用於治療心腦血管疾病的藥物——複方葛根素的製作方法
2023-06-12 22:53:26
專利名稱：用於治療心腦血管疾病的藥物——複方葛根素的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物，其包含生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷，用於預防和治療心腦血管疾病，尤其是用於預防和治療心絞痛、心肌梗塞、冠心病、腦血栓病或心腦組織缺血。本發明還涉及包含該藥物組合物的藥物製劑以及製備方法。另外，本發明也涉及生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷在製備治療心腦血管疾病的藥物中的應用。
背景技術：
當前，心腦血管疾病正嚴重威脅著人類的健康和生命，是世界上造成死亡人數最多的疾病之一。為此，人們經過長期研究發現，廣泛存在於各種植物中的生物黃酮具有增強毛細管作用，能用來防止細胞和組織中的氧化性損傷。目前生物黃酮及其衍生物或含有生物黃酮作為有效成份的植物提取物已經被廣泛用於預防和治療心腦血管疾病。這樣的實例有許多，如五眼果黃酮(參見CN 1139673A)、山楂黃酮(參見CN 1232031A)、板慄花黃酮(參見CN 1323797A、CN 1569869A)、異槲皮素(參見CN 1355797A)、紅花黃酮(參見CN 1363684A)、大豆異黃酮(參見CN 1375492)、蒲黃黃酮(參見CN 1468859)、葛根素(參見CN 1511840A)、竹葉黃酮(參見CN 1513447A)、黃細心黃酮糖苷(參見CN 1515583)、水翁花類黃酮(參見CN 1544428)、尼泊爾鳶尾異黃酮(參見CN 1594307A)、醋柳黃酮(參見CN 1686107)，等等。
但是在單獨使用生物黃酮時，由於生物黃酮的化學結構決定了它們在水中溶解度較小，因而它們的生物利用度差，導致治療效果比較差。例如，葛根素(其化學名稱為8-β-D-葡萄吡喃糖-4』，7-二羥基異黃酮，是由豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd.)Ohwi)的乾燥根中提取分離得到的)能使外周血管擴張，特別是擴張冠狀動脈血管，增加冠狀動脈血流量，促進冠脈側枝循環的開放和形成，改善缺血區的血流，改善粘滯血症、高凝血症，使紅細胞變形能力增強，聚集性下降，從而達到稀釋血液改善微循環的目的。然而葛根素在水中溶解度小，在小鼠體內生物利用度僅為3.95％，正常人口服葛根素後72小時自糞便排出73.8％。這使得葛根素口服吸收差，而且在腸胃道吸收很差，直接造成治療效果不佳。故而葛根素用於臨床治療心腦血管病時，會以丙二醇為溶劑將葛根素製成注射劑靜脈給藥來增加生物利用度。但是葛根素靜脈注射給藥方式和以丙二醇為溶媒，會在臨床上表現出比較嚴重的不良反應，主要不良反應有發熱、過敏反應、溶血及腹脹、噁心等症狀，限制了葛根素的應用。其他生物黃酮的單獨使用也會受制於類似的生物利用度小、口服吸收差，因而也會使它們在實踐中廣泛應用產生困難。
除了生物黃酮之外，我國利用傳統中醫藥知識也開發出了大量用於預防和治療心腦血管疾病的藥物。其中，絞股藍是我國傳統的藥用植物，中藥名為七葉膽，其提取物——絞股藍總皂苷也是一種常用的養心健脾、益氣和血的藥物。絞股藍總皂苷(Gypenosides)系由葫蘆科植物絞股藍(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Mak)的乾燥全草中提取分離得到的總皂苷。近二十多年來，日本和我國不少學者對絞股藍進行了大量研究，取得了相當成熟的研究結果，發現其主要藥效成分為絞股藍總皂苷。絞股藍總皂苷具有降血脂治療動脈粥樣硬化和心腦血管的保護作用。目前我國已經有批准上市的絞股藍製劑了，主要有絞股藍總皂苷片、膠囊、顆粒劑等，用於降血脂，但是其降血脂作用比較緩慢，一般需要連續服藥3～6個月才能顯效。
另外，中國專利申請CN1475254A公開了一種以葛根總黃酮、山楂提取物和絞股藍總皂苷為有效成分的藥物，用於治療冠心病和心絞痛。但是由於其中使用較多的物質，特別是葛根總黃酮和山楂提取物是一個十分複雜的混合物，文獻報導葛根總黃酮中3′-甲氧基葛根素具有溶血和過敏作用，故國家藥品標準葛根素注射液規定其它雜質不得大於1％，由於山楂提取物和葛根總黃酮有效成分不明確，作用機理不清楚，產品質量和製劑穩定性和均一性難以控制，給產業上生產、應用帶來了困難，不能保證臨床用藥的安全有效。
為了克服以上現有技術的缺陷，本發明人將中醫藥學的經驗精華與現代科學技術進行結合，經過艱苦努力，驚人地發現了生物黃酮及其衍生物與絞股藍總皂苷組合在一起具有明顯的協同效應，能夠顯著協同提高治療心腦血管疾病的效果；通過本發明的藥物組成，能夠有效克服單獨使用生物黃酮的生物利用度低和單獨使用絞股藍總皂苷作用緩慢的缺點，而且見效更快，生物利用度高，適合口服；另外，由於通過研究更明確了有效藥物成分並減少了不必要的無效成分，因此更容易控制生產成本和產品質量，而且作用機理明確，製劑穩定性和均一性好，產品質量可控。
發明內容
本發明所要解決的主要技術問題是克服上述現有技術的缺陷，獲得預防和治療心腦血管疾病的藥物。本發明人經過拆方研究和動物藥代動力學試驗等艱苦努力，驚人地發現了，絞股藍總皂苷能增加生物黃酮及其衍生物在水中的溶解度，從而提高其生物利用度，因而生物黃酮及其衍生物與絞股藍總皂苷的組合能夠顯著協同提高治療心腦血管疾病的效果，並在此基礎上通過進一步研究，獲得了一種藥效好、見效快、生物利用度好、毒副作用小、而且口服有效的藥物。
在第一個方面，本發明提供一種治療心腦血管疾病的藥物組合物，其包含生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷，即其包含生物黃酮或其衍生物並且其包含絞股藍總皂苷。所述藥物組合物優選不含有山楂提取物，即不含有用70％乙醇對山楂進行提取的產物。更優選地，所述藥物組合物基本由生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷組成。
本文中所用的術語「基本」指的是除了所列舉的有效成分外，還可以有其他組分，但這些組分對有效成分的特性無實質上的影響。例如，基本由生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷組成，指本發明的藥物組合物中包含生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷，而且在所述藥物組合物中，生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷作為有效成分起治療心腦血管疾病的主要或全部作用，優選在所述藥物組合物中生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷起到80％以上的治療心腦血管疾病的作用，更優選起到90％以上的作用，更優選起到95％以上的作用，最優選在所述藥物組合物中不包含其他起心腦血管疾病治療作用的有效成分。例如，本發明的藥物組合物可以由包含生物黃酮的植物提取物與絞股藍總皂苷組成，其中包含生物黃酮的植物提取物中的主要成分為生物黃酮，更具體地，其中所述的包含生物黃酮的植物提取物中含生物黃酮單體成分含量為85％以上，優選90％以上，更優選95％以上，更優選至少98％。另外，本發明也優選，本發明的藥物組合物可以由生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷組成。
本發明中所述的「絞股藍總皂苷」(Gypenosides)系由葫蘆科植物絞股藍(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Mak)的乾燥全草中提取分離得到的總皂苷，更具體地，優選提取分離得到的提取物中含總皂苷85％以上，優選90％以上，更優選95％以上，最優選以絞股藍皂苷-A(C53H90O21)計，含總皂苷不少於97％。目前，絞股藍總皂苷的生產與製備已經相當成熟，已經出現大量應用絞股藍總皂苷的技術，如CN1602882A、CN1593435A等公開了絞股藍總皂苷製備治療心腦血管疾病的藥物和工藝，這些文獻都納入本文參考；也可以參考衛生部也已經出臺了的WS3-Z-006-93(Z)等標準。
本發明所述的「生物黃酮」是具有治療心腦血管疾病的黃酮類化合物。所述生物黃酮是本領域技術人員所熟知的廣泛存在於各種植物中的天然黃酮類化合物，可以通過對植物進行提取而獲得。生物黃酮的製備方法以及它們對於心腦血管疾病的療效已經為本領域技術人員所熟知，例如，五眼果黃酮(參見CN 1139673A)、山楂黃酮(參見CN 1232031A)、板慄花黃酮(參見CN 1323797A、CN 1569869A)、異槲皮素(參見CN 1355797A)、紅花黃酮(參見CN 1363684A)、大豆異黃酮(參見CN 1375492)、蒲黃黃酮(參見CN 1468859)、葛根素(參見CN 1511840A，US4985408A)、竹葉黃酮(參見CN 1513447A)、黃細心黃酮糖苷(參見CN 1515583)、水翁花類黃酮(參見CN 1544428)、尼泊爾鳶尾異黃酮(參見CN 1594307A)、醋柳黃酮(參見CN 1686107)等等，這些文獻中的內容都納入本文參考。通過本領域技術人員所熟知的技術，可以從含有生物黃酮的植物中分離出黃酮類化合物。例如，通過CN1176117A所述的色譜技術，收集不同的色譜峰所代表的化合物，可以分離出葛根素、黃豆甙、3』-羥基葛根素等成分。在大規模生產時，為了節約成本，可以不製備得到非常純的生物黃酮，只要能在植物提取物中含有有效治療量的生物黃酮就可以了，具體而言，本發明所述的包含生物黃酮的植物提取物優選含生物黃酮85％以上，優選90％以上，更優選95％以上，更優選98％以上。本發明的生物黃酮優選是從野葛的乾燥根中提取分離的葛根素(8-β-D-葡萄吡喃糖-4』，7-二羥基異黃酮)。本發明優選包含葛根素的野葛提取物中葛根素的含量為85％以上，優選90％以上，更優選95％以上，更優選按乾燥品計算，含8-β-D-葡萄吡喃糖-4』，7-二羥基異黃酮(C21H20O9)不少於98％。
本發明所述的生物黃酮或生物黃酮衍生物也可以是通過有機合成領域的技術人員所熟知的合成技術合成製備的具有治療心腦血管疾病的黃酮類化合物。本發明所述的生物黃酮衍生物是指在植物中提取獲得的天然生物黃酮的結構上取代或缺失氫、烷基、氨基、氨基烷基、羧基、雜環基、雜環基烷基、芳環、醯基、糖苷等基團的化合物以及其酯或其鹽，其中雜環、芳環、糖苷基團具有不超過30個碳原子的大小，而其中其他取代基團具有不超過10個碳原子的大小，而且所述生物黃酮衍生物或其酯或其鹽仍舊保持了治療心腦血管疾病的活性。這樣的衍生物通過常規有機合成技術就能為本領域技術人員所獲得。例如，CN 1013582A、CN 1233173A、CN 1386742A等專利就公開了大量的生物黃酮衍生物，這些文獻中的內容都納入本文參考。優選本發明的生物黃酮或其衍生物選自含有糖苷配基槲皮素的糖苷生物黃酮和含有糖苷配基異黃酮的糖苷生物黃酮以及它們的衍生物。生物黃酮或其衍生物的實例優選但並不僅僅局限於槲皮甙、異槲皮甙、葛根素、黃豆甙、3』-羥基葛根素或它們的衍生物。優選本發明的生物黃酮或其衍生物選自槲皮甙、異槲皮甙、葛根素、黃豆甙、3』-羥基葛根素和它們的衍生物中的一種或多種，更優選選自葛根素或其衍生物。葛根素衍生物的實例優選但並不僅僅局限於CN1511840A、WO2004002470A、WO2005003146中所涉及的葛根素衍生物，這些文獻的內容都納入本文參考。
本發明藥物組合物中有效成份的配比可以根據有效成份的活性來確定，一般，生物黃酮或其衍生物與絞股藍總皂苷的重量之比為1～100∶100～1，優選為1～30∶30～1，更優選為1～10∶10～1，更優選1～5∶5～1，更優選1～3∶3～1。通過本領域技術人員所熟知的實驗，如對大鼠腸繫膜微循環作用，對大鼠動脈血栓的影響，對大鼠血液流變學的影響，對家兔血小板聚集性的影響，對大鼠冠脈結紮及心肌缺血試驗和對犬血流動力學的影響等試驗，可以方便地確定有效成份的活性。在本發明的一個具體的實施方式中，合適的配比量為葛根素0.2～5mg/kg，絞股藍總皂苷為0.1～4.0mg/kg，即葛根素∶絞股藍總皂苷的重量之比為0.2～5∶0.1～4.0。本發明人發現了本發明的藥物組合物的療效顯著高於單味藥，具有明顯的增效減毒作用。例如，實驗證明葛根素和絞股藍總皂苷作用類型為其增效指數(以單藥的ED50和ED90與複方中的ED50和ED90之比)高達6.8。根據不同的藥物製劑形式和患者狀況、給藥方式，給藥的劑量會有所不同。通常，以藥物組合物或藥物製劑中的葛根素或絞股藍總皂苷計，給藥的劑量為0.01～100mg/kg患者體重，優選為0.03～50mg/kg，優選為0.05～20mg/kg，優選為0.07～10mg/kg，更優選為0.1～5mg/kg。
在本發明的第二個方面，本發明提供了一種治療心腦血管疾病的藥物製劑，其包含本發明第一個方面所述的藥物組合物以及藥學上可接受的輔劑。藥學上可接受的輔劑包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分相容。運用藥學上可接受的輔劑製備藥物製劑對本領域普通技術人員來說是公知的。本發明的藥物製劑包含一種或多種本發明第一個方面所述的藥物組合物作為活性成分，將該藥物組合物和藥學上可接受的輔劑(如本領域普通技術人員所熟知的載體、賦形劑、稀釋劑等)組合在一起，配製成各種製劑，優選為固體製劑和液體製劑。本發明的製劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑、等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、黏膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等的給藥形式。其中載體、賦形劑、稀釋劑是藥學上可接受的並與活性成分相容。可以選用的合適的賦形劑優選但不僅限於水、生理鹽水、葡萄糖，甘油、乙醇或其類似物及其組合。製備各種劑型的實例優選但不僅限於CN1457795A、CN1593435A、CN1602882A中所述的技術。
本發明藥物製劑中的輔劑優選包括能夠具有表面活性劑作用的、藥學上可接受的並與活性成分相容的輔劑。這樣的輔劑能與本發明藥物組合物中的活性成分形成空隙固溶體，進一步提高藥物溶出速率和生物利用度。在一個優選的實例中，可以選用泊洛沙姆(Poloxamer)，合適的規格有PEG2000-20000或PVP K15-K90或PVA或PVP-PVA或CPD等。以上泊洛沙姆等均屬藥用輔料，無藥理活性，為一種表面活性劑，其易溶於水，能與許多藥物形成空隙固溶體。應用泊洛沙姆作載體，可進一步提高藥物溶出速率和生物利用度，是理想的固體分散體的載體。固體分散體的製備方法與藥物的製備方式是本專業的一般技術人員公知的。固體分散體的載體常用的有水溶性載體，如聚乙二醇類、聚維酮、泊洛沙姆類等。在本發明一個優選的實例中，可以將葛根素和絞股藍總皂苷與泊洛沙姆混合，採用熔融法或溶劑法或研磨法或噴霧乾燥法或溶劑-熔融法製成固體分散劑，然後再與其它藥用輔料配製成各種固體製劑和液體製劑。實踐中，可以根據給藥方式和患者身體狀況來確定本發明的藥物製劑的用量，這對於醫務人員來說是顯而易見的。在本發明的一個具體的實施方式中，複方葛根素採用葛根素和絞股藍總皂苷組成活性成份而泊洛沙姆作為藥物載體，合適的配比劑量為葛根素0.2～5mg/kg，絞股藍總皂苷為0.1～4.0mg/kg，加入的泊洛沙姆的量是葛根素的0.2-15倍，即葛根素∶絞股藍總皂苷的重量之比為0.2～5∶0.1～4.0，而且葛根素∶泊洛沙姆的重量之比為1∶0.2-15，將它們製成固體分散體。經動物生物利用度試驗三者配比的最佳配比為葛根素∶絞股藍總皂苷∶泊洛沙姆＝3∶1∶6。
在第三個方面，本發明提供一種本發明第一方面的藥物組合物的製備方法，其包括將生物黃酮或其衍生物與絞股藍總皂苷混合的過程。例如，該製備方法可以包括將合成的生物黃酮或其衍生物與絞股藍總皂苷混合的過程，也可以包括將主要成分為生物黃酮的植物提取物與絞股藍總皂苷混合的過程。該混合過程使其中的生物黃酮或其衍生物與絞股藍總皂苷的重量之比在1～100∶100～1之間，優選1～30∶30～1之間，更優選1～10∶10～1之間，更優選1～5∶5～1之間，更優選1～2∶2～1之間。在本發明的一個具體的實施方式中，可以將葛根素和絞股藍總皂苷混合在一起，使得在組合物中的葛根素與絞股藍總皂苷的重量之比為0.2～5∶0.1～4.0。
在第四個方面，本發明提供一種本發明第二方面的藥物製劑的製備方法，其包括將生物黃酮或其衍生物、絞股藍總皂苷和藥學上可接受的輔劑混合的過程。例如，該製備方法可以包括將合成的生物黃酮或其衍生物、絞股藍總皂苷和藥學上可接受的輔劑混合的過程，也可以包括將主要成分為生物黃酮的植物提取物、絞股藍總皂苷和藥學上可接受的輔劑混合的過程。藥物的製備方式可以採用本專業的一般技術人員所公知的方法製備成合適的製劑。在本發明一個優選的實例中，可以將葛根素和絞股藍總皂苷與泊洛沙姆混合，採用熔融法或溶劑法或研磨法或噴霧乾燥法或溶劑-熔融法(參見，朱盛山主編《藥物新劑型》，化學工業出版社，2003.8；奚念朱主編《藥劑學》人民衛生出版社.1996.4等，以上文獻均納入本文參考)製成固體分散劑，然後再與其它藥用輔料配製成各種固體製劑和液體製劑。在本發明的一個具體的實施方式中，將葛根素和絞股藍總皂苷以及泊洛沙姆混合在一起，使得在組合物中的葛根素與絞股藍總皂苷的重量之比為0.2～5∶0.1～4.0，加入的泊洛沙姆用量是葛根素的0.2-15倍，製成製成固體分散體。
在第五個方面，本發明提供本發明第一方面的藥物組合物或本發明第二方面的藥物製劑在製備預防和治療心腦血管疾病的藥物中的應用，優選心絞痛、心肌梗塞、冠心病、腦血栓病或心腦組織缺血。優選參照本發明第一方面的藥物組合物或本發明第二方面的藥物製劑，可以將本發明的藥物組合物或藥物製劑中的成分製備成一種藥物，同時給藥這些成分；也可以將本發明的藥物組合物或藥物製劑中的成分分別製備成二種或二種以上藥物，參照本發明第一方面的藥物組合物或本發明第二方面的藥物製劑中的成分比例和給藥劑量，同時給藥這些藥物，或在能夠不影響其中成分協同作用的一段時間內，分別給藥這些藥物。給藥的劑量和形式一般由醫師根據患者的具體情況(如年齡、體重、性別、患病時間、身體狀況等)確定。一般而言，以藥物組合物或藥物製劑中的葛根素或絞股藍總皂苷計，給藥的劑量為0.01～100mg/kg患者體重，優選為0.03～50mg/kg，優選為0.05～20mg/kg，優選為0.07～10mg/kg，更優選為0.1～5mg/kg。在本發明的一個具體的實施方式中，給藥劑量為葛根素0.2～5mg/kg，絞股藍總皂苷為0.1～4.0mg/kg。給藥形式根據各種藥物製劑的劑型來確定，適合的給藥形式有口服、非腸道注射、黏膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等給藥形式，優選口服、注射的給藥形式。
本發明引用了現有公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文之中，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。
為了便於理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。利用本發明實施例所述的方法，也可以獲得本發明其他的技術方案。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。
四，具體實施方式
實施例1 複方葛根素片(通用名葛藍心通片)的製備1.配比葛根素 45g絞股藍總皂苷 15g泊洛沙姆 90g乳糖 80g微晶纖維素 25g交聯PVP 12g5％PVP乙醇溶液 適量硬脂酸鎂 活量製成 1000片2.製備過程製備方法將葛根素45g(純度為98.0％)、絞股藍總皂苷15g(純度為97.0％)、泊洛沙姆90g混合均勻，加入50％乙醇溶解，然後噴霧乾燥，得固體分散體，將此分散體加入到80g乳糖、25g微晶纖維素、12g交聯PVP中混合均勻，用5％PVP乙醇溶液制粒，烘乾，整粒，加入適量硬脂酸鎂混勻，壓片，包薄膜衣，即得。
實施例2 複方葛根素片(通用名葛藍心通片)的藥效學試驗1實驗材料1.1動物SD品系大白鼠，♀♂各半，體重190～240g，質量合格證陝醫動證字08-005號；新西藍品系大白兔，♀♂兼用，體重1.8-2.2kg，質量合格證陝醫動證字08-018號；家犬，♀♂兼用，體重12-15kg，質量合格證陝醫動證字08-012號。
1.2藥物複方葛根素片(每片含有效成分葛根素45mg+絞股藍總苷15mg)1.3陽性對照藥物複方丹參片，地奧心血康膠囊，多貝斯膠囊。
以下實驗如未經特別說明，均使用上述材料進行。
(一)複方葛根素對大鼠血液流變學影響(1)試驗方法領取健康SD品系大鼠100隻，體重190～240g，適應實驗室7天後開始稱重、編號，隨機分為10組，每組10隻，①正常動物組；②模型組(NS，5ml/kg)；③複方丹參片(500mg/kg)；④複方葛根素片大劑量組(80mg/kg)；⑤複方葛根素片中劑量組(40mg/kg)；⑥複方葛根素片小劑量組(20mg/kg)；⑦絞股藍大劑量組(20mg/kg)；⑧絞股藍組(10mg/kg)；⑨葛根素大劑量組(60mg/kg)；⑩葛根素組(30mg/kg)。
以上動物，除①②組外的其餘動物連續灌胃給藥一周，容量為10ml/kg。動物取血前一天，除去正常動物組外，其餘動物皮下注射Adr0.08ml/100g，一天2次，間隔4h，第一次注射後2h將大鼠浸入冰水內5min做血瘀模型後禁食不禁水，次日晨將大鼠斷頭取血2.7ml，其中1.5ml血迅速注入肝素抗凝管中搖勻後，置入35℃的恆溫水浴箱中備用，1.2ml血迅速注入枸櫞酸鈉抗凝管，搖勻備用。
取1ml肝素抗凝血注入粘度計轉筒內，轉換高切變率，低切變率開關，記錄高切率，低切變率粘度標度值(高切200s-1；低切40s-1)將其輸入計算機，求得全血高切變率及低切變率粘度值。
取底端平整的毛細管，杆入剛混勻的肝素抗凝血中，待血進入毛細管內4/5處，封住下埠，下端扦入橡皮泥中，垂直豎立，並記時1h後，用血沉壓積板讀出血沉值(溫氏法)。
將上述毛細離心管，用3F-3型高速微量離心機離心5min，轉速12000rpm，再用壓積板讀出紅細胞壓積值。
將測定壓積的毛細離心管在溫度為56±1℃的水浴中水浴5min，然後用同樣離心機離心5min，轉速仍為12000rpm，取出後用讀數顯微鏡測量毛細血管內血漿長度和纖維蛋白原長度，按下列公式計算纖維蛋白原含量(熱沉澱法)。
將做完全血粘度的血吸回原抗凝管，用80-2型離心機離心血漿，轉速3000rpm，時間15min，取1ml，按上述測全血高切粘度的方法測血漿粘度。
全血還原粘度由計算機根據全血高切變率粘度值和紅細胞壓積算出，軟體由中科院傳感技術公司提供。
取1ml枸櫞酸鈉抗凝血加入容量為5ml的長頸圓形玻璃瓶中，將其置於血小板粘附儀轉盤上，以5rpm的轉速旋轉15min後取上，再用定量取血管分別吸取20μl旋轉前和旋轉後的抗凝血注入1％0.4ml的草酸銨稀釋劑中測定旋轉前後血中的血小板數，然後按下式計算 (2)試驗結果見表1(二)複方葛根素對大鼠腸繫膜微循環作用影響(1)試驗方法取成年健康的SD品系大白鼠90隻，♀♂各半，每組10隻，體重205.35±13.9g由西安交大醫學院實驗動物中心提供。實驗大鼠禁食不禁水12小時後，用3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠0.1ml/100g，背位固定在有機玻璃手術臺上，將腹部毛剪淨，於一側壁用手術刀切開長約3～4cm左右的切口，拉出口指腸插管結紮後復位準備給藥，再輕輕拉出一段空胸袢，平輔於特製的有機玻璃灌流水池內，用大頭將腸管固定於小池側邊軟木片上，腸繫膜置於透明小池中，灌流小池充以30℃的15ml洛氏營養液，採用雙目倒置顯微鏡放大80倍進行觀察測量(顯微鏡頭內裝有測微尺)。
試驗分為9組①.正常動物對照組；②.複方丹參片組(500mg/kg)；③.複方葛根素片大劑量組(80mg/kg)；④複方葛根素片中劑量組(40mg/kg)；⑤.複方葛根素片小劑量組(20mg/kg)；⑥.絞股藍大劑量組(20mg/kg)；⑦.絞股藍組(10mg/kg)；⑧.葛根素大劑量組(60mg/kg)；⑨.葛根素組(30mg/kg)。以上動物先觀察各項正常指標後，12指腸給藥，容量5ml/kg，20min後再次觀察各項指標值。
試驗採用給藥前後自身對照，試驗結果經統計學t檢驗處理，結果見表2。
結果顯示複方葛根素片大、中劑量組均可增加大鼠腸細膜毛細血管管徑、毛細血管流速，結果同複方丹參片組相似(P＜0.05，P＜0.01)，藥物各劑量組對毛細血管條數和交叉個數點無明顯的作用。
(2)試驗結果見表2
表1 複方葛根素對大鼠血液流變學的影響(x±S)
△表示模型組與正常組比較△P＜0.05 △△P＜0.01*表示用藥組與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01
表2 複方葛根素對大鼠腸細膜微循環的作用(x±S)
各組給藥前後自身比較*P＜0.05，**P＜0.01***P＜0.001
(三)複方葛根素對大鼠動脈血栓的影響結果見表3表3 複方葛根素對大鼠動靜脈血栓形成的影響(x±S，n＝10)
*表示各給藥組與對照組比較*P＜0.05**P＜0.01(四)複方葛根素對家兔血小板聚集性的影響結果見表4表4 複方葛根素對家兔血小板聚集性的作用(x±S，n＝8)
各組給藥前後自身比較*P＜0.05**P＜0.01(五)複方葛根素對心肌缺血大鼠的影響結果分別見表5、表6、表7表5 複方葛根素對結紮冠脈大鼠心肌酶譜的影響(x±S，n＝10)
*表示給藥組與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01△表示模型組與假手術組比較△P＜0.05 △△P＜0.01表6 複方葛根素對結紮冠脈大鼠心肌梗死範圍的影響(x±S，n＝10)
*表示各給藥組與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01表7 複方葛根素對結紮冠脈大鼠急性心肌缺血心律變化的影響(x±S，n＝10)
*表示各給藥組與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01△表示模型組與假手術組比較△P＜0.05△△P＜0.01對腦重體後葉導致心肌缺血大鼠ST段電位的影響結果見表8表8 複方葛根素對腦垂體後葉素致心肌缺血大鼠ST段的影響(x±S，n＝10)
機率法檢驗，*P＜0.05**P＜0.01(六)複方葛根素對犬血流動力學的影響1、對麻醉犬血流動力學的影響(1)對麻醉犬心率(HR)的影響正常對照組、複方丹參滴丸組的HR給藥前後沒有明顯變化(P＞0.05)。葛根素大、小劑量組和絞股藍大劑量組的HR減慢，與正常對照組比較有明顯統計學差異(p＜0.05，p＜0.01)，其中葛根素組降低最為明顯，複方葛根素片降低HR的作用更強，約為絞股藍和葛根素之和，提示複方葛根素片有降低麻醉犬HR的作用。
(2)對麻醉犬動脈收縮壓(SAP)的影響結果顯示，與給藥前比較，正常對照組各時間點測量的SAP值沒有明顯變化(P＞0.05)；複方丹參滴丸組在給藥後15min時降低13.31％，270min時降低10.54％；絞股藍小劑量組的SAP，其大劑量組SAP降低明顯(P＜0.05、P＜0.01)，在15min和270min分別降低了6.16％和5.12％；葛根素大、小劑量組均有明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，在給藥後15min和270min時分別降低10.02％和12.33％、9.05％和7.85％；複方葛根素各劑量組的SAP明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，在給藥後15min和270min時降低的幅度分別為3.16％、7.98％和20.67％以及0.15％、3.99％和17.93％。與正常對照組比較，複方丹參滴丸組、葛根素組和絞股藍大劑量組的SAP均有明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，複方葛根素片大、中、小劑量組亦有明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，從作用強度看，複方葛根素片降低SAP的幅度接近於或超過絞股藍、藍根素之和。提示複方葛根素片有降低麻醉犬SAP的作用。
(3)對麻醉犬動脈舒張壓(DAP)的影響正常對照組動物的DAP給藥前後沒有明顯變化；複方丹參滴丸組降低明顯，但在給藥後150min時即開始恢復。絞股藍組和給藥前後變化不明顯(P＞0.05)，葛根素大劑量組有明顯變化(P＜0.05，P＜0.01)，而且在270min時才有所恢復。複方葛根素片大、中劑量組的DAP降低明顯(P＜0.05，P＜0.01)，而且作用時間較長。提示複方葛根素片有降低麻醉犬DAP的作用。
(4)對麻醉犬平均動脈壓(MAP)的影響正常對照組動物的MAP給藥前後變化不明顯(P＞0.05)，複方丹參滴丸組的MAP給藥後降低明顯，與正常對照組比較，有明顯統計學差異(P＜0.05，P＜0.01)。葛根素和絞股藍大劑量組的MAP明顯降低，有明顯統計學差異，小劑量組降低趨勢明顯，複方葛根素片大、中劑量組的MAP降低明顯(P＜0.05，P＜0.01)，小劑量組有降低的趨勢，而且可以看出，複方葛根素降低MAP的幅度似於是絞股藍與葛根素之和，提示複方葛根素片有降低動物MAP的作用，而且其作用強度等於或強於絞股藍與葛根素之和。
上述結果提示，複方葛根素有降低麻醉開胸犬血壓的作用。
(5)對左室內收縮壓的(LVSP)的影響複方丹參滴丸組的LVSP給藥前後有明顯地變化(P＜0.05，P＜0.01)，絞股藍大劑量組變化明顯，小劑量組不明顯，葛根素大劑量組有短暫降低(P＜0.01)。複方葛根素片組的LVSP明顯降低，且呈現劑量依賴關係，提示複方葛根素有降低麻醉犬LVSP的作用，而且與絞股藍/葛根素在效應大小上有明顯的關係。
(6)對左室收縮期壓力變化最大速率(LVP-dp/dtmax)的影響正常對照組動物的LVP-dp/dtmax給藥前後沒有明顯變化，複方丹參滴丸組變化亦不明顯，與正常對照組沒有明顯統計學差異(p＞0.05)。絞股藍大劑量組給藥後明顯降低(p＜0.05，p＜0.01)；葛根素大、小劑量組也有降低趨勢，雖然沒有明顯著性統計學差異(p＞0.05)。複方葛根素片大劑量組給藥前後LVP-dp/dtmax明顯降低(p＜0.05，p＜0.01)，中、小劑量組也有降低。從降低的幅度看，有明顯地劑量依賴關係，與葛根素和絞股藍降低的和相近似。提示複方葛根素片有降低麻醉犬LVP+dp/dtmax的作用，作用強度與葛根素和絞股藍的之和相近似。
(7)對心臟每搏量(SV)的影響正常對照組的ASV隨著時間的延長有明顯減少(p＜0.01、p＜0.05)，這可能是手術後創傷引起的自然下降，與給藥無關係。而且降低的幅度不是太大，降低的最大值為給藥後150min時6.40％。絞股藍和葛根素大劑量組給藥後SV明顯增加，小劑量組也較正常對照組有明顯增加的趨勢，給藥後複方葛根素片各劑量組SV顯示劑量依賴性地增加，作用強度與絞股藍和葛根素之和相當。提示複方葛根素片有增加心臟每搏排血量(SV)的作用。
(8)對冠狀動脈每搏量(CSV)的影響正常對照組的CSV給藥前後沒有明顯變化(p＞0.05)，複方丹參滴丸組、絞股藍大劑量組、葛根素大、小劑量組CSV給藥後明顯增加，與正常對照組比較統計學意義顯著(p＜0.01)。複方葛根素片大、中、小劑量組的CSV給藥後明顯增加，與正常對照比較有明顯統計學差異(p＜0.05、p＜0.01)。結果提示，複方葛根素片有增加麻醉犬CSV的作用，強度與絞股藍/葛根素之和相當。
(9)對冠狀動脈血流量(CBF)的影響正常對照組的CBF給藥前後沒有明顯變化(p＞0.05)。複方丹參滴丸組較給藥前明顯增加，與正常對照組比較差異有明顯統計學意義(p＜0.01)。絞股藍大劑量組、葛根素大、小劑量組也能使CBF增加(p＜0.05、p＜0.01)，複方葛根素片增加CBF的作用更加明顯，最大增加幅度可達38.96％(給藥後270min時)。說明複方葛根素片有增加CBF的作用。
(10)對冠脈阻力(CVR)的影響給藥後複方丹參滴丸組的CVR較給藥前和正常對照組明顯降低，絞股藍大劑量組和葛根素大、小劑量組與之有相同的結果。複方葛根素片降低CVR的作用較絞股藍和葛根素更為明顯，最大時可降低24.00％(15min)，至270min時，亦降低22.07％。結果說明複方葛根素片降低CVR的作用。
(11)對心臟排血量(CO)的影響正常對照組、複方丹參滴丸組的CO給藥後沒有明顯改變(P＞0.05)。絞股藍、葛根素小劑量組亦未見明顯改變，兩者的大劑量組則有明顯增加，與正常對照組比較，有明顯統計學差異(P＜0.05，P＜0.01)。複方葛根素片大劑量組的CO給藥後有明顯增加，中、小劑量增加不明顯，但有增加的趨勢。結果提示，複方葛根素通片有增加麻醉犬CO的作用。
(12)對心指數(CI)的影響正常對照組、複方丹參滴丸組的CI沒有明顯改變。葛根素大劑量組的CI有所增加(P＜0.05)，葛根素小劑量組、絞股藍大、小劑量組CO變化不明顯，與正常對照組比較無明顯統計學意義(P＞0.05)。複方葛根素片大劑量組CO給藥後有明顯增加(P＜0.05、P＜0.01)，中、小劑量組也有增加的趨勢，但都比相當劑量的葛根素、絞股藍組增加明顯，提示複方葛根素片有增加CI的作用，且比絞股藍、葛根素單用時的作用強。
(13)對心搏指數(SVI)的影響正常對照組、複方丹參滴丸組SVI給藥後沒有明顯變化(P＞0.05)。絞股藍、葛根素大劑量組給藥後使SVI明顯增加(P＜0.05、P＜0.01)，複方葛根素片大、中劑量組給藥後使SVI明顯增加(P＜0.05、P＜0.01)，提示複方葛根素片能使麻醉開胸犬的SVI明顯增加，且增加的幅度均比絞股藍和葛根素大。
(14)對心臟每搏功(SW)的影響正常對照組給藥前後每搏功(SW)有所減少，最大時減少5.19％(150min)。複方丹參滴丸組最大時減少10.17％(P＜0.05)，絞股藍、葛根素大劑組使減少的SW明顯增加(p＜0.05、P＜0.01)，複方葛根素片組大、小劑量組亦有明顯增加的趨勢。
(15)對總外周血管阻力(TPR)的影響複方丹參滴丸組給後30min，TPR開始減少，與正常對照組比較統計學意義明顯(P＜0.05)。絞股藍、葛根素大劑量組亦明顯減少(p＜0.05，P＜0.01)。而且降低的程度較葛根素和/絞股藍組明顯(p＜0.05，P＜0.01)。提示複方葛根素片有降低TPR的作用。
(16)對左室作功指數(LVWI)的影響複方丹參滴丸組動物的LVWI給藥後明顯減少(P＜0.05)，給藥後150min時開始恢復，但比正常對照組減少明顯(p＜0.05、P＜0.01)，絞股藍大劑量組、葛根素大、小劑量組給藥後LVWI也明顯減少(p＜0.05、P＜0.01)，絞股藍組作用時間較短暫，但較正常對照組降低明顯。複方葛根素片大劑量組LVWI給藥後明顯減少，較正常對照組有明顯統計學差異(p＜0.05、P＜0.01)，中、小劑量組有所降低，但均較絞股藍和葛根素單用時明顯，提示複方葛根素片有降低LVWI的作用。
總之，上述結果表明，對於體循環，複方葛根素片能降低麻醉開胸犬的SAP、DAP、MAP、LVP-dp/dtmax、HR、TPR和LVWI，能夠增加CO、SV、CI，對於冠狀循環，複方葛根素片能增加CBF、降低CVR、減少心肌耗氧量。對這些參數改變的程度均較絞股藍、葛根素單用時明顯。
2、對心肌缺血犬血流動力學影響本試驗觀察了經十二指腸給藥後複方葛根素對麻醉開胸犬和心肌缺血犬血流動力學的影響，並與陽性藥複方丹參滴丸進行比較。結果顯示複方葛根素能夠使①麻醉開胸犬的心率降低，血壓、左心室內壓和dP/dtmax降低，心輸出量、心指數增加，左心室作功減少，總外周阻力降低，可以使冠脈流量增加，冠脈阻力降低。②對心肌缺血犬，可以使其心率和血壓降低，左室內壓、dP/dtmax明顯降低，使SV、CO增加，使CI增大，LVWI、TPR降低，使冠脈流量增加，冠脈阻力和心肌氧利用率，使心肌梗死範圍縮小，心電圖T波和S-T段明顯改善。本試驗結果提示複方葛根素可明顯改善正常和心肌缺血犬的血流動力學，具有抗心肌缺血作用。而且複方葛根素的作用較絞股藍、葛根素單用時明顯。
上述試驗設計用含有葛根素和絞股藍總皂苷的組合物觀察了對大鼠血液流變學、大鼠冠脈結紮模型和垂體後葉素模型、家兔血小板聚集性、大鼠動靜脈血栓、大鼠腸繫膜微循環及對犬血流動力學的影響等一系列該藥對病理模型動物的作用，此外，還進行拆方試驗驗證該藥配方的合理性，觀察該藥的作用。實驗結果表明複方葛根素大、中劑量組全血高切變率粘度、低切變率粘度、血漿粘度、高切還原粘度、纖維蛋白原、血小板粘附率降6項指標均降低，具有顯著性(P＜0.01)。複方葛根素大劑量組使結紮冠脈大鼠的心肌缺血範圍縮小(P＜0.05，P＜0.01)。垂體後葉素模型研究表明，複方葛根素能明顯抑制垂體後葉素引起的大鼠心肌缺血的心電圖變化ST段升高，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。綜合二種模型結果說明，複方葛根素有明顯的抗心肌缺血作用。大劑量組給藥前後可明顯降低家免血小板聚集率(PAgVmax％)和聚集時間(PAgTmax％)(P＜0.01)，複方葛根素各劑量組對大鼠體外血栓形成的溼重有明顯的減輕作用(P＜0.05，P＜0.01)，說明複方葛根素具有溶血栓的作用。對正常麻醉犬和心肌缺血犬血流動力學的影響結果顯示複方葛根素能夠①降低麻醉開胸犬的心率；可使其血壓和左心室內壓、左室內壓上升最大速率(dP/dtmax)降低，心輸出量增加，心指數增加，左心室作功指數減少，總外周阻力降低，可以使冠脈流量增加，冠脈阻力(CR)降低。②對心肌缺血犬，可以使其心率和血壓降低，左室內壓、dP/dtmax明顯降低，抑制每搏量(SV)及心輸出量(CO)的下降，使心指數(CI)增加、左室作功(LVW)、總外周阻力(TPR)減小，使冠脈流量增加、冠脈阻力和心肌耗氧指數降低，使心肌缺血範圍減小，心電圖T波和S-T段明顯改善，結果提示複方葛根素可明顯改善正常麻醉犬和結紮冠脈犬的血流動力學，且具有明顯的抗心肌缺血作用。拆方試驗結果顯示，該藥的配方組成(絞股藍總皂苷∶葛根素為1∶3)較合理，藥效明顯，二者具有顯著協同和相加作用。而且複方葛根素的作用較絞股藍總皂苷、葛根素單用時明顯。
相應地，本領域技術人員也很容易地能夠利用本發明所述的實驗(尤其是實施例)製備出本發明的含有其他生物黃酮和絞股藍總皂苷的組合物和藥物製劑，並得到這些組合物和藥物製劑的協同治療效應結果。
權利要求
1.一種治療心腦血管疾病的藥物組合物，其包含生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其不含有山楂提取物。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其基本由生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷組成。
4.根據權利要求1-3之任一所述的藥物組合物，其中生物黃酮或其衍生物與絞股藍總皂苷的重量之比為1～100∶100～1，優選為1～30∶30～1，更優選為1～10∶10～1，更優選為1～5∶5～1，更優選為1～3∶3～1。
5.根據權利要求1-4之任一所述的藥物組合物，其中所述生物黃酮或其衍生物選自含有糖苷配基槲皮素的糖苷生物黃酮和含有糖苷配基異黃酮的糖苷生物黃酮以及它們的衍生物。
6.根據權利要求1-5之任一所述的藥物組合物，其中所述生物黃酮或其衍生物選自槲皮甙、異槲皮甙、葛根素、黃豆甙、3』-羥基葛根素和它們的衍生物中的一種或多種。
7.根據權利要求1-6之任一所述的藥物組合物，其中所述生物黃酮或其衍生物是葛根素或其衍生物，優選是葛根素。
8.一種治療心腦血管疾病的藥物製劑，其包含權利要求1-7之任一所述的藥物組合物以及藥學上可接受的輔劑。
9.根據權利要求8所述的藥物製劑，其中藥學上可接受的輔劑包括泊洛沙姆。
10.一種權利要求1-7所述的藥物組合物的製備方法，其包括將生物黃酮或其衍生物與絞股藍總皂苷混合的過程。
11.一種權利要求8-9所述的藥物製劑的製備方法，其包括將生物黃酮或其衍生物、絞股藍總皂苷和藥學上可接受的輔劑混合的過程。
12.權利要求1-7所述的藥物組合物或權利要求8-9所述的藥物製劑在製備預防和治療心腦血管疾病的藥物中的應用。
13.根據權利要求12所述的應用，其中心腦血管疾病為心絞痛、心肌梗塞、冠心病、腦血栓病或心腦組織缺血。
全文摘要
本發明涉及一種藥物組合物，其包含生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷，用於預防和治療心腦血管疾病，尤其是用於預防和治療心絞痛、心肌梗塞、冠心病、腦血栓病或心腦組織缺血。本發明還涉及包含該藥物組合物的藥物製劑以及製備方法，和生物黃酮或其衍生物和絞股藍總皂苷在製備治療心腦血管疾病的藥物中的應用。本發明的藥物具有療效好，生物利用度高，毒副作用小，劑量小等優點，適合製成各種固體和液體劑型。
文檔編號A61P7/00GK1883498SQ20061008136
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月22日 優先權日2006年5月22日
發明者吳建中 申請人:吳建中