酸單位，如MeGly(Nα-甲基-甘氨酸)，EtGly(Nα-乙基-甘氨酸)，EtAsn(Nα-乙基-天門冬醯胺)。
就保護形式的胺基酸來說，意思是指一種天然的或非天然的胺基酸，它具有如一種含有一個象O，S或N雜原子並能用一種O-，S-或N-保護基保護的側鏈。本發明的PTH化合物的N-末端也可以是保護的形式。
作為可存在於胺基酸單位的N-末端或側鏈氨基的N-保護基團包括如，在「Protective Groups in Orgamic Synthesis」，T.W.Greene，J.Wiley Sons NY(1981)，219-287中公開的基團，例如醯基如甲醯基、乙醯基、三氟乙醯基、甲氧琥珀醯基、羥基琥珀醯基或在苯環上可以被如對-甲氧羰基、對-甲氧基、對-硝基或對-苯基亞磺醯氨基羰基隨需取代或不取代的苯甲醯基;烷氧羰基如叔-丁氧羰基，異丁氧羰基或甲氧羰基;烯丙氧基羰基;三苯甲遊基;2，2，5，7，8-戊甲基-苯並二氫吡喃-6-磺醯基;芳基甲氧羰基如9-氟芴基甲氧羰基或在苯環上可以被對-甲氧基，對硝基，鄰-或對-氯，間-苯基或3，4-二甲基隨需取代或不取代的苯甲氧基羰基;芳基甲基如在環上可以被對一甲氧基，對-硝基或對氯隨需取代或不取代的苯甲基;或芳基磺醯基如在環上可以被對-甲基或對-甲氧基隨需取代的苯基磺醯基，或在環上可以被如氨基或二(C1-4烷基)氨基隨需取代或不取代的萘基磺醯在。
含氧側鏈的氧保護基為如在「The Peptides」，3，(1981)，E.Gross and J.Meienhofer(Ed.)中描述的。至於脂族羥基官能度，合適的氧保護基為如在上述文獻「Protection of the Hydroxy Group」，J.M.Stewart，169-201中描述的，並包括苯甲基，叔-丁基和甲基。至於芳族羥基官能度，合適的氧保護基包括苯甲基，叔-丁基，甲基，甲苯磺醯基和苯甲氧基羰基。胺基酸側鏈上羧基官能度的氧保護基為公知的酯基和如在「The Peptides」，3，101-135(「Carboxyl Protecting Groups」by R.W.Roeske)描述的並包括甲基，乙基，叔-丁基和苯甲基。胺基酸側鏈上硫羥官能度的硫保護基是已知的和如在「The Peptides」，3，137-167(「Sulfhydryl Group Protection」by R.G.Hiskey)中描述的。例子包括甲基，叔-丁基，苯甲基，對-甲氧基苯基-甲基，乙基氨基-羰基和苯甲氧基羰基。
按本發明，PTH化合物的末端氨基上可以有基團至少一個基團選自L-或D-α-胺基酸，C2-6烷氧基羰基和隨需取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基的基團，和/或一個或幾個側鏈氨基上有至少一個基團選自C2-6烷氧基羰基和可以隨需取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基。當如此的一個基團與側鏈氨基相連時，優選地在Lys單位的∑-氨基上。對烷基，烯基，芳烷基，芳烯基或環烷烷基烷基優選的取代基為羥基，氨基而對於芳基部分的取代基也可為滷素和/或C1-4烷氧基。烷基基團或烷基部分可為線狀或枝狀並可以隨需被O，S或N間斷。優選地，在PTH化合物的氨基上，任何一個C1-8烷基，C2-8烯基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基為非取代的。C1-8烷基的例子是C1-6烷基，優選甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，叔-丁基;C2-8烯基的例子為C2-4烯基，優選烯丙基;C2-8炔基的例子為C2-4炔基，優選丙-2-炔基;芳烷基的例子為苯基或苯甲基;芳烯基的例子為苯乙烯基;C3-6環烷基-C1-4烷基的例子為環己基-甲基。優選地，C2-6烷氧基羰基為甲醯基或乙醯基。與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸合適的例子包括如D-或-LPro，Ala。當存在時，優選的取代基的烷基、烯基，烷氧基羰基或與PTH化合物N-末端相連的D-或L-α-胺基酸和/或與一個或多個側鏈氨基相連的至少一個烷基或烷氧基羰基。
本發明優選的PTH化合物為含有在PTH序列下列位置之一至少一個胺基酸單位被置換的那些化合物1，2，3，8-11，13到19，21，22，29到34，尤其是8-11，16-19，33和/或34。此外本發明優選的PTH化合物是含有一個以上胺基酸單位被置換的那些，尤其是兩個以上的胺基酸單位，更好的是三個以上胺基酸單位，特別是5到7個取代的胺基酸單位被置換，優選地為上述所提及PTH序列位置的任意組合。
在一系列特定的或可選擇的具體方案中，本發明提供了一種如上所描述的PTH化合物，其中尤其是在PTH序列的氨基末端的，和2位中的α-胺基酸被假二肽所置換。
文中所使用的「假＝肽」一詞指一種二肽等排物，其中在該2個胺基酸殘基間的肽鍵(是天然的或是非天然的)被一個等排基團如，-CH2-NH-，-C(滷素)＝CH-或-C(烷基)＝CH-置換。
其中1位和2位的α-胺基酸被假二肽置換的本發明化合物的例子包括如式Ⅰ的游離形式或鹽形式或配合物形式的化合物，
其中X為一種式(a)或(b)殘基 其中Z和Z′各自獨立地為H;可隨需取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基;或一種保護基，至多Z和Z′的最多之一為一種保護基，Z″為H，C1-8烷基或一種保護基Y和Y′各自獨立地為一種天然或非天然α-胺基酸可隨需被保護的側鏈，Ya和Yb之一為氫而另一個為一種天然或非天然α-胺基酸的可隨需被保護的側鏈或Ya和Yb和與他們相連的碳原子一起形成一個C3-6環烷基基團，
和w為滷素或C1-4烷基或w和Y′與他們相連的 部分一起，形成一個可以隨需取代或不取代的芳族環或雜環殘基，和P1為一個PTH序列，其中N-末端的1和2位的胺基酸單位被刪去。
式Ⅰ化合物中，P1可為PTH一個的片斷(3-Z)，其中Z為84或從27到38的整數，優選從34到38，尤其34，36，37或38，特別是34或36。P1代表的PTH序列或者可與天然產生的PTH序列相對應，或者可與天然產生的PTH序列中至少一個α-胺基酸單位已被天然的或非然的胺基酸以保護的形式置換和/或一個或多個α-胺基酸單位也被刪去的PTH序列相對應。P1也可以包含至少一個側鏈氨基按以上描述來取代的。
滷素優選的為氟或氯。
在式(a)殘基中，雙鍵最好具有反式構型(E)。
作為與天然α-胺基酸的α-碳原子相連的殘基，Y，Y′，Ya或Yb可以是存在了以上所列的天然α-胺基酸中的側鏈，如存在於Gly(即H)，Ala，Val，Ser，Leu，Ile，Phe，Trp中的。Y，Y′，Ya或Yb也可以是與按以上指出的非天然α-胺基酸的α-碳原子相連的殘基，如，在Nva，Orn，Abu，Aib，Nle中的。如果作為Y，Y′，Ya或Yb的天然或非天然胺基酸側鏈包括雜原子如O，S或N，側鏈上的雜原子可以隨需用O-，S-或N-保護基來保護，如，以上所指出的。
保護基團如Z或Z′或Z″可為以上所描述的。C1-8烷基如Z或Z′或Z″可以是如上述表示的。
優選地，Z或Z′為氫或C1-4烷基，尤其是氫或甲基。
優選地Y為H或CH3當W是C1-4烷基時，它最好是CH3當W和Y′與其相連的部分一起形成可以隨需取代或不取代的芳族環或雜環殘基時，它為一種可以含有或不含有選自N，S和O的1或2個雜原子的芳族5-或6元環殘基，如，苯基，咪唑基，吡啶基，噁唑基或噻唑基。優選的取代基為閎基或甲氧基，尤其對於苯基環。
Y′優選地為H，CH3，異丙基或苯甲基。
當Z″為C1-8烷基時，優選CH3，C2H5或異丙基。
如果Ya和Yb一起是C3-6環烷基優選為環丙基或環戊基。
當Z″為保護基團時，優選醯基，尤其乙醯基。
在一系列特定的和可選擇的實施例中，本發明提供一種如上所描述的PTH化合物，其中PTH序列N-末端的1位α-胺基酸單位和/或2位α-胺基酸單位被一種保護或未保護的天然或非天然胺基酸殘基所置換，先決條件是當PTH化合物是從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸游離或從C2-6烷氧基羰基或取代或末取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它不是一種具有天然產生的α-胺基酸序列的PTH化合物;
或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-34)其中ⅰ.在1位的α-胺基酸為Aib，Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr;或ⅱ.在2位的α-胺基酸為Ala，D-Val，Lys，Git或Arg且在34位的α-胺基酸為Tyr;或在2位的α-胺基酸為D-Val且在34位的α-胺基酸為D-Tyr和可有可無地8位和18位α-胺基酸各自可以為Nle;或ⅲ.在1位的α-胺基酸為Aib且至少一個另外的α-胺基酸單位已被按如下置換在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁酯)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在25位和/或26的位α-胺基酸為His，和/或在27位的α-胺基酸為Gln或Leu，或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-84)其中ⅰ.在1位的α-胺基酸為Tyr，Val，Pro，Asp或Cys;或ⅱ.在2位的α-胺基酸為Ala，Glu，Leu，Ser或Arg。
在1位和/或2位的α-胺基酸被按以上所指示的置換的本發明化合物的例子包括如式Ⅱ化合物X1a-Y2a-P1Ⅱ其中X1a為一種被保護或未保護的天然α-胺基酸殘基或一種式(Ⅱa)殘基 其中Za和Z′a各自獨立地為H，C1-6烷基或一種保護基，Za和Za′至多之一為保護基，和或者n為1且ⅰ.R1和R2各自獨立地為C1-6烷基，或ⅱ.R1和R2之一為甲基或乙基而另一個為一種保護或未保護的與天然α-胺基酸(Ala，Leu，Ile或Val除外)的α-碳原子相連的殘基，或ⅲ.R1和R2之一為氫、甲基或乙基而另一個為一種保護的或未保護的與天然α-胺基酸的α-碳原子相連的殘基，或ⅳ.R1和R2和與他們相連的碳原子一起形成C3-6環烷基基團，或ⅴ. 殘基代表一個隨需可以與苯環縮合或不縮合的雜環殘基，或n為2，3，4或5且R1和R2各自為H或CH3，Yza為一種保護或未保護的天然α-胺基酸殘基或一種式(Ⅱb)殘基
Zb為H或C1-6烷基且或者m為1而ⅰ.R3和R4各自獨立地為C1-6烷基，或ⅱ.R3和R4之一為甲基或乙基而另一個為一個保護的或未保護的與天然α-胺基酸(Ala，Leu，Ile或Val除外)的α碳原子相連的殘基，或ⅲ.R3和R4之一為H，甲基或乙基而另一個為一個保護的或未保護的與非天然α-胺基酸的α碳原子相連的殘基，或者m為2，3，4，或5而R3和R4各自為H或CH3，和P1定義同上。
當 殘基為一個可以隨需與苯環縮合的雜環殘基時，它可為一個由飽和或不飽和的含有一個或多個選自N，O和S雜原子的5-或6-元素環衍生的殘基。此類雜環殘基的例子包括如，2-吡啶基，3-嗎啉基，六氫化噠嗪基，2-或3-吲哚基。
當n或m大於1時，CR1R2或CR3R4部分可為-CH(CH3)-CH2-，丙基，丁基或戊基。
C3-6環烷基如R1和R2優選地為環丙基或環戊基。
作為與天然α-胺基酸的α-碳原子相連的殘基，R1，R2，R3或R4可以是存在於以上所列天然α-胺基酸中的側鏈，如，存在在Gly，Ser或Thr中的。R1和R2之一或R3和R4之一可為甲基或乙基而另一個可為CH3，異丙基，異丁基或CH3-CH2-CH(CH3)-。R1，R2，R3或R4也可為與以上表示的非天然α-胺基酸的α-碳原子相連的殘基，如，存在於Abu，Gaba，Nva，Aib，TMSA或Nle中的。如果天然或非天然胺基酸的側鏈如R1，R2，R3或R4包括雜原子如O，S或N時，在側鏈上的該雜原子可以隨需用O-，S-或N-保護基團來保護或不保護，如按以上所表示的。保護基團如Za或Za′可為以上所描述的。C1-6烷基如Za或Za′優選地為直鏈或支鏈C1-4烷基。優選地，Za和Za′之一為H而另一個為H，C1-4烷基或一個保護基團，尤其是H。
在另一個實施例中，本發明也提供一種以上所描述的PTH化合物，其中在8位上的α-胺基酸單位和/或18位的α-胺基酸單位被一個保護的或未保護的天然或非天然胺基酸殘基所置換，先決條件是當該PTH化合物是從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸游離或從C2-6烷氧基羰基或隨需取代的或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它不是具有天然產生的α-胺基酸序列的PTH化合物;
或該PTH化合物不是這樣的PTH(1-34)其中ⅰ.在8位和18位的α-胺基酸各為Nle或各為Met(o)而34位α-胺基酸可隨需選擇Tyr;或在8位和18位的α-胺基酸各為Nle而在34位和α-胺基酸為Tyr且或者在12位的α-胺基酸為L-或D-Pro，L-ak D-Ala，Aib或NMeGly或者在23位的α-胺基酸為Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或β-Nal;或在8位和18位的α-胺基酸各為Nle而在2位的α-胺基酸為D-Val且在34位的α-胺基酸為D-Tyr;或ⅱ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp且選擇地至少一個另外的α-胺基酸單位已被按如下置換在1位的α-胺基酸為Aib和/或在11的位α-胺基酸為Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁酯)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位的和/或在21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His，和/或在27位的α-胺基酸為Glu或Leu;或ⅲ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala或Ser;或在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，且在34位的α-胺基酸為Tyr;或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-84)其中在8位的α-胺基酸為Met，Met(o)，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly而在18位的α-胺基酸為Leu;或在8位和18位的α-胺基酸各自為Met(o);或在8位的α-胺基酸為Leu且在18位的α-胺基酸為Met(o);或該PTH化合物不是[Leu18，Tyr34]hPTH(1-84)，[Leu8，Tyr34]hPTH(1-84)，[Ile8，Leu18，Tyr34]hPTH(1-84)或[Leu8，Leu18，Tyr34]hPTH(1-84)。
當在8位的α-胺基酸單位被一個非天然胺基酸置換時，它可為以上描述的非天然胺基酸，如Nva，Nle或Cha、優選地為一個非天然親水胺基酸，此胺基酸含有直鏈烷基殘基是優選的，尤其優選的是Nva(正纈氨酸)和它的類似物。PTH序列第8位非天然胺基酸也可為一個C2-甲基化的或C2-乙基化的天然α-胺基酸。
其中第18位α-胺基酸單位被置換的本發明PTH化合物的例子，如其中第18位α-胺基酸殘基被天然胺基酸殘基如Gln，Tyr或Lys置換的PTH化合物，例如[Gln18]-PTH，[Lys18]-PTH和[Tyr18]-PTH，尤其是[Gln18或Lys18或Tyr18]-hPTH-(1-x)，其中x為84或27到38的整數，尤其是34到38的整數。當PTH序列為一個(1-36)PTH片斷時，第18位是Ala也是特別優選的。在這些化合物中，在8位的胺基酸可為Met或可由選自Leu，Ile，Val，Phe，Gln，Trp，Ser和Ala的胺基酸置換或可以是一個非天然親水胺基酸殘基，如，Nva或Nle。
本發明這樣的PTH化合物的另一組包括如，其中在8位的胺基酸殘基由一個非天然親水胺基酸殘基(如Nle或更優選Nva)取代的PTH化合物。在這些化合物中，第18位胺基酸可為Met或可由選自Leu，Ile，Val，Phe，Trp，Ser，Ala，Gln，Lys或Tyr的胺基酸置換，優選Leu，Gln，Ala或Tyr。
本發明此類PTH化合物的另一組為在保留位置如1到7，9到17和/或19到38中的一個或多個胺基酸單位或者被刪去或者除了在8和/或18位中的α-胺基酸取代之外再被置換的那些化合物。在該情況下，8位α-胺基酸優選地被Leu置換而18位α-胺基酸被Gln，Leu，Ala或Tyr置換。
在另外的或可選擇的具體實例中，本發明還提供了一種如上描述的PTH化合物，其中至少一個PTH序列的α-胺基酸序列被存在於PTHrp中相應位置上的α-胺基酸單位置換，先決條件是當該PTH化合物從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸或從C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它不為一種具有天然產生的α-胺基酸序列的PTH化合物;
或該PTH化合物不為PTH(1-34)，其中ⅰ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu;和/或在H位的α-胺基酸為Lys;和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg;和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His;和/或在27位的α-胺基酸為Leu;或
ⅱ.在25位的α-胺基酸為Gln和/或在26位的α-胺基酸為Asn，在27位的α-胺基酸可以是Leu;或該PTH化合物不為[Leu8，Leu18]PTH(1-84)。
「PTHrp」一詞指任何一種遺傳編碼形式的PTHrp，如，人、雞、小鼠或鼠的PTHrp。為了一致並按慣例，在以下描述中，將同樣的編碼體系用於在1位以Ala起始並含有如，38位Ala的PTHrp序列的胺基酸。
本發明的該組化合物為PTH和類似的PTHrp序列之間的雜化物(文中指PTH-rp雜化物)。按本發明取代的胺基酸序列是發生在從1位直到38位，尤其1到36位，特別是1到34位。
本發明優選的PTH化合物是PTH-rp雜化物，其中該PTH序列的一個以上α-胺基酸單位(如，至少2個，優選為3到5個α-胺基酸單位)按本發明被取代。
本發明優選的一組PTH-rp雜化物包括在PTHα-胺基酸序列中8到11位的至少一個α-胺基酸單位(即，Met8，His9，Asn10或Leu11)被相應的PTHrp序列相應的α-胺基酸單位(即，Leu8，His9，Asp10或Lys11)取代的PTH化合物。在8位和/或10位的取代是優選的，尤其是第8位和10位。更優選地，所說PTH序列的8，10和11位α-胺基酸分別被Leu8，Asp10和Lys11取代。
本發明優選的另一組PTH-rp雜化物包括PTHα-胺基酸序列16位到19位中至少一個α-胺基酸單位被相應的PTHrp序列相應的α-胺基酸單位(即，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19)取代的PTH化合物。優選地，所說序列的3個或所有4個α-胺基酸被取代。尤其優選的是在16位的α-胺基酸為Gln，在18位的α-胺基酸為Leu且在19位α-胺基酸為Arg的本發明PTH化合物。
本發明另一個優選的一組PTH-rp雜化物包括PTHα-胺基酸序列33和34位的至少一個α-胺基酸單位由相應的PTHrp序列的相應的α-胺基酸單位(即，Thr33，Ala34)取代的PTH化合物。優選地，兩個α-胺基酸均被取代。
本發明再進一步優選的PTH-rp雜化物組為包含上述α-胺基酸取代物(8-11，16-19，33-34)的任何組合的PTH化合物，更優選地，選自以上指出的8-11和33-34序列取代物的組合物。
正如可預知的那樣，在本發明的PTH-rp雜化物中，在1到38位的一個或多個α-胺基酸可進一步被以上所指出的天然或非天然胺基酸取代或被刪去。在10位中可以有一個α-胺基酸選自Gly，Gln，Glu，His，Ser，Thr或Tyr。在13位中可有一個除Arg外的D-或L-α-胺基酸，如，Ala，Cys，Gln，Ile，Asn，Trp，Asp，Val，Ser，Thr，Tyr，Met，Leu或Gly;在16位中可有一個D-或L-α-胺基酸，如，Lys，Ser，Leu，Ala，Gln或Gly;在17位中的Ala或Ser或優選地為一個具有比Ala或Ser大的側鏈的胺基酸，如，Glu，Gln，Phe，His，Ile或Lys;在18位中是Gln或Tyr;19位為Ala，Arg，Val，Tyr，Ser，Lys，Met，His，Gly，Pro，Asn或Ile;Gln或Arg在26位中，和/或33位為一個D-或L-α-胺基酸如，Ser，Thr，Leu，Gly，Gln，Arg，Pro，Asp，Ile，Lys，或Thr。他們也可按以上指出的在N-末端或在側鏈氨基上被取代。如果需要，本發明的PTH-rp雜化物的含S-或O-側鏈也可按以上所描述的方法來保護。
本發明優選的PTH-rp雜化物的例子為[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]PTH和[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]PTH。
本發明優選的PTH-rp雜化物為PTH(1-x′)化合物，其中x′為一個從34到38的整數，尤其是34，36，37或38，特別是hPTH(1-x′)，其中一個或多個α-胺基酸被存在在PTHrp相應位置上的α-胺基酸置換，優選地按以上所描述的。當33位和34位被相應的PTHrp的α-胺基酸序列置換時，該PTH化合物優選地為一個含有34個α-胺基酸單位的hPTH片斷。具有羧基末端的PTH-rp雜化物是較好的。
優選地，PTHrp為hPTHrp。
本發明的化合物可以如游離形式，鹽的形式或以其複合物的形式存在。酸加成的鹽可用如有機酸，聚合物的酸和無機酸來形成。此類酸加成鹽的形式包括如鹽酸鹽和乙酸鹽。複合物如由本發明的化合物加成無機物(如，無機鹽或氫氧化物象Ca-和Zn-鹽)和/或加成聚合的無機物來形成。
本發明還提供一種生產本發明化合物的方法。他們可以分步的方式或者在溶液中或者使用固相合成法或基因工程法來製備。
例如，本發明的化合物可如下來製備a)除去以保護方式存在於本發明化合物中的至少一個保護基團;或b)通過醯胺鍵，將兩個肽片斷連結在一起，獲得所需化合物的所需胺基酸的肽片斷，然後可選擇地實施階段a)的過程。
c)為了產生一種在氨基末端的1和2位的α-胺基酸被一種假二肽置換的PTH化合物，將一種保護的或未保護形式的假二肽與一種1和2位胺基酸殘基被刪去的保護或未保護形式的PTH肽進行反應並且如需要再進行步驟a)的過程;或d)為了產生一種含有至少一個選自如下基團的PTH化合物與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸和與末端氨基相連的和/或與側鏈氨基相連的C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基，將如此的一個基團引入到以保護或非保護的形式的PTH化合物中並從此基團游離，且如果需要進行步驟a)的過程;
並且回收所獲得的游離形式，鹽的形式或複合物形式的該化合物。
步驟a)，b)和c)的過程可以與已知方法類似的方式，如按本領域已知的肽化學或按下列實施例所描述的方式來實施。需要時，在這些反應中，適用於肽類的保護基團可用功能基不參於反應。保護基團一詞也可包括一種具有功能基團的聚合物樹脂。
在步驟b)過程中，為產生氨基末端1和2位α-胺基酸單位被假二肽置換的PTH化合物，一個用作起始材料的肽片斷有含有N-末端的假二肽。該起始材料可按步驟c)的過程來製備。
在步驟c)的過程中，用作起始材料的假二肽可為一種或Ⅱaa或Ⅱbb的化合物ZZ′N-CHY-CW＝CH-CHY′-COOH(Ⅱaa)ZZ′N-CYaYb-CH2-NZ″-CHY′-COOH(Ⅱbb)其中Y，Y′，Ya，Yb，Z，Z′，Z″和W如上定義，或某一種功能衍生物，如酯，醯基滷或一種對稱的或不對稱的酐。W和Y′和與他們相連的 部分一起形成一種取代或未取代的芳族環或雜環殘基的式Ⅱaa化合物和Z″為烷基或保護基團(如，乙醯基)或其中-CYaYb為C3-6環烷基且Z″為H的式Ⅱbb化合物為新的並構成本發明的一部分。
步驟d)的過程可按類似於已知的方法來進行，如，烷基化方法。在本發明優選的實施例中，烷基化反應是在還原條件下進行的，如使用相應的醛或酮。它可在如NaBH3CN存在下進行，優選地在酸性pH，如從5到7。反應溫度可為如從-20℃到100℃。在惰性溶劑中進行反應是有利的，如，水，一種醇，二噁烷或DMF或它們的一種混合物。D-或L-α-胺基酸也可按已知的方法與N-末端相連。
在步驟b)過程中用作起始材料的肽片斷可包括一種或多種非天然胺基酸單位;也可在N-末端和/或側鏈氨基上被選自C2-6烷氧基羰基，取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基的基團所取代或它也可載於一個N-末端的D-或L-α-胺基酸上。
含有天然α-胺基酸單位的本發明化合物或其片斷也可採用重組技術來製備。
按本發明的一個優選的實施例，還提供一種生產中等大小的多肽的方法，其中一種融合蛋白被細菌細胞表達，該蛋白含N-末端噬菌體T4基因的55多肽，並且所需要的多肽連結在它的C-末端。
基因55多肽可包含噬菌體T4的完整的gp55蛋白(188胺基酸殘基)，該蛋白已被描述在Gram，H.和Rüger，R;1985;The EMBO Journal，4，(1)，pp 257-264中。另外一個片斷，一個gp55蛋白的N-末端片斷可被優選使用。例如，可使用包含該蛋白N-末端前112個胺基酸殘基的gp55蛋白片段。然而，一般，該基因55多肽包含該gp55蛋白的N-末端至少前25個殘基。
該中等大小的多肽在胺基酸長度上可從約20直到100，如，150，優選從約20到約50。中等大小多肽的例子包括降鈣素，內啡肽，腸胃抑肽(gastric inhibitory peptide(s))，胰高血糖素，神經肽Y(neuropeptidey)，生長激素釋放因子(GHRF)，澱粉樣β蛋白片斷(amyloid β protein fragments)，水蛭素，胰島素，生長激素抑制素，表皮生長因子，神經生長因子和PTH或其片斷。可按本發明方法製備的尤其優選的中等大小多肽為具有天然胺基酸取代基的本發明化合物或其片斷。
該基因55-PTH融合蛋白容易包含一種在基因55多肽與所需的多肽之間的可裂解的鏈，優選地，該可裂解的鏈為化學可裂解的而更優選地是包含Asp-Pro-Pro或Asn-Gly-Pro胺基酸序列。
本發明的另一個方面，是提供一種編碼融合蛋白的核苷酸序列，該融合蛋白含有一種N-末端噬菌體T4基因55多肽和一種與其C-末端相連的所需的中等大小的多肽。
該核苷酸序列優選地為一種適於在細菌中表達的DNA序列。典型地，該序列包含編碼一種在基因55與所需多肽的編碼序列這間的裂解鏈的核苷酸。
本發明也提供一種包含一種編碼該融合蛋白的DNA序列的細菌表達載體。
該表達載體一般除含有融合蛋白編碼序列外，還含有適當的包括一種合適的啟動子，一種操縱子和一種核糖體結合位點的表達控制序列和其它適當的調節序列。通常，表達載體也包含一種或多種可選擇的標記物。
任何合適的啟動子均可使用，如TrpE，λP1，λpr，Lac或Tac啟動子。優選的啟動子為噬菌體T7啟動子和表達載體為一種質粒。為了大腸桿菌表達，一種R1或Col-E1質粒衍生的載體可被使用。例如，可使用從Novagen獲得的表達載體pET17B或類似的表達載體。
本發明另一方面提供由融合蛋白編碼序列或如上所述的表達載體轉化的細菌宿主細胞。儘管優選的宿主為大腸桿菌，例如，可使用大腸桿菌BL21(DE3)Lys E和類似的菌株。但任何合適的細菌宿主均可使用。
有利地，融合蛋白以不溶性包含體的形式積累在宿主細胞中，並因此便於融合蛋白產物從細胞中的回收。為了從融合蛋白中獲得所需多肽產物，溶解包含體蛋白，並將所需多肽產物與融合蛋白裂解。任何合適的變得可溶的處理均可使用，包括酸處理，如在約pH2到4，優選用酸在約pH2.5下處理，或用變性劑處理，如一種弱變性劑如鹽酸胍。另外，需要從裂解後保留的產物中除去一種或多種不需要的N-末端胺基酸殘基。
因此本發明更進一步的方面提供一種在細菌宿主中生產所需中等大小的多肽的方法，該方法包括引起轉變的如上定義細菌宿主細胞以表達包含體形式的融合蛋白;
分離包含體;
使包含體變得可溶，並從融合蛋白中裂解出所需多肽。
在一些中等大小的多肽的情況中，如PTH化合物，一般不需要仔細控制進行變性和復性的過程而獲得活性形式的PTH產物，如具有PTH樣活性。僅通過中和用於增溶的酸性條件可獲得活性形式的中等大小多肽產物。融合蛋白的增溶和裂解可在一個步驟中進行。
本發明也包括一種融合蛋白，它含有N-末端噬菌體T4基因55多肽和與其C-末端相連的所需的中等大小的多肽。
採用本發明的方法和載體，已經發現，產生高水平的中等大小的多肽，尤其是PTH產物是可能的。在大腸桿菌中，我們發現高達表達總蛋白約50%的蛋白為所需的融合蛋白。而且，融合蛋白形成易於從細胞其它成分中分離的包含體。再者，該包含體常由至少約90%的所需融合蛋白組成，從而能夠顯著減小所需要的純化工作量。更進一步，以融合蛋白形式的PTH產物的表達基本上減少了細菌細胞內內源多肽的過程，允許獲得同源產物。
優選地，可裂解的鏈包含化學可裂解的與所需多肽相鄰的胺基酸，通過簡單的化學手段允許所需的多肽從融合蛋白上裂解。優選地，所需的多肽不含有化學可裂解的基團。
優選的化學可裂解的鏈包含胺基酸Asp-Pro-Pro或Asn-Gly-Pro。Asp-Pro或Asn-Gly鍵可分別來用酸條件如，甲酸(通常約pH2.5)或閎氨來進行化學裂解。然後將保留在所需多肽的N-末端的二肽Pro-Pro或Gly-Pro採用一種合適的二肽基肽酶來去除。例如，能使用L.Lactis X-Pro二肽基肽酶EO3.4.14.5。此肽酶描述在Nardi等，1991;Applied and Environmental Microbiology，57，p45 to 50。
所需的多肽可在從融合蛋白中裂解後進行純化。可使用HPLC純化技術。純化可在任何不需要的N-末端胺基酸殘基除去前進行。
在實施例308到314中進一步說明本發明的方法。

圖1顯示胺基酸序列和相應的克隆到質粒pET17B中的截斷的gp55-Asp-Pro-Pro hPTH(1-38)OH融合蛋白的DNA序列，和圖2顯示胺基酸序列和相應的克隆到質粒pET17B中的全長gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(1-38)OH融合蛋白的DNA序列。
在下列實施例中，所有溫度為℃。採用下列縮寫。在本說明書中，沒有更進一步指示的PTH一詞包括羧基末端以及羧醯胺末端。
BOC＝叔丁氧基羰基DMF＝二甲基甲醯胺
DCM＝二氯甲烷Fmoc＝9-芴基甲氧羰基HoBt＝1-羥基苯並三唑TFA＝三氟乙酸Trt＝三苯甲遊基RP-HPLC＝反相高效液相色譜層析r.t.＝室溫DNP＝二硝基苯基Tos＝甲苯磺醯基DIPC＝二異丙基碳化二亞胺Pmc＝2，2，5，7，8-戊甲基苯並二氫吡喃-6-磺醯基Ip＝異丙基For＝甲醯基Cpe＝1-氨基-環戊烷-1-羧酸Cpp＝1-氨基-環丙烷-1-羧酸Cha＝環己基氨基丙酸tBu＝叔丁基實施例1Nα-異丙基hPTH(1-34)NH2在聚苯乙烯基質的樹脂載體上，採用分段的方法裝配此肽。用Boc-基保護α-氨基並且側鏈官能基按下述被保護Lys(2-氯苯甲基氧羰基)，Ser(苯甲基)，Thr(苯甲基)，Glr(苯甲基)，Asp(苯甲基)，Met(o)，His(DNP)，Arg(Tos)，和Trp(HCO)。其它殘基未被保護。
將氨基-4-甲基苯基-甲基-和(聚苯乙烯-聯乙烯基苯＝MBHA-樹脂)(0.7mmol/g)進行下述(17至(7))步驟的循環(1)DCM(2)三氟乙酸(50%)的DCM溶液(3)DCM(4)二異丙基乙基胺(10%)的DMF溶液(5)DMF(6)在DMF中預先形成的Boc-胺基酸的對稱酐(每g起始樹脂1.4mmol)(7)DMF洗滌物和試劑的體積為每克起始樹脂5至20ml。根據完成樹脂反應(步驟2.4.6)或從樹脂中完全置換出先前的試劑(步驟1.3.5.7)的需要，每一步驟重複多次。每個循環後除去樹脂樣品，並用茚三酮進行殘留氨基的比色試驗以檢驗偶合反應的完成。
在使用前通過將Boc-胺基酸(每g樹脂2.8mmol)和DCCI(每g樹脂1.4mmol)在含有完全溶解Boc-胺基酸的足夠量的DMF，在DCM中反應製備Boc-胺基酸對稱酸酐。過濾混合物，在濾液中加入較多的DMF，在不超過15℃的溫度下蒸發揮發成分濃縮濾液，所得溶液用於步驟(6)。
對每個胺基酸殘基重複(1)至(7)的反應循環，以提供出標題化合物的序列，Boc-Gln-OH和Boc-Arg(Tos)-OH除外，它們已在步驟(6)中偶合由於在DMF中它們已預先形成了1-羥基苯並-三唑酯。
在室溫下，將充份裝配的肽樹脂用20ml 5%的苯硫酚的DMF溶液處理二次，每次1小時，並用DMF、甲醇和二氯甲烷洗滌。將肽樹脂再次進行步驟(1)至(5)，接著按每克樹脂加入0.5ml丙酮，在20ml的DMF中的84mg氰基氫硼化鈉和0.2ml乙酸。在室溫下16小時後，用DMF和二氯甲烷洗滌樹脂並乾燥。
根據例如在International Journal of Peptide and Protein Research，vol.26，262-273頁(1985)中描述的「low-high」方法，用液態HF，甲硫醚，對-甲酚和乙烷-1，2-二硫醇處理肽樹脂。除去揮發成分後，用乙酸乙酯洗滌。剩餘物用幾份1%乙酸提取，過濾並使濾液凍幹。在十八烷基矽柱反相色譜上，用在2%磷酸或在20mM磷酸四甲基銨中的梯度乙腈作為洗脫液，反覆提純凍幹的產物，合併含有純化合物的餾分，通過乙酸鹽型的弱鹼性的離子交換樹脂過濾，凍幹濾液得到標題化合物。
MS(離子-噴霧)4160實施例2 [Lys(NE-異丙基)26.27]hPTH(1-34)NH2如實施例1裝配肽，但用Lys(Fmoc)使13位和Fmoc-Ser(tBu)在末端1位結合。
在室溫下，將完全裝配的肽樹脂用20ml 5%的苯硫酚的DMF溶液處理二次，每次1小時，並用DMF，甲醇和二氯甲烷洗滌。如實施例1中所述將乾燥的樹脂用液體HF處理。裂解的產物(350mg)懸浮於甲醇(5ml)，磷酸緩衝液pH＝5.0(5ml)，氰基硼氫化鈉(48mg)和丙酮(0.28ml)的混合物中，在RT下反應16小時後，過濾反應混合物並蒸發濾液。將剩餘物懸浮在20%-哌啶的DMF溶液中15分鐘，用20體積的醚稀釋並過濾。將剩餘物溶解在100ml水中，並加入乙酸到pH＝3，過濾並凍幹濾液，在十八烷基矽柱反相色譜上，用在2%磷酸中的梯度的乙腈作為洗脫液，純化凍乾物。合併含有純化合物的餾分，通過乙酸鹽型的弱鹼性的離子交換樹脂過濾，凍幹濾液得到標題化合物。
MS(離子-噴霧)4205.6。
實施例3Nα-異丙基[Lys(NE-異丙基)13.26.27]hPTH-(1-38)-OHa)固相肽合成在聚苯乙烯基的樹脂載體上，以分段的方法合成肽，用Fmoc保護α-氨基且側鏈的官能基團如下述被保護Asp(OtBu)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Lys(Boc)，Asn(Trt)，Gln(Trt)，Arg(Pmc)和Ser(tBu)。其它的胺基酸未被保護。
將酯化到4-羥甲基-苯氧甲基-和(聚苯乙烯-1%-聯乙烯基苯)的Fmoc-Gly，0.5mmol/g用作分段固相合成的起始產物，其中包括α-胺基酸去保護，洗滌，偶聯(新胺基酸的連接)和洗滌的重複的循環。採用DIPC使三至五倍過量的Fmoc-胺基酸偶聯成預製的HoBt-酯。用DIPC使Fmoc-Arg(Pmc)，Fmoc-Asn(Trt)和Fmoc-Gln(Trt)偶聯成對稱的酐。將肽鏈全部裝配後，用20%的哌啶/DMF除去Ser1的Fmoc-保護基。通過在室溫下用10%乙二硫醇，苯硫基甲醚，甲苯硫酚和水在90%TFA中的混合物處理肽樹脂三小時，從苯乙烯樹脂上的裂解出肽並且，除去側鏈上所有保護基。過濾樹脂顆粒並用一些TFA洗滌。通過加入醚，產物從合併的濾液中沉澱出，過濾並乾燥。在C-18矽柱色譜上，用梯度的乙腈的2%H3PO4/水溶液洗脫，純化產物。收集含有純化合物的組分，通過離子交換樹脂(Biorad，AG 4-X4，100-200目乙酸酯型)過濾，冷凍得到hPTH-(1-38)-OH。
b)烷基化將40mg(9μmol)hPTH-(1-38)-OH(4458.2g/mol)溶解於1.2ml甲醇，1.2ml磷酸緩衝液(Merck no.9887調節到pH5.0)，45mg(716mmol)NaBH3CN(62.84g/mol)和0.8ml(11mmol)丙酮(73.52ml/mol)。中在C-18矽膠上的反應通過RP-HPLC監控，在室溫下15小時後完成。用水稀釋反應混合物，且在C-18矽柱色譜上用梯度的乙腈的2%H3PO4/水溶液洗脫。收集含有該純化合物的餾分，用離子交換樹脂(乙酸酯型)過濾，凍幹得到作為聚乙酸酯，聚水合物的標題化合物。D＝-5.7°(c＝0.317在95%AcOH中)MS(離子-噴霧)4626實施例4Nα甲基[Ala1]PTH-(1-38)-OH如實施例3a中的相同方法裝配肽鏈，在1位代替Fmoc-Ser(tBu)-OH的非天然胺基酸Fmoc-Nα-甲基-Ala-OH與肽樹脂偶聯。如實施例3a中所述進行裂解，去保護和純化。
MS(離子噴霧)＝4455，91實施例5[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，Phe23，His25，His26Leu27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH採用與實施例3a相似的方法製備此肽。代替Fmoc-Gly酯化成4-羥甲基-苯氧甲基-共(聚苯乙烯-聯乙烯苯)所採用的相應的Fmoc-胺基酸，例如，Fmoc-Ala，Fmoc-Phe，Fmoc-D-Ala，Fmoc-D-Phe，等。附加的側鏈官能基團如下述被保護Thr(叔-丁基)，Trp(Boc)和Tyr(叔-丁基)。
採用相應的起始物，重複實施例3和5公開的方法，可以獲得下述化合物實施例6[Leu8，Asp10，Ala16，Gln18，Thr33]hPTH(1-34)OH實施例7[Ile1]hPTH(1-38)OH(IS-MS4484)實施例8[Ala1，Abu2]hPTH(1-38)OH(IS-MS4428)實施例9[Ala1，Nva2]hPTH(1-38)OH(IS-MS4442)實施例10[Ala1，Ile2]hPTH(1-38)OH(IS-MS4456)實施例11[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例12[N-MeAla1]hPTH(1-36)OH(IS-MS4286)實施例13[Ala1，Ala3，Leu8，Gln18]hPTH(1-36)OH(IS-MS4235)實施例14[Thr1]-hPTH-(1-38)OH(IS-MS4472)實施例15[Leu1]-hPTH-(1-38)OH(IS-MS4484)實施例16[Abu1]-hPTH-(1-38)OH(IS-MS4456)實施例17[Gaba1]-hPTH-(1-38)OH(IS-MS4456)實施例18[Leu8，Lys11，Gln18]hPTH(1-36)OH實施例19[Leu8，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Arg22]hPTH(1-36)OH(IS-MS4347)實施例20[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OH(IS-MS4007)實施例21[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS3906)實施例22[Leu8，Ala13，Gln18，Gln26，Phe27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例23Ip-[Leu8，Lys(Ip)13，Gln18，Lys(Ip)26，27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS4175)實施例24Ip-[Leu8，Ala13，Gln18，Gln26，Phe27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例25[Gln16]hPTH(1-38)OH實施例26[Ser14]hPTH(1-38)OH
實施例27[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His25，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例28[Ala1，Ala3，Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，Gln26，Phe27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例29[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS3965)實施例30[Leu8，Gln18，Ala29，Glu30，Ile31]hPTH(1-34)OH實施例31[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]hPTH(1-36)OH實施例32[Leu8，Asp10，Lys11，Ser14，Ile15，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19]hPTH(1-36)OH實施例33[Leu8，Asp10，Lys11，Leu18]hPTH(1-36)OH實施例34[Leu8，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19]hPTH(1-36)OH實施例35[Leu8，Asp10，Lys11，Ala17，Leu18]hPTH(1-36)OH(IS-MS4252)實施例36[Leu8，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例37[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS4022)實施例38[Leu8，Ala16，Asp17，Leu18，Ala19]hPTH(1-36)OH實施例39[Leu8，Asp10，Ala16，Asp17，Leu18，Ala19]hPTH(1-36)OH實施例40[Leu8，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例41[Leu8，Asp10，Lys11，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS4077)實施例42[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH(IS-MS4181)實施例43[Leu8，Ala16，Asp17，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH(IS-MS4193)實施例44[Leu8，Ala16，Ala17，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH(IS-MS4149)實施例45[Leu8，Ala17，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH實施例46[Leu8，Ala17，Gln18，Ala19，Arg22]hPTH(1-36)OH(IS-MS4219)實施例47[Leu8，Ala17，Gln18，Ala19，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS3960)
實施例48[Leu8，Gln18]hPTH(1-36)OH實施例49[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS3980)實施例50[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]hPTH(1-36)OH(IS-MS4240)實施例51[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH(IS-MS3923)實施例52[Leu8，Asp10，Ala16，Gln18]hPTH(1-36)OH(IS-MS4225)實施例53[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33]hPTH(1-34)OH(IS-MS3999)實施例54[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His26，Leu27，Thr33]hPTH(1-34)OH實施例55[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22]hPTH(1-36)OH實施例56[Ile15]hPTH(1-38)OH實施例57[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例58[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Arg19，His26，Leu27，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例59[Leu8，Ser13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22]hPTH(1-36)OH實施例60[Leu8，Ala13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg26，Arg27]hPTH(1-36)OH實施例61[Leu8，Gln13，Ala16，Gln18，Ala19，His26，Leu27，Arg33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例62[Leu8，Ala16，17，18，19]hPTH(1-36)OH實施例63[Leu8，Ala13，Ala16，Gln18，Ala19，Gln26，Phe27]hPTH(1-36)OH(IS-MS4127)實施例64Ip-[Leu8，Ala13，Ala16，Gln18，Ala19，Gln26，Phe27]hPTH(1-36)OH實施例65Ip-[Leu8，Lys(Ip)13，Ala16，Gln18，Ala19，Lys(Ip)26，27]hPTH(1-36)OH實施例66[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH(IS-MS4166)實施例67Ip-[Leu8，Lys(Ip)13，Ala16，Ala17，Ala18，Ala19，Lys(Ip)26，27]hPTH(1-36)OH
實施例68[Aib3，Gln18]hPTH(1-36)OH(IS-MS4283)實施例69Ip-[Leu8，Asp10，Lys(Ip)11，13，26，27，Gln18]hPTH(1-36)OH實施例70Ip-[Leu8，Ser13，Ala16，Gln18，Ala19，Arg22，Lys(Ip)26，27]hPTH(1-36)OH實施例71[Leu8，Tyr18]hPTH(1-36)OH實施例72[Ser33]-hPTH-(1-38)-OH實施例73[Thr33]-hPTH-(1-38)-OH實施例74[Leu33]-hPTH-(1-38)-OH實施例75[Gly33]-hPTH-(1-38)-OH實施例76[Leu8，His10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例77[Leu8，Gly10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例78[Leu8，Glu10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例79[Leu8，Thr10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例80[Leu8，Gln10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例81[Gln33]-hPTH-(1-38)-OH實施例82[Leu8，Tyr10，Gln18，Arg22，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH實施例83[1-amino-cyclopentane-1-carboxylicacid1，Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH實施例84[1-amino-cyclopentane-1-carboxylic acid1，Leu8，Ala13，16，Gln18，Ala19，Arg26，27]hPTH(1-36)OH實施例85[1-amino-cyclopentane-1-carboxylic acid3，Gln18]hPTH(1-36)OH(IS-MS4309)實施例86[Arg12]-hPTH-(1-38)-OH實施例87[Ser12]-hPTH-(1-38)-OH實施例88[Cys13]-hPTH-(1-38)-OH實施例89[Ile13]-hPTH-(1-38)-OH實施例90[Asn13]-hPTH-(1-38)-OH實施例91[Trp13]-hPTH-(1-38)-OH實施例92[Asp13]-hPTH-(1-38)-OH實施例93[Val13]-hPTH-(1-38)-OH實施例94[Thr13]-hPTH-(1-38)-OH實施例95[Ser13]-hPTH-(1-38)-OH
實施例96[Tyr13]-hPTH-(1-38)-OH實施例97[Met13]-hPTH-(1-38)-OH實施例98[Gln13]-hPTH-(1-38)-OH實施例99[Leu13]-hPTH-(1-38)-OH實施例100[Ala13]-hPTH-(1-38)-OH實施例101[Gly13]-hPTH-(1-38)-OH實施例102[Val14]-hPTH-(1-38)-OH實施例103[Ala14]-hPTH-(1-38)-OH實施例104[Lys14]-hPTH-(1-38)-OH實施例105[Arg14]-hPTH-(1-38)-OH實施例106[Thr14]-hPTH-(1-38)-OH實施例107[Ile14]-hPTH-(1-38)-OH實施例108[Tyr14]-hPTH-(1-38)-OH實施例109[Tyr15]-hPTH-(1-38)-OH實施例110[Arg15]-hPTH-(1-38)-OH實施例111[Val15]-hPTH-(1-38)-OH實施例112[Lys16]-hPTH-(1-38)-OH實施例113[Ser16]-hPTH-(1-38)-OH實施例114[Leu16]-hPTH-(1-38)-OH實施例115[Ala16]-hPTH-(1-38)-OH實施例116[Gly16]-hPTH-(1-38)-OH實施例117[Ala17]-hPTH-(1-38)-OH實施例118[Met17]-hPTH-(1-38)-OH實施例119[Ile17]-hPTH-(1-38)-OH實施例120[Ser19]-hPTH-(1-38)-OH實施例121[Lys19]-hPTH-(1-38)-OH實施例122[Leu19]-hPTH-(1-38)-OH實施例123[Ala19]-hPTH-(1-38)-OH實施例124[Tyr19]-hPTH-(1-38)-OH實施例125[Met19]-hPTH-(1-38)-OH實施例126[His19]-hPTH-(1-38)-OH實施例127[Val19]-hPTH-(1-38)-OH實施例128[Gly19]-hPTH-(1-38)-OH實施例129[Pro19]-hPTH-(1-38)-OH
實施例130[Asp19]-hPTH-(1-38)-OH實施例131[Ile19]-hPTH-(1-38)-OH實施例132[Val19，Gln24]-hPTH-(1-38)-OH實施例133[Arg19]-hPTH-(1-38)-OH實施例134[Phe20]-hPTH-(1-38)-OH實施例135[Ala21]-hPTH-(1-38)-OH實施例136[Gly21]-hPTH-(1-38)-OH實施例137[Phe21]-hPTH-(1-38)-OH實施例138[Leu21]-hPTH-(1-38)-OH實施例139[Asn21]-hPTH-(1-38)-OH實施例140[Gln21]-hPTH-(1-38)-OH實施例141[Ser21]-hPTH-(1-38)-OH實施例142[Gly22]-hPTH-(1-38)-OH實施例143[Leu22]-hPTH-(1-38)-OH實施例144[His22]-hPTH-(1-38)-OH實施例145[Ala22]-hPTH-(1-38)-OH實施例146[Ile22]-hPTH-(1-38)-OH實施例147[Val22]-hPTH-(1-38)-OH實施例148[Ser22]-hPTH-(1-38)-OH實施例149[Arg22]-hPTH-(1-38)-OH實施例150[Arg26]-hPTH-(1-38)-OH實施例151[Val27]-hPTH-(1-38)-OH實施例152[Ile27]-hPTH-(1-38)-OH實施例153[Leu27]-hPTH-(1-38)-OH實施例154[Arg27]-hPTH-(1-38)-OH實施例155[Ala27]-hPTH-(1-38)-OH實施例156[Val28]-hPTH-(1-38)-OH實施例157[Ile28]-hPTH-(1-38)-OH實施例158[Pro3，Thr33]-hPTH-(1-38)-OH實施例159[Arg33]-hPTH-(1-38)-OH實施例160[Pro33]-hPTH-(1-38)-OH實施例161[Asp33]-hPTH-(1-38)-OH實施例162[Ile33]-hPTH-(1-38)-OH實施例163[Lys33]-hPTH-(1-38)-OH
實施例164[Ile31，Arg33]-hPTH-(1-38)-OH實施例165[1-氨基環戊烷-1-羧酸1]hPTH-(1-36)NH2在聚苯乙烯基質的樹脂載體上，以分段的方法裝配肽。用Fmoc-基團保護α氨基側鏈的官能基團如下被保護Arg(Pmc)，Asn(Trt)，Asp(OtBu)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Lys(Boc)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)和Tyr(tBu)，其它胺基酸未被保護。
可製備的4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨基-甲基)苯氧-共(聚苯乙烯-聯乙烯苯)，0.4mmol/g，例如，如Tetrah.Letter，28，3787-3790(1980)中所述，進行下述循環步驟(1)至(5)的處理。
(1)DMF(2)哌啶(20%)的DMF溶液(3)DMF(4)HOBT，二異丙基碳化二亞胺，和Fmoc-氨基丙酸的混合物(每克起始樹脂各0.8mmol)(5)DMF洗滌和試劑的體積是每克起始樹脂5至20ml在下一個處理(1)至(5)的循環中，用Fmoc-纈氨酸代替Fmoc-氨基丙酸，而且如此進行各個循環使得，在樹脂上裝配標題化合物的正確的胺基酸序列。
按需要的次數重複各步驟使之完成該殘基的反應(步驟2，4)或完成從樹脂中置換先前的反應物(步驟3，5)。每個循環後除去樹脂樣品，並用茚三酮進行殘留氨基的比色試驗檢驗偶合反應的完成。
在結束合成的最後循環中，僅進行步驟(1)至(3)，並用2-丙醇，然後用甲醇和二氯甲烷(1∶1v/v)的混合物洗滌肽樹脂，在真空乾燥器中充分乾燥。
在室溫下將肽樹脂(1g)懸浮在三氟乙酸，水，和1.2-乙烷二硫醇(90∶5∶5v/v)的混合物(20ml)中2小時，過濾掉樹脂顆粒並用少量的TFA洗滌。加入乙醚(20體積)使產物從合併的濾液中沉澱出，過濾，用較高的乙醚洗滌並乾燥。將剩餘物溶於2%乙酸中，在凍幹前，使溶液在室溫下靜置8小時。凍乾物在C-18矽柱色譜上用梯度的乙腈的2%H3PO4溶液洗脫，用HPLS分析檢測各組分，收集含有純化合物的組分，用乙酸酯型陰離子交換樹脂過濾上述餾分，並凍幹得到如聚乙酸酯，多水合物的標題化合物。
例如，可如G.Valle等人，1988，在Can.J.Chem.662575-2582中所述，製備用於製備肽樹脂的中間體Fmoc-1-氨基環戊烷-1-羧酸。
MS(離子-噴霧)4312實施例166[1-(1-氨基環丙烷-1-羧酸)]hPTH(1-36)NH2採用相似於實施例165的方法製備上述肽。例如，可如M.Crisma等人(1989)在Int.J.Biol.Macromol.11345-352中所述，製備用於製備肽樹脂的中間體Fmoc-1-氨基環丙烷-1-羧酸。MS(Ion-Spray)4283。
採用相應的起始物，重複實施例165描述的方法，可以獲得下述化合物實施例167[D-Pro1]hPTH(1-36)NH2實施例168[Nva1]hPTH(1-36)NH2實施例169[N-Me-Ser1]hPTH(1-36)NH2實施例170[Indole-2-carboxylic acid1]hPTH(1-36)NH2實施例171[Indole-3-carboxylic acid1]hPTH(1-36)NH2實施例172[Pyridine-3-carboxylic acid1]hPTH(1-36)NH2實施例173[Pyridine-2-carboxylic acid1]hPTH(1-36)NH2實施例174[Hexahydropyridazine-3-carboxylic acid1]hPTH(1-36)NH2實施例175[Morpholine-2-carboxylic acid1]hPTH(1-36)NH2實施例176[Pro1]hPTH(1-36)NH2實施例177[Leu1]hPTH(1-36)NH2實施例178[Ile1]hPTH(1-36)NH2實施例179[Thr33，Ala34]hPTH(1-34)NH2實施例180[Nva8]hPTH(1-36)NH2實施例181[Gln18]hPTH(1-36)NH2實施例182[Tyr18]hPTH(1-36)NH2實施例183[Lys18]hPTH(1-36)NH2實施例184[Ala18]hPTH(1-36)NH2實施例185[Phe23，His25，His26，Leu27]-hPTH(1-34)NH2實施例186[Phe23]-hPTH(1-36)NH2(IS-MS4247)
實施例187[Phe23，His25，His26，Leu27，Ile28，Ala29，Glu30，Ile31，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)NH2(IS-MS3934)實施例188[Ala29]-hPTH(1-36)NH2(IS-MS4248)實施例189[Ala34]-hPTH(1-36)NH2(IS-MS4210)實施例190[Gln25]hPTH(1-36)NH2實施例191[Leu8，Asp10，Lys11，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)NH2實施例192[Ala1，His5，Leu8，Asp10，Lys11，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)NH2實施例193[Ser14，Ile15，Gln16，Asp17，Leu18，Arg19，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)NH2實施例194[D-Phe34，D-Ala36]hPTH(1-36)-NH2[MS(IS)4290]實施例195[Ala3]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4271]實施例196[D-Ser3]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4290]實施例197[D-Glu4]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4290]實施例198[D-His9]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4286]實施例199[Ala10]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4243]實施例200[D-Asn10]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例201[Ala12]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4299]實施例202[Gln13]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4287]實施例203[His13]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4296]實施例204[Leu13]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4371]實施例205[Ala13]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4228]實施例206[Ala13，Gln26，Phe27，D-Phe34，D-Ala36]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4249]實施例207[Ala14]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4219]實施例208[D-His14]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例209[D-Asn16]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4284]實施例210[Ala17]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4270]實施例211[D-Ser17]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例212[Ala19]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4228]實施例213[D-Glu19]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例214[Ala21]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4257]實施例215[Ala22]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4227]實施例216[Gln26]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4287]
實施例217[Nle26]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4271]實施例218[D-Lys26]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例219[Nle8，18，27]hPTH(1-36)NH2實施例220[His27]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4294]實施例221[Phe27]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4304]實施例222[Nle27]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4271]實施例223[Asn27]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4271]實施例224[Ala27]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4228]實施例225[D-Gln29]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4289]實施例226[D-Asp30]hPTH(1-34)NH2[MS(IS)4118]實施例227[Ala30]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4241]實施例228[D-Val31]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4290]實施例229[Ala31]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4258]實施例230[Lys32]hPTH(1-34)NH2[MS(IS)3832]實施例231[D-His32]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例232[Ala32]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4219]實施例233[D-Asn33]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4288]實施例234[Ala33]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4210]實施例235[NMePhe34]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4301]實施例236[D-Asp30]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4290]實施例237Ip-[Nle8，18，Lys(Ip)13，26，27，D-Asn33，D-Phe34]hPTH(1-34)NH2實施例238Ip-[Nle8，18，27，Lys(Ip)13，26]hPTH(1-36)NH2實施例239[Nle8，18，D-Asn33，D-Phe34]hPTH(1-34)NH2[MS(IS)4080]實施例240[Lys(Ip)13]hPTH(1-36)NH2[MS(IS)4331]實施例241Propargyl-[A1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例242[Ala0]-hPTH-(1-36)-NH2實施例243[Pro0]-hPTH-(1-36)-NH2實施例244Acetyl-hPTH-(1-36)-NH2實施例245[HyPro1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例246N-Dimethyl-[Ala1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例247[D-Ser1]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例248[Lys(For)1]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4356]
實施例249[D-Glyceric acid1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例250[Asn1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例251[4-Aminobenzoic acid1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例252[4-Aminosalicylic acid1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例253[TMSA1]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4343]實施例254[Phe1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例255[Propargylglycin1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例256[Ala1，His5，Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Phe22，Phe23，His25，His26，Leu27，Thr33，Ala34]-hPTH-(1-34)-NH2實施例257[Abu2]-hPTH-(1-36)-NH2實施例258[D-Val2]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例259[tert.Leu2]-hPTH-(1-36)-NH2實施例260[Ala1]-hPTH-(1-36)-NH2實施例261[D-Ile5]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例262[D-Gln6]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例263[D-Leu7]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例264[Nle8]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4268]實施例265[Phe8]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4303]實施例266[Cha8]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4309]實施例267[Leu8]-hPTH-(1-38)-NH2實施例268[D-Leu11]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4287]實施例269[Ala11]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4244]實施例270[D-Lys13]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例271[D-Leu15]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例272[Ala15]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4243]實施例273[Ala16]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4243]實施例274[Met(O2)18]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4320]實施例275[Nle18]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4268]實施例276[D-Met18]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例277[Lys20]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4259]實施例278[D-Arg20]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例279[D-Val21]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例280[Trp(SO2Pmc)23]-hPTH-(1-38)-NH2[MS(IS)4723]實施例281[Trp(Pmc)23]-hPTH-(1-38)-NH2[MS(IS)4660]
實施例282[D-Trp23]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例283[Ala23]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4171]實施例284[D-Leu24]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例285[Phe25]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4277]實施例286[Lys25]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4258]實施例287[Ala25]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4201]實施例288[Ala26]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4229]實施例289[Lys26/27(For)]-hPTH-(1-34)-NH2實施例290[D-Lys27]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例291[D-Leu28]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例292[D-Phe34]-hPTH-(1-36)-NH2[MS(IS)4288]實施例293[D-Val35]-hPTH-(1-36)-NH2實施例294[Ala35]-hPTH-(1-36)-NH2實施例295[Pro35]-hPTH-(1-36)-NH2實施例296[NMeVal35]-hPTH-(1-36)-NH2實施例297[Thr35，Ala36]-hPTH-(1-36)-NH2實施例298[D-Ala36]-hPTH-(1-36)-NH2實施例299[NMeAla36]-hPTH-(1-36)-NH2實施例300(5-氨基-4-氟-2-異丙基)-己-3-烯醯-hPTH(3-36)NH2a)hPTH-(3-36)-NH-樹脂的製備採用相似於實施例165中的方法製備此中間體。
b)[(5-氨基-4-氟-2-異丙基)-己-3-烯醯]hPTH(3-36)-醯胺。
用DMF處理上述a)中得到204.6mg Fmoc-hPTH(3-36)-NH-樹脂5分鐘。然後用異丙醇和DMF洗滌幾次。用DMF/哌啶8∶2處理10分鐘，以除去Fmoc-保護基。在0.7ml DMF中，將去保護的PTH-片段，38.1mg的4-氟-2-異丙基-5-叔-丁氧羧基氨基-己-3-烯酸，68.7mg苯並三唑-1-基氧三(吡咯烷)磷鎓六氟磷酸鹽(PyBOP)和26.6mg4-甲基嗎啉振蕩80分鐘。用異丙醇和DMF洗滌幾次後，用4.5ml TFA/0.25ml水/0.25乙烷二硫醇處理固體剩餘物55分鐘。然後過濾混合物，加入二乙醚使標題化合物從所剩溶液中沉澱出。用製備HPLC(Vydac柱，梯度A＝水，B＝7乙腈/3水/0.2磷酸)純化標題化合物。
MS(離子-噴霧)質量4272[α]Hg365nm＝-66.8°(C＝0.25在95%ACOH中)實施例3014-氟-2-異丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸酯a)(s)-3(1-氧(4-氟-3-羥基-2-異丙基)己-4-烯基)-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮採用相似於D.A.Evans等人，Org.Synth.68，1990所述的方法，以(s)-3-(1-氧異丙基)-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮和2-氟-丁-2-烯醇起始製備標題化合物。
MS(FAB)MH+350b)(s)-3-(1-氧代(4-氟-3-O-(2，2，2-三氯乙烷亞胺)-2-異丙基)己-4-烯基)-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮將1.5g實施例301a)化合物溶於6ml DCM中。在0°加入0.0958ml 1.8-二氮雜雙環(5，4，0)十一-7-烯(DBU)。在0℃向此溶液滴加入0.475ml三氟乙腈的2ml DCM溶液。一小時後蒸發反應混合物，剩餘物用矽膠柱色譜(己烷/乙醚2∶1)純化。MS(FAB)MH+493c)(s)-3-(1-氧化(4-氟-5-N-2，2，2-三氟乙醯基氨基-2-異丙基)己-3-烯基)-4-苯基甲基-2-噁唑烷酮將2g化合物301(b)溶於150ml鄰-二甲苯中，並在160°攪拌3小時，然後除去鄰-二甲苯，剩餘物在矽膠柱色譜(甲苯/乙酸乙酯98∶2)上純化。
MS(FAB)MH+493d)4-氟-5-N-2，2，2-三氯乙醯基氨基-2-異丙基-己-3-烯酸採用相似於D.A.Evans等人Org.Synth.68 1990所述的方法，以化合物301c)為起始物製備標題化合物。
MS(FAB)MH+335e)5-氨基-4-氟-2-異丙基-己-3-烯酸將899mg的化合物301d)溶於20ml乙醇中，加入13.5ml 6N的氫氧化鈉溶液。在室溫下攪拌此混合物20小時。除去乙醇，剩下的液體組分用2N HCl酸化到pH＝2，並用正-丁醇撮。蒸發提取物，剩餘物通過矽膠(DCM/甲醇1∶1)過濾，由此獲得純的標題化合物。
MS(FAB)MH+190f)4-氟-2-異丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸將0.56g化合物301e)溶於12ml水中並加入1.5g碳酸鈉。對此溶液加入溶於12ml四氫呋喃的0.4g二叔丁基碳酸酯。在室溫下攪拌此混合物18小時。然後加入50ml正-丁醇和50ml水，並在劇烈攪拌下加入1N HCl直至pH＝2。蒸發有組分，剩餘物用矽膠柱色譜(己烷/丙酮1∶2)提純。
MS(FAB)MH+290[α]D＝-61.3°(1%在甲醇中)重複上述方法，並用相應的起始物製備下述化合物4-氟-2-甲基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸4-氯-2-甲基-5-叔丁氧羰基氨基己-3-烯酸4-氟-2-苯甲基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸4-氯-2-異丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸4-甲基-2-異丙基-5-叔丁氧羰基氨基-己-3-烯酸實施例302採用上述實施例300的方法，但用適當的起始物可製備下述化合物-(5-氨基-4-氟-2-甲基)-己-3-烯醯基-hPTH(3-36)醯胺MS(離子-噴霧)質量4245-(5-氨基-4-氯-2-甲基)-己-3-烯醯基-hPTH(3-36)醯胺MS(離子-噴霧)質量4260-(5-氨基-4-氟-2-苯甲基)-己-3-烯醯基-hPTH(3-36)醯胺MS(離子-噴霧)質量4320-(5-氨基-4-氯-2-異丙基)-己-3-烯醯基-hPTH(3-36)醯胺
MS(離子-噴霧)質量4289-(5-氨基-4-甲基-2-異丙基)-己-3-烯醯基-hPTH(3-36)醯胺MS(離子-噴霧)質量4269實施例303採用上述實施例300的方法，但用適當的起始物，可製備下述化合物a)(5-氨基-3-氮雜-2-異丙基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4257]使用的起始物(4-氮雜-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸b)(5-氨基-3-氮雜-3-N-乙醯基-2-異丙基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4299]使用的起始物(4-氮雜-4-N-乙醯基-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)己酸c)(5-氨基-3-氮雜-3-N-乙醯基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4257]使用的起始物(4-氮雜-4-N-乙醯基-2-叔丁氧羰基氨基)-己酸d)(5-甲基氨基-3-氮雜-2-異丙基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4271]使用的起始物[4-氮雜-2-(N-叔丁氧羰基，N-甲基氨基)-5-異丙基]-己酸e)(5-甲基氨基-3-氮雜-3-N-甲基-2-異丙基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4285]使用的起始物[4-氮雜-4-N-甲基-2-(N-叔丁氧羰基氨基，N-甲基氨基)-5-異丙基]-己酸f)(5-氨基-3-氮雜-3-N-甲基-2-異丙基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4271]使用的起始物(4-氮雜-4-N-甲基-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸g)(5-氨基-3-氮雜-3-N-並丙基)-己醯基-hPTH(3-36)-醯胺[MS(離子-噴霧)4257]使用的起始物(4-氮雜-4-N-異丙基-2-叔-丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸h)[1-環戊烷-1-氨基-1-羧酸(psi CH2-NH)-Val2]-hPTH(1-36)-醯胺，採用1-環戊烷-1-叔丁氧羰基氨基-1-羧酸(psi CH2-NH)-Val-OH作為起始物實施例304採用上述實施例3a)的方法，但用相應的起始物，可製備下述化合物(5-氨基-3-氮雜-2-異丙基)-己醯基-[Leu8，Ala6，Gln18，Ala19)hPTH(3-36)OH[MS(離子-噴霧)4135]使用的起始物(4-氮雜-2-叔-丁氧羰基氨基)-己酸實施例305(4-氮雜-4-N-乙醯基-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸a)甲基(4-氮雜-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基7-己酸用Lawesson-試劑(S.-O.Lawesson，等人，Tetrahedron1981，37，3635)處理Boc-Ala-Val-OMe.然後根據F.S.Guziec等人THL，1991，23-26所述的方法，還原所得的內硫肽。
MS(EI)MH+289b)(4-氮雜-4-N-乙醯基-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)己酸甲基酯將264mg的化合物305a)溶於5ml DCM然後加入0.14ml三乙基胺和0.072ml乙醯氯，在40°攪拌此混合物24小時。加入50ml DCM後，用水洗滌溶液兩次。乾燥有機組分並蒸發。然後將獲得的標題化合物用柱色譜(己烷/乙酸乙酯4∶1)純化。
MS(EI)M+330c)(4-氮雜-4-N-乙醯基-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸將356mg化合物305b)溶於4ml甲醇/水3∶1中，加入53mg氫氧化鋰。在60°攪拌此混合物二小時。然後加入25ml DCM並在劇烈攪拌下加入1N HCl直至pH＝2。分離有機組分，乾燥並蒸發，由此獲得純化的標題化合物。
MS(FAB)MH+317重複此方法，但採用合適的起始物，獲得下述化合物(4-氮雜-4-N-乙醯基-2-叔丁氧羰基氨基)己酸(4-氮雜-2-叔丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸[4-氮雜-2-(N-叔-丁氧羰基，N-甲基氨基)-5-異丙基]-己酸(4-氮雜-4-N-甲基-2-叔-丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸(4-氮雜-4-N-異丙基-2-叔-丁氧羰基氨基-5-異丙基)-己酸(4-氮雜-2-叔-丁氧羰基氨基)-己酸實施例1至300和302至304的化合物，在胺基酸定量分析中，顯示出正確的胺基酸比例。
下述的實施例說明了本發明的重組方法，如果不另外指明，採用Ausubel等人;在1991;Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York中所描述的常規方法實施例306克隆噬菌體T4基因55兩個DNA片段，一個含有噬菌體T4基因55的全部編碼序列，另一個編碼了它的一部分，用純化的T4DNA作為模版，通過聚合醯鏈反應(PCR)使它們擴展。用含有NdeI或BamHI核內切酶識別序列的寡核苷酸作引物。用模版和100pM的上遊引物(GAGGTGCATACC TGTCAGAAAC TAAGCCT27,NdeI識別位點由它的核苷酸7-12提供)和100pM的下遊引物(GGYCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC 40,BamHI的識別位點由核苷酸5-10提供)在100μl反應緩衝液中，該緩衝液含有10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2分別0.2mM的dATP，dCTP，dGTP，dTTP，和0.1%Triton×100，pH為9.0進行PCR反應(25次循環，各為30″94℃，30″50°，30″72℃)獲得0.6kb的段。基因55的平頭形式是通過正如製備全部基因所描述的PCR法製備的，除了採用不同的寡核苷酸作為下遊引物(GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT 28,BamHI識別位點由它的核苷酸5-10提供)。獲得0.35kb的片段。0.6kb和0.35kb DNA片段用限制性核酸內切酶NdeI/BamHI消化，並克隆到NdeI/BamHI，消化的表達載體pET17B(從Novagen獲得)中。0.6kb DNA片段編碼了全部的gp55蛋白質(188胺基酸殘基-見圖1)，而0.35kb片段編碼了gp55的12kD胺基酸末端片段(112胺基酸殘基-見圖2)。
實施例307編碼PTH(1-38)DNA的製備的克隆通過PCR，採用克隆合成的PTH(1-38)編碼序列作模版，生成了編碼了a)相應於圖1的胺基酸殘基110-115和PTH(1-38)的連接子肽，或b)相應於圖2的胺基酸186-191和PTH(1-38)的連接子肽的DNA片段。把編碼連接子a)寡核苷酸(GAGTGGATCC ATCGATCCACCATCCGTATC AGAAATACAA CT 42)，或編碼連接子b)的寡核苷酸(GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT42作為上遊引物。下遊引物TCTACTCGAG TTAACCCAGA GCTACAAAAT TATG34。每個上遊引物與一個BamHI克隆位點結合且下遊引物含有XhoI識別位點(每個序列的核苷酸5-10)。如實施例306所述的相同條件下進行PCR反應。用BamHI和XhoI裂解後，將0.14kb PCR產生插入到BamHI-XhoI消化的gp55-pET17B質粒中，獲得實施例306。
為了表達該融合蛋白質，所得質粒構建體轉化到大腸桿菌E.ColiBL21(DE3)LysE中且單獨的細菌克隆進一步繁殖。在37℃在一個旋轉振蕩器上，在周期生長介質(Bio 101)中培養一種預培養物過夜，獲得該融合蛋白的表達。用主培養體積的1-5%產生的預培養物來接種主培養物。然後在37℃溫度，和pH6.9至7.1下，同時以101/min充氣並在200-400rpm攪拌下發酵主培養物。當培養物OD550達到大約1.0至5.0時，加入1mM IPTG誘發表達。誘發後發酵作用繼續大約五小時，且然後不殺死大腸桿菌E.cdi細胞，收穫發酵肉湯。用管離心使收穫的細胞族轉沉下，再懸浮在樣品緩衝液中，用SDS PAGE測定表達。然後冷凍細胞沉澱物，直到純化。此方法和採用的宿主細胞全部在Studier等人;1990;「應用T7RNA聚合酶使克隆的基因直接表達」，Methods in Enzymology，Academic Press，60至89頁中描述。
實施例308內含體的製備將從實施例307獲得的冷凍的大腸桿菌E.coli沉澱再次懸浮到25% w/v緩衝液A(50mM Tris pH8.0;含有2mM DTT，5mM苯甲脒-HCl，1.5mM MgCl2，1.0mM MnCl2，10μg/ml DNA酶和2mg/ml溶菌酶)中並在室溫下伴隨攪拌混合1小時。該再次懸浮的細胞通過Manton-Gaulin均漿器(在1200bar通過2次)溶解並將所得的溶胞產物保持在冰中。用冰-冷卻的緩衝液B(50mM Tris pH8.0;含有2mM DTT，5mM苯甲脒-HCl和4mM EDTA)使溶胞產物稀釋2倍，並在27，500g離心30min。
細心除去離心的上清液並丟棄。沉澱物再次懸浮在25%w/v的緩衝液B中，如前述再次通過Manton-Gaulin並離心。用緩衝液B重複此過程一次並用水重複一次。稱重所得內含體沉澱物並冷凍到-20℃待用。
實施例309gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)hPTH內含體的溶解和裂解在實施例308獲得的含有gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)hPTH的冷凍內含體懸浮於10mM HCl酸性溶液(分析純)中，直至最後濃度為6%w/v。在50℃溫育溶液24小時，加入1體積100mM NaOAc水溶液使反應終止。在27，500g離心30分鐘使稀釋的上清液澄清並通過玻璃纖維濾器過濾。
實施例310gp55-Asn-Gly-Pro-(1-38)hPTH內含體的溶解和裂解如實施例308獲得的含有gp55-Asn-Gly-Pro-(1-38)hPTH冷凍內含體溶於6M胍-HCl(含有2M羥胺-HCl並通過加入4.5M LiOH使pH升至9.0)中，得到大約5mg/ml蛋白質。通過進一步加入LiOH使pH再調整至pH9，並在45℃保溫溶液4小時。加入甲酸至pH4使反應中止，如實施例309所述使溶液離心並過濾。
實施例311Gly-Pro和Pro-Pro(1-38)hPTH的製備HPLC在分析反相HPLC(Orpogen HD-膠-RP-7s-300;4×150mm柱)上分析過濾的裂解物的上清液，並與已知(1-38)hPTH標準(Ba chem)比較以確定PTH濃度。柱用85%HPLC緩衝液A(90%水，10%乙腈;含0.1%v/v TFA)和15% HPLC緩衝液B(10%水，90%乙腈，含0.1%TFA)平衡並用15%HPLC緩衝液B至100%HPLC緩衝液的梯度，以流速為0.75ml/min，用超過15分鐘的時間進行洗脫。
根據製劑的標準，上清液既可裝入1.0×25cm C4Vydac或裝入2.2×25cm C4Vydac。分別在流速4ml/min和10ml/min，用85%HPLC緩衝液A和15%HPLC緩衝液B平衡柱。分別用超過80ml的15%B至85%B和超過300ml的15%B至55%B對柱進行梯度洗脫。
手工收集Gly-Pro-hPTH(1-38)或Pro-Pro-hPTH(1-38)峰，然後在真空下除去乙腈，用分析HPLC確定裂解後和在收集組分中的肽濃度。
將除去溶劑的肽溶液用等體積的100mM乙酸鈉稀釋並調節pH，如果需要，調節至pH5.4，接著過濾(0.2μm)，將溶液裝入陰離子交換柱(或單s或sp-瓊脂糖高效，分別裝入HR10/10或XK16/10柱)用50mM乙酸鈉pH5.4(緩衝液C)平衡。用超過7.5柱體積的0至500mM NaCl梯度的緩衝液C進行柱洗脫。收集10ml組分併集中X-X-(1-38)hPTH峰，(如前述用HPLC確定肽濃度。
此柱適用於將肽交換到多種生理緩衝液中，且適用於除去融合蛋白質本身化學裂解生成的附加肽。
實施例312從X-X-(1-38)hPTH上酶脫除去XX將實施例311中獲得的集中的肽餾分(濃度範圍1.5-2.5mg/ml)通過加入固體Tris使pH為8。加入純化的脯氨醯基二肽酶(在PBSpH7.2中0.5mg/ml)(Nardi等人(1991)App.Env.Microbiol，57，No.1，40-50)至1∶1000，並把溶液在37℃溫育24h。加入TFA(pH＝5.0)至0.2%使反應終止，且所得產物(1-38)hPTH用製備HPLC分離(採用如實施例311所述的相同條件)。且除去等分的N-末端序列後除去溶劑凍幹，光譜分析質量。
採用相似如上所述方法，採用兩個融合蛋白質所獲得的產量實施例如下Gen55-Asp-Pro-Pro-(1-38)PTH(用平截形的Gen55)在部分最適發酵條件下，從10升發酵物中獲得215g溼細胞沉澱物。融合蛋白質的百分表達水平為大約37%，從此沉澱物中，分離出31g的內含體。這些內含體蛋白質純度(著眼於融合蛋白體)為61%。溶解，裂解和離心/過濾後，檢測得大約620mg的Pro-Pro-PTH。繼C4-Vydac HPLC之後，該物質產生580mg Pro-Pro-PTH，將其稀釋，在Monos上離子交換，用X-脯氨醯基二肽酶(在Pro-Pro-PTH的濃度為2mg/ml)消化，HPLC和凍幹後，獲得440mg具有全部生理活性的凍幹純產物，停止裂解步驟和最終產物之間的產率為71%。
Gen55-Asn-Gly-Oro-(1-38)PTH(用「長」型的Gen55)從20升非最優的發酵物中，收穫得具有50%融合蛋白質表達的78g溼細胞沉澱物，隨後溶胞並離心，獲得18g「90%純」的內含體。接著用酸終此步驟並離心/過濾，測得大約470mg Gly-Pro-PTH.在C4-Vydac上HPLC後，測得355mg肽，sp-瓊酯糖離子-交換後，減少到321mg。在2mg/ml進行酶促除去Gly和Pro殘基。最後的HPLC步驟和凍幹後，獲得244mg純的，具有全部生理活性的(1-38)PTH，從停止裂解反應步驟表示的產率為52%。
採用實施例306至312的方法，還可製備實施例25，26，56和86至164的化合物。
以游離形式或以適於藥用的鹽形式的本發明化合物和絡合物，正如動物實驗顯示的具有有價值的藥物學活性，且因之表現出療效。
根據Marcus和Aurbach在Endocrinology，85，801-810(1969)的方法，通過在離體測定本發明化合物在UMR106-06小鼠和SaOS-2人體骨肉瘤細胞中刺激環AMP合成的能力，來評價它們的生物活性。在12孔盤的Eagle′s最少量必需介質-10%FCS中使小鼠骨肉瘤UMR106細胞生長至融合。使人體SaOS-2骨肉瘤細胞在McCoy′s5A介質-10%FCS中生長。然後將此介質轉換成2%FCS的介質，並加入1-5μCi/孔[3H]-腺嘌呤，兩小時後，細胞用無血清介質洗滌二次，並在含有1mM-3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的DMEM-1%BSA中保溫。以排除在磷酸二酶中的作用，20分鐘後加入供試底物，15分鐘後通過加入冰冷卻的5%三氟乙酸使反應停止，並提取cAMP。加入含有5mM的未示蹤腺嘌呤，腺苷，AMP，ADP，ATP，和cAMP以及0.4μCi[14c]-腺苷的載體溶液(0.5ml/孔)以測定回收率。用系列的Dowex 50W-X4(200-400目)和氧化鋁色譜分離[3H]-cAMP並計數。以對照溶劑的%計算結果，並從DRC曲線上確定EC50值。在10-11至10-6M的濃度本發明化合物能夠刺激UMR106-06小鼠和SaOS-2人骨肉瘤細胞中產生cAMP。
本發明化合物還具有對PTH受體結合親合力，例如，如下述用乳過氧化物酶方法(Anawa Lab，AG，Wangen)將雞[Tyr36]PTHrP(1-36)醯胺磺化成2，200Ci/mmol的特異性。用含有1%BSA的200μl DMEM和HAM′sF12(1∶1)衝洗單層的腎細胞，並在16℃與存在或不存在1μM[Tyr1]chPTHrP(1-36)醯胺的每孔50.000cpm的[125I-Tyr36]chPTHrP(1-36)醯胺培育。培育後，用0.5ml介質(4℃)衝洗細胞，用0.5ml 1N NaOH使細胞溶解並測定放射性。特異結合被定義為總結合減非特性結合。採用SCTFIT，一種非線性回歸電腦程式(Feyen等人，1992，Biochem，Biophys，Res，Commun.1978-13)分析競爭內線且數據用平均pKD值(n＝2至3)表示，在本試驗中本發明化合物結合親合性的平均pKD值為7至10。
進一步的，連續皮下注入後，本發明化合物可提高血漿鈣水平，例如，測定甲狀腺甲狀旁腺切除的140至170g雄性威斯特鼠在甲狀腺甲狀旁腺切除5天後，用Alzet小泵植入鼠頸，以0.3至30μg/天/鼠的量輸入供試化合物。在此後1，2，3和6天後的早晨後眶刺孔引出血液，且通過光度計測定血漿鈣濃度，在本實驗中本發明化合物提高了血鈣濃度。
因此本發明化合物表現出預防或治療與鈣增加衰竭或吸收作用有關的，或需要鈣固定在骨骼中的骨骼疾病，例如多種發生性(例如，由老齡或由皮質類固醇治療或失活引起的少年性，絕經，絕經後，創傷後。)骨質疏鬆症，骨皙，包括與骨骼去礦質作用有關的急性和慢性骨病，骨軟化，由關節炎或骨關節炎引起的牙周骨喪失，或用於治療甲狀旁腺機能減退。
本發明化合物特別適應於預防或治療多種發生性骨質疏構症。
在上述所有用途中，本發明化合物適用的每日劑量範圍在大約0.003至大約10mg，優選0.003至3，更優選0.01至1mg。本發明化合物每天一次或一周內二次給藥。
本發明化合物可以游離形式或以藥用可接受的鹽形式或配合物給藥。上述鹽和配合物可以按常規方法製備且具有如游離化合物相同等級的活性。本發明還提供了含有以游離鹼形式或藥用可接受的鹽形式或配合物形式的本發明化合物，以及有關的藥用可接受的稀釋劑或載體的藥用組合物。上述組合物可以常規方法配製。本發明化合物可以任何常規途徑給藥，例如以注射溶液或懸浮液形式腸胃外的途徑，胃腸途徑，例如口服，例如以片或膠囊形式或以透皮吸收的，鼻的或栓劑的形式給藥。
根據如前面所述，本發明進一步提供了a)用作藥物的本發明化合物或藥用的鹽或它們的配合物。
b)促進骨形成的方法，例如預防或治療與鈣增加衰竭或吸收作用有關的，或需要鈣固定在骨骼中的所有的骨骼疾病，例如多發性(例如，由老齡或由皮質類固醇治療或失活引起的少年性，絕經，絕經後，齒具備後)骨位疏鬆症，骨折，包括與骨骼去礦質作用有關的急性和慢性骨病，骨軟化，由關節炎或骨關節炎引起的牙周骨喪失或骨喪失，或用於治療甲狀旁腺機能減退，該方法包括對所述的患者施用有效量的本發明化合物或藥用的鹽或它們的配合物;
c)用於製備上述方法b)中的藥用組合物的本發明化合物或其藥用的鹽或配合物。
本發明進一步的實施例，本發明的化合物可以作為其它治療的附加物或助劑，例如使用骨吸收抑制劑的治療，例如骨質疏鬆症的治療，特別是使用例如鮭，鰻類或人體降鈣素的降鈣素或它的類似衍生物的治療，例如雌激素，部分雌激素激動劑或雌激素-孕激素結合物的類固醇激素、磷酸氫鹽、維生素D或它的類似物，或它們的任何組合。
與本發明化合物結合給藥時，例如作為骨吸收抑制治療助劑，聯合給藥的抑制劑的藥劑當然地取決於使用的抑制劑藥物的類型，例如是否是類固醇或降鈣素，治療的條件，是否作為醫療或預防性的治療，食物療法等等而變化。
根據前述的本發明進一步提供的方法為d)促進骨形成的方法，例如預防或治療鈣缺失，例如預防和治療本文前述的任何具體症狀或疾病，在需要上述治療的患者中，該方法包括對所述患者給藥有效量的a)本發明化合物和b)第二種藥物，所述第二種藥物是例如如前述指示的骨吸收抑制劑。
實施例20，29，37，49和50的化合物是優選的。





權利要求
1.一種具有PTH樣活性的並含有至少一種修飾的以游離形式或鹽的形式或配合物形式的PTH化合物，所說修飾或者為(1).至少一個選自L-或D-α-胺基酸、C2-6烷氧基羰基和取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與該PTH化合物末端氨基相連的基團，和/或至少一個選自C2-6烷氧基羰基和取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與一個或多個PTH化合物側鏈氨基相連的基團，或者為(2).在天然產生的PTH序列的1到38位中的至少一個α-胺基酸單位以保護的形式隨意地被天然或非天然的胺基酸單位置換或未置換，藉此，存在於PTH序列氨基末端的1和2位中的胺基酸單位一起可被一種假肽所置換，或者為一種這些修飾的組合，先決條件當該PTH化合物從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸或從C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，C2-8炔基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，不為一種具有天然存在的α-胺基酸序列的PTH化合物；或者該PTH化合物不為這樣的PTH(1-34)其中i.在1位的α-胺基酸為Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr；或ii.在2位的α-胺基酸為Ala，D-Val，Lys，Arg或Cit且在34位的α-胺基酸為Tyr；或在2位的α-胺基酸為D-Val且在34位的α-胺基酸為D-Tyr和可選擇地8位和18位α-胺基酸可以各自為Nle；或iii.在3位和/或6位和或9位的α-胺基酸被天然或非天然胺基酸置換；或iv.在23位的α-胺基酸被Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置換；或v.在25位和/或26位和/或27位的α-胺基酸被Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置換；或vi.在8位和18位的α-胺基酸各自為Nle或各自為Met(o)且在34位的α-胺基酸可以為Nle且在34位的α-胺基酸為Tyr和或有12位α-胺基酸為L或D-Pro，L-或D-Ala，Aib或NMeGly或者23位的α-胺基酸為Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或β-Nal；或vii.在28位的α-胺基酸為Lys且在30位的α-胺基酸為Leu；或viii.在1位的α胺基酸為Aib；和/或在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp；和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr；和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Nal，D-Ser，D-ser(丁基)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys (Fmoc)，D-Phe或D-Asn；和/或在13位的α-胺基酸為Leu；和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His；種或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp；和/或在25位的和/或在26位的α-胺基酸為His；和/或在27位的α-胺基酸為Gln或Leu；或ix.在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala或Ser，或在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp且在34位的α-胺基酸為Tyr；或該PTH化合物不為PTH(1-84)，其中i.在1位的α-胺基酸為Tyr，Val，Pro，Asp或Cys；或ii.在2位的α-胺基酸為Ala，Glu，Leu，Ser或Arg；或iii.在3位和/或6位和或9位的α-胺基酸被一種天然或非天然胺基酸置換；或iv.在23位的α-胺基酸被Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Pro，Ser或Thr置換；或v.在25和或26和/或27位的α-胺基酸被Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val置換；或vi.在8位的α-胺基酸為Met，Met(o)，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly且在18位的α-胺基酸為Leu；或在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala，Val，Leu，Ile，Ser或Trp，且在34位的α-胺基酸可以為Tyr；或在8位和18位的α-胺基酸各自為Met(o)；或在8位的α-胺基酸為Leu且在18位的α-胺基酸為Met(o)；或vii.在26位的α-胺基酸為Gln；該化合物不為ProoPTH(1-84)或[Meto，Leu8，Leu18]PTH(1-84)；或該化合物不為hPTH(1-36)，其中36位α-胺基酸為Leu。
2.一種如權利要求1的PTH化合物，含有至少一個在PTH序列下列位置之一中置換的胺基酸單位1，2，3，8-11，13到19，21，22，29到34。
3.一種如權利要求1或2的PTH化合物，其中PTH序列氨基末端的1位和2位α-胺基酸單位被一種假二肽置換。
4.一種如權利要求3的式Ⅰ的PTH化合物X-P1Ⅰ其中X為一種式(a)或(b)殘基 其中Z和Z′各自獨立地為H;取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基;或一種保護基，Z和Z′的最多之一為一種保護基，Z″為H，C1-8烷基或一種保護基Y和Y″各自獨立地為一種天然或非天然α-胺基酸保護或未保護的側鏈，Ya和Yb之一為氫而另一個為一種天然或非天然α-胺基酸保護或未保護的側鏈或Ya和Yb和與他們相連的碳原子一起形成一個C3-6環烷基基團，和w為滷素或C1-4烷基或w和Y′和與他們相連的 部分一起，形成一個取代或未取代的芳族環或雜環殘基，和P1為一個PTH序列，其中N-末端的1和2位的胺基酸單位被刪去。
5.一種如權利要求1或2的PTH化合物，其中PTH序列的N-末端的1位α-胺基酸單位和/或2位α-胺基酸單位被一個保護或未保護的天然或非天然胺基酸殘基置換，先決條件是當該PTH化合物從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸或從C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它不為一種具有天然存在的α-胺基酸序列的PTH化合物;或該PTH化合物不為PTH(1-34)，其中ⅰ.在1位的α-胺基酸為Aib，Gly，D-Ser，D-Ala或Tyr;或ⅱ.在2位的α-胺基酸為Ala，D-Val，Lys，Git或Arg且在34位的α-胺基酸為Tyr;或在2位的α-胺基酸為D-Val且在34位的α-胺基酸為D-Tyr和第8位和18位α-胺基酸各自可以為Nle;或ⅲ.在1位的α-胺基酸為Aib且至少一個另外的α-胺基酸單位已被按如下置換在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁基)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在25位和/或26的位α-胺基酸為His，和/或在27位的α-胺基酸為Gln或Leu，或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-84)其中ⅰ.在1位的α-胺基酸為Tyr，Val，Pro，Asp或Cys;或ⅱ.在2位的α-胺基酸為Ala，Glu，Leu，Ser或Arg。
6.一種如權利要求5的式Ⅱ的PTH化合物5- X1a-Y2a-P1Ⅱ其中Xla為一種被保護或未保護的天然α-胺基酸殘基或一種式(Ⅱa)殘基 其中Za和Z′a各自獨立地為H，C1-6烷基或一種保護基，Za和Za′至多之一為保護基，和或者n為1且ⅰ.R1和R2各自獨立地為C1-5烷基，或ⅱ.R1和R2之一為甲基或乙基而另一個為一種保護或未保護的與天然α-胺基酸(Ala，Leu，Ile或Val除外)的α-碳原子相連的殘基，或ⅲ.R1和R2之一為氫、甲基或乙基而另一個為一種保護的或未保護的與非天然α-胺基酸的α-碳原子相連的殘基，或ⅳ.R1和R2和與他們相連的碳原子一起形成C3-6環烷基基團，或ⅴ. 殘基代表一個隨需可以與苯環縮合或不縮合的雜環殘基，或n為2，3，4或5且R1和R2各自為H或CH3，Yza為一種保護或未保護的天然α-胺基酸殘基或一種式(Ⅱb)殘基 Zb為H或C1-6烷基且或者m為1而ⅰ.R3和R4各自獨立地為C1-6烷基，或ⅱ.R3和R4之一為甲基或乙基而另一個為一個保護的或未保護的與天然α-胺基酸(Ala，Leu，Ile或Val除外)的α碳原子相連的殘基，或ⅲ.R3和R4之一為H，甲基或乙基而另一個為一個保護的或未保護的與非天然α-胺基酸的α碳原子相連的殘基，或m為2，3，4，或5而R3和R4各自為H或CH3，和P1定義同權利要求4。
7.一種如前面任一權利要求的PTH化合物其中在8位的α-胺基酸單位和/或在18位的α-胺基酸單位被一種保護或未保護的天然或非天然胺基酸殘基置換，先決條件是當該PTH化合物從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸或從C2-6烷氧基羰基或取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它不為具有天然存在的α-胺基酸序列的PTH化合物;或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-34)其中ⅰ.在8位和18位的α-胺基酸各為Nle或各自為Met(o)且隨需地34位α-胺基酸可以是Tyr;或在8位和18位的α-胺基酸各為Nle且在34位的α-胺基酸為Tyr和或者在12位的α-胺基酸為L-或D-Pro，L-ak或D-Ala，Aib或NMeGly或者在23位的α-胺基酸為Phe，Leu，Nle，Val，Tyr，α-Nal或β-Nal;或在8位和18位的α-胺基酸各為Nle且在2位的α-胺基酸為D-Val和在34位的α-胺基酸為D-Tyr;或ⅱ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp且至少一個另一個α-胺基酸單位已被按如下置換或未置換在1位的α-胺基酸為Aib和/或在11的位α-胺基酸為Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁酯)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位的和/或在21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His，和/或在27位的α-胺基酸為Glu或Leu;或ⅲ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Ala或Ser;或在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu，且在34位的α-胺基酸為Tyr;或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-84)其中在8位的α-胺基酸為Met，Met(o)，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Trp，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，Tyr或Gly而在18位的α-胺基酸為Leu;或在8位和18位的α-胺基酸各自為Met(o);或在8位的α-胺基酸為Leu且在18位的α-胺基酸為Met(o);或該PTH化合物不是[Leu18，Tyr34]hPTH(1-84)，[Leu8，Tyr34]hPTH(1-84)，[Ile8，Leu18，Tyr34]hPTH(1-84)或[Leu8，Leu18，Tyr34]hPTH(1-84)。
8.一種具有PTH活性的游離形式或鹽的形式或配合物形式的PTH化合物其中PTH序列的1到38位中至少一個α-胺基酸單位被存在於PTHrp相應位中的α-胺基酸置換，該PTH化合物可以含有或不含有至少一個選自L-或D-α-胺基酸，C2-5烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物末端氨基相連的基團，和/或至少一個選自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與一個或多個PTH化合物的側鏈相連的基團，先決條件是當該PHT化合物從與N-末端相連的D-或L-α-胺基酸或從C2-6烷氧基羰基或取代或示取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基游離時，它不為一種具有天然存在的α-胺基酸列的PTH化合物;或該PTH化合物不為這樣的PTH(1-34);其中ⅰ.在8位和/或18位的α-胺基酸為Leu;和/或在H位的α-胺基酸為Lys;和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg;和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His;和/或在27位的α-胺基酸為Leu;且可以有或沒有至少一個另外一個α-胺基酸單位已被如下置換在1位的α-胺基酸為Aib和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁基)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Lys，Asn或His，和/或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在27位的α-胺基酸為Gln;akⅱ.在25位的α-胺基酸為Gln和/或在26位的α-胺基酸為Asn，在27位的α-胺基酸可能是或不是Leu;或該PTH化合物不為[Leu8，Leu18]PTH(1-84)。
9.一種具有PTH樣活性的，以游離形式或鹽形式或配合物形式的PTH化合物，其中PTH序列的8到11位中至少一個α-胺基酸單位被存在於PTHrp相應位置中的α-胺基酸置換，該PTH化合物可以含有或不含至少一個選自L-或D-α-胺基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物末端氨基相連的基團，和/或至少一個選自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與一個或多個PTH化合物側鏈氨基相連的基團，條件是該PTH化合物不為這樣的[Leu8，Leu18]-PTH(1-84)或PTH(1-34)其中8位α-胺基酸為Leu和/或11位α-胺基酸為Lys且可隨需至少一個進一步的α-胺基酸單位被如下置換或未置換在1位的α-胺基酸單位為Aib，和/或在18位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁基)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Mer，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe，或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位和/或21位的α-胺基酸為Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His，和/或在27位的α-胺基酸為Gln或Leu。
10.一種具有PTH樣活性的，以游離形式或鹽的形式或配合物形式的PTH化合物，其中PTH序列的16到19位中至少一個α-胺基酸單位被存在於PTHrp相應位置中的α-胺基酸單位置換，該PTH化合物含有或不含至少一個選自L-或D-α-胺基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或不取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物末端氨基相連的基團，和/或至少一個選自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物的一個或多個側鏈氨基相連的基團，先決條件是該PTH化合物不為這樣的[Leu8，Leu18]-PTH(1-84)或PTH(1-34)其中在18位的α-胺基酸為Leu和/或在19位的α-胺基酸為Arg且隨需要至少一個另外一個α-胺基酸單位被如下置換或不置換在1位的α-胺基酸單位為Ais，和/或在8位的α-胺基酸為Leu，Ile，Val，Phe或Trp，和/或在11位的α-胺基酸為Ser，Lys，Phe，β-Nal，Trp或Tyr，和/或在12位的α-胺基酸為D-Leu，D-Ile，D-Nle，D-Val，D-Ser，D-Ser(丁基)，D-Abu，D-Thr，D-Nva，D-Met，D-β-Nal，D-Trp，D-Lys，D-Tyr，D-Lys(Fmoc)，D-Phe或D-Asn，和/或在13位的α-胺基酸為Leu，和/或在19位的α-胺基酸為Lys，Asn或Mis和/或在21位的α-胺基酸Arg，Lys，Asn或His，和/或在23位的α-胺基酸為2-(1，3-二硫羥烷-2-基)Trp，和/或在25位和/或26位的α-胺基酸為His，和/或在27位的α-胺基酸為Gln或Leu。
11.一種具有PTH樣活性的，以游離形式或鹽的形式或複合物形式的PTH化合物，其中PTH序列的33和34位中的至少一個α-胺基酸單位被存在在PTHrp相應位置中的α-胺基酸單位置換，該PTH化合物含有或不鄰至少一個選自L-或D-α-胺基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物末端氨基相連的基團，和/或至少一個選自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物的一個或多個側鏈氨基相連的基團。
12.一種如權利要求8到11的任一PTH化合物，其中在保留的1到38位中的一個或多個α-胺基酸進一步被一種天然或非天然胺基酸單位置換。
13.一種如權利要求12的PTH化合物，其中在10位的α-胺基酸選自Gly，Gln，Glu，His，Ser，Thr，Lys和Tyr，和/或在13位的α-胺基酸為一種除Arg外的D-或L-α-胺基酸，和/或在16位的α-胺基酸為一種D-或L-α-胺基酸，和/或在18位的α-胺基酸為Gln或Tyr，和/或在19位的α-胺基酸選自Ala，Arg，Val，Tyr，Ser，Lys，Met，His，Gly，Pro，Asn和Ile，和/或在33位的α-胺基酸為一種除Thr，Phe或Ala外的D-或L-α-胺基酸。
14.一種以游離形式或鹽形式或配合物形式的，該化合物選自[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]PTH，[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]PTH，[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]PTH和[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]PTH，該PTH化合物隨需可含有或不含有至少一個選自L-或D-α-胺基酸，C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物末端氨基相連的基團，和/或至少一個選自C2-6烷氧基羰基和取代或未取代的C1-8烷基，C2-8烯基，C2-8炔基，芳烷基，芳烯基或C3-6環烷基-C1-4烷基並與PTH化合物的一個或多個側鏈氨基相連的基團。
15.一種如前任一權利要求的PTH化合物，該化合物為一種含有1-34到1-38個胺基酸單位的N-末端PTH片斷。
16.一種如權利要求15的PTH化合物，該化合物為一種N-末端hPTH片斷。
17.一種如前任一權利要求的PTH化合物，其中C末端為-COOH，酯化的-COOH，-CONH2，單或雙取代的-CONH2
18.一種以游離形式或鹽的形式或複合形式的PTH化合物，該PTH化合物選自[Leu8，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OH[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH[Leu8，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18]hPTH(1-36)OH[Leu8，Asp10，Lys11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH[Len8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OH[Leu8，Asp10，Lys11，Ala16，Gln18]hPTH(1-36)OH，和[Leu8，Ala16，Gln18，Ala19]hPTH(1-36)OH
19.一種生產所需中等大小多肽的方法，該方法包括將一種融合蛋白表達在細菌細胞中，該融合蛋白含有N-末端噬菌體T4基因的55多肽，並且具有與其C-末端相連的所需多肽。
20.一種如權利要求19的方法，其中融合蛋白含有一種在基因55與所需多肽之間的化學可裂解的鏈。
21.一種如權利要求20的方法，其中可裂解的鏈包括胺基酸序列Asp-Pro-Pro或Asn-Gly-Pro。
22.一種核苷酸序列，它編碼一種融合蛋白，該蛋白含有N-末端噬菌體T4基因55多肽和與其C-末端相連的所需中等大小的多肽。
23.一種細菌表達載體，該載體含有一種如權利要求22的DNA序列。
24.用一種如權利要求22的DNA序列或一種如權利要求23細菌載體轉化的細菌宿主細胞。
25.一種融合蛋白，它含有一種N-末端噬菌體T4基因55多肽和一種與其C-末端相連的所需的中等大小的多肽。
26.一種如權利要求20或21的方法，其中所需的中等大小的多肽含有一種PTH多肽。
27.一種藥用組合物，它含有一種按權利要求1到18位一定義以游離形式或生理可接受的鹽的形式的PTH化合物，與其一起的一種藥用可接受的稀釋劑或載體。
全文摘要
本發明涉及甲狀旁腺素(PTH)的變異體、其生產方法、含有他們的藥製劑以及藥物用途。術語「PTH」指任何一種遺傳編碼形式的甲狀旁腺激素。更具體地說，本發明提供一種具有PTH樣活性的並含至少一種修飾的以游離形式或鹽形式或配合物形式的PTH化合物，所說的修飾如說明書中所述。以游離形式的或以鹽形式的PTH化合物具有藥理學活性，例如用於預防或治療所有與增加鈣排空或吸收或者與骨中鈣的固著有關的骨病有理想的效果。
文檔編號A61K38/22GK1099801SQ9311648
公開日1995年3月8日 申請日期1993年7月14日 優先權日1992年7月15日
發明者W·包爾, F·卡丁勞, H·格蘭姆, H·施奈德, R·布雷肯裡奇, F·貢伯特, P·蘭梅治, R·韋奇力, R·艾伯特, I·路易斯 申請人:山道士有限公司