桫欏的一種繁殖方法
2023-06-12 11:36:01
專利名稱：：桫欏的一種繁殖方法
技術領域：
：本發明涉及植物的繁殖方法，特別涉及桫欏""o;&'h印^"h^(Wa11.exHook.)Tryon)的一種繁殖方法。
背景技術：
：全世界挱欏科(O^Meaceae)植物約有6屬500餘種，產於熱帶和亞熱帶的山地。我國地處桫欏科植物分布地的北緣，種類不多，目前已知的僅有2屬14種和2個變種，主要分布於西南和華南地區。絕大多數種類的桫欏科植物都具有樹狀的直立莖，呈喬木狀，大型羽狀葉子簇生於莖幹的頂端，形成傘狀，故又稱為樹蕨。據化石記載，在地質歷史上桫欏科植物最早出現於中生代的早侏羅紀或晚三疊紀，在中生代中期曾廣泛分布，極為繁盛。後來由於地質變遷和氣候變化，特別是第四紀冰川期的影響，大量種類滅絕，分布區也大幅度收縮，最後僅殘存於熱帶和亞熱帶這些環境適宜的"避難所"，基於上述原因被稱為植物界的"活化石"。該科植物除了具有較高的園林觀賞價值，還可藥用，其根狀莖具有清熱解毒、驅風溼等功效；我國蘭花栽培者常用桫欏科植物的樹幹作為附生蘭花的載體；此外，其有些種類的樹幹還可製備筆筒，如筆筒樹(5^aero;^eri's2印i/er3)等。目前挱欏的數量已經非常稀少，只有在中亞亞熱帶以南低海拔地區保存較好的常綠闊葉林的林緣才見生長，在我國主要分布於貴州、四川、廣東和臺灣等地，被列為國家一級保護植物。其瀕危的主要原因是孢子壽命短、生長周期長，孢子萌發、配子體的形成對環境條件要求嚴格。而且由於其具有較高的觀賞及藥用價值，市場需求量較大，但是桫欏科植物的人工繁殖栽培技術滯後，導致野生桫欏資源遭到嚴重破壞。目前，國內外主要研究了0^We3rfregei(Finnie&vanStaden.MultiplicationofthetreefernCyat力earfrege丄HortScience，1987，22(4):665)、6yaf力e3-y4w5^rsh.s(GollerK，RybczynskiJJ.In-vitrocultureusedforwoodyfern6yat力e3—勿stra7is.ActaSocietatisBotanicorumPoloniae，1995，64:1-17)、桫欏""op力j7a5^.""2osa(Hook.)Tryon)(KharePB，BeheraSK.Studiesonreproductivebiologyofathreatenedtreefern,CyatheaspinulosaWall,exHook.CurrentScience,2005，89:173-177;畢世榮，蘇成端，徐正蘭，何立明，桫欏組織培養的研究，植物生理學通訊，1985，(1):38;程治英，張風雷，蘭芹英，許再富，陶國達，桫欏的快速繁殖與種質保存技術的研究，雲南植物研究，1991，13(2):181-188)和中華桫欏(A/s，力ihco^^ar^Bak.)(程治英，劉道華，中華桫欏的組織培養，植物生理學通訊，1992，28(3):210-211)的組織培養方法，但對桫欏快速萌發、短期出苗的繁殖方法還未見詳細報導。
發明內容本發明的目的是提供桫欏""，^7a5TW力Wosa(Wa11.exHook.)Tryon)的一種繁殖方法。本發所提供的桫欏C4"op^7a邵^7"乃sa(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖方法，是在如下固體培養基中培養桫欏的孢子，得到孢子體苗；所述固體培養基的組成成分與MS培養基相同，其中大量元素和微量元素的濃度均為MS培養基的1/8—1，鐵鹽和有機成分的濃度與MS培養基相同，pH為5.5—6.0。所述固體培養基中，大量元素和微量元素的濃度具體可為MS培養基的1/2，pH為5.8。所述桫欏孢子在培養之前，用含有3-6g/100mlNaC10和0.1-0.3g/100ml吐溫-80溶液進行消毒處理，如果材料容易汙染，可在所有處理之前用70%酒精浸10-15s。所述消毒處理的時間為4.5—6min。所述消毒處理具體為用含有5g/100mlNaC10和0.2g/100ml吐溫-80的溶液消毒處理5min。所述桫欏孢子的培養條件為在22—28X:下，先暗培養12-72h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為20-80Wno1m—2s—'，光照時間為8_16h/d所述桫欏孢子的培養條件具體為在25'C下，先暗培養24h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為50陶o1m—2s一1，光照時間為12h/d。上面所述桫欏孢子的繁殖方法還包括移栽所述孢子體苗的步驟。所述移栽過程的管理條件為夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26。C，夜間溫度10-15°C，空氣溼度70-90%，緩苗20-35d後每月施一次l/2MS培養基。本發明的繁殖方法適合於桫欏C4"叩^7a邵眾w7oss(Wa11.exHook.)Tryon)。本發明以孢子為材料，利用組織培養技術，再結合對蕨類植物的專有栽培管理措施，建立了桫欏的孢子繁殖方法。利用本發明的方法，用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子體，平均7-9天孢子即可萌發，25-35天形成配子體，68-97天形成孢子體苗。與其它現有培養方法相比，本發明方法具有快速萌發、短期出苗、培育周期短、成本低廉的特點。本發明方法彌補了現有桫欏繁殖技術培育周期長、成本高和效率低的不足，開闢了一條人工快速繁殖挱欏的新途徑，使桫欏的規模化工業生產成為可能，從而滿足市場對桫欏的需求，同時可減少對其野生資源和環境的破壞。此外，本發明還為開展該物種遺傳育種和保護生物學等方面的研究提供了良好的試驗體系，具有廣泛的應用前景。圖1為桫欏的配子體。2為桫欏的試管苗(孢子體苗)。圖3為定植的桫欏幼苗。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。實驗中所述MS培養基的組成為MS培養基的組成complextableseeoriginaldocumentpage5鐵鹽Na2-EDTA37.3FeS04-7H2O27.8有機成分煙酸0.5鹽酸吡眵醇(VB6)0.5煙酸硫胺素(VB。0.1甘氨酸2,0肌醇100.0實施例1、桫欏U"c^/Was"/^;Wa^(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖一、1/2MS培養基的配製1/2MS培養基中的組成成分與MS培養基相同，其中，大量元素和微量元素濃度均為MS培養基的1/2，鐵鹽和有機成分的濃度與MS培養基相同，瓊脂7g/L，pH為5.8。煮沸溶解後分裝至100ml三角瓶中，然後121°C，高壓蒸汽滅菌20min。二、桫欏孢子的滅菌取成熟的桫欏"Aop力i^3印i加7osa(Wa11.exHook.)Tryon)孢子5mg置於1.5ml離心管內，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置lh後，4000r/min離心2min，棄上清；然後向離心管內滴入約1,Oral含有0.2g/100ml吐溫-80和5g/100mlNaC10的消毒液，對孢子進行消毒滅菌，5min後，4000r/min離心1min，棄上清；最後用無菌水衝洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。三、無菌孢子的接種及培養在無菌條件下，先用無菌水將上述配製的1/2MS培養基的表面溼潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續的水滴為宜)，然後用滴管將步驟二獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養基上。接種後，在25"下，先暗培養24h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為50Wno1m—2s-1(光源為螢光燈)，光照時間為12h/d。四、挱欏幼孢子體苗的移栽及管理培養7天後，孢子開始萌發，萌發率為82%，25天(從接種當天起算)形成配子體(圖l)，68(從接種當天起算)天開始形成孢子體苗。至88-90天左右(從接種當天起算)，幼苗高3-4cra，將三角瓶置於自然光照下煉苗6天，再打開瓶蓋煉苗6天。然後用鑷子輕輕夾出試管苗(圖2)，洗淨培養基後，將其移栽至100目細篩篩選的素砂中，並置於培養室內培養，培養溫度為25'C，光照強度為50Mmo1m2s—1(光源為螢光燈)，光照時間為12h/d。1個月後將其定植到穴盤中(培養基質的成份及混合比例為草炭土細砂有機肥二4:2:1)，置溫室培養，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26°C，夜間溫度10-15'C，空氣溼度70-90%。緩苗1個月後每月施一次1/2MS培養基，經120天左右，幼苗長到5-10cm高，且根系發達，進行分株上盆，定植幼苗(圖3)，平均定植成活率86%。實施例2、挱欏G41sop力j7a5^';"^^s(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖一、1/8MS培養基的配製1/腦S培養基的組成成分與MS培養基相同，其中，大量元素和微量元素濃度均為MS培養基的1/8，鐵鹽和有機成分的濃度與MS培養基相同，瓊脂6.5g/L，pH為5.5。煮沸溶解後分裝至100ml三角瓶中，然後121。C，高壓蒸汽滅菌20min。二、桫欏孢子的滅菌取成熟的桫欏孢子2mg,置於1.5ml離心管內，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置lh後，4000r/rain離心2min，棄上清；然後向離心管內滴入約1.0ml含有O.1g/100ml吐溫-80和3g/100mlNaC10的消毒液，對孢子進行消毒滅菌，4.5min後，4000r/min離心1min，棄上清；最後用無菌水衝洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。三、無菌孢子的接種及培養在無菌條件下，先用無菌水將上述配製的1/8MS培養基的表面溼潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續的水滴為宜)，然後用滴管將步驟二獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養基上。接種後，在22"C下，先暗培養12h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為20,1m-2s-1(光源為螢光燈)，光照時間為8h/d。四、桫欏幼孢子體苗的移栽及管理培養7d(從接種當天起算)後，孢子開始萌發，萌發率為91%，35d(從接種當天起算)形成配子體(圖l)，97d開始形成孢子體苗。至148-156天(從接種當天起算)，幼苗高3-4cm，將三角瓶置於自然光照下煉苗10d，再打開瓶蓋煉苗10d。然後用鑷子輕輕夾出試管苗(圖2)，洗淨培養基後，將其移栽至經100目細篩篩選的素砂中，並置於培養室內培養，培養溫度為22'C光照強度為20,1nf2s-1(光源為螢光燈)，光照時間為8h/d。40d後將其定植到穴盤中(培養基質的成份及混合比例為草炭土細砂有機肥=4:2:1)，置溫室培養，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26°C，夜間溫度10-15°C，空氣溼度79-90%。緩苗25d後每月施一次l/2MS培養基，待幼苗長到5-10cm高且根系發達時，分株上盆，定植孢子體幼苗(圖3)，平均定植成活率70%。實施例3、挱欏"Zso/7力ih5^^w〗OM(Wa11.exHook.)Tryon)的繁殖一、全量MS培養基的配製大量元素和微量元素與鐵鹽濃度均與MS培養基相同，鐵鹽和有機成分的濃度與MS培養基相同，瓊脂8g/L，pH為6.0。煮沸溶解後分裝至100ml三角瓶中，然後121。C，高壓蒸汽滅菌20min。二、桫欏孢子的滅菌取成熟的桫欏孢子7mg,置於1.5ml離心管內，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置lh後，4000r/min離心2min，棄上清；然後向離心管內滴入約1.0ml含有0.3g/100ml吐溫-80和6g/100mlNaC10的消毒液，對孢子進行消毒滅菌，6min後，4000r/min離心1min，棄上清；最後用無菌水衝洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。三、無菌孢子的接種及培養在無菌條件下，先用無菌水將上述配製的MS培養基的表面溼潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續的水滴為宜)，然後用滴管將步驟二獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養基上。接種後，在28'C下，先暗培養72h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為80Mmo1m—2s-1(光源為螢光燈)，光照時間為16h/d。四、桫欏幼孢子體苗的移栽及管理培養9d後，孢子開始萌發，萌發率為80%，32d形成配子體(圖l)，90d開始形成孢子體苗。至122-130天(從接種當天起算)，幼苗高3-4cm時，將三角瓶置於自然光照下煉苗8d，再打開瓶蓋煉苗8d。然後用鑷子輕輕夾出試管苗(圖2)，洗淨培養基後，將其移栽至經100目細篩篩選的素砂中，並置於培養室內培養，培養溫度為28°C，光照強度為80toolirf2s—1(光源為螢光燈)，光照時間為16h/d。30d後將其定植到穴盤中(培養基質的成份及混合比例為草炭土細砂有機肥=4:2:1)，置溫室培養，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26°C，夜間溫度10-15°C，空氣溼度79-90%。緩苗25d後每月施一次1/2MS培養基，待幼苗長到5-10cm高且根系發達時，分株上盆，定植孢子體幼苗(圖3)，平均定植成活率74%。實驗結果表明，利用本發明方法繁殖桫欏，平均7-9d天孢子即可萌發，25-35d天形成配子體，68-97天形成孢子體苗，幼孢子體苗移栽成活率可達86%。權利要求1、一種桫欏的繁殖方法，是在如下固體培養基中培養桫欏的孢子，得到孢子體苗；所述固體培養基中的組成成分與MS培養基相同，其中大量元素和微量元素的濃度均為MS培養基的1/8-1，鐵鹽和有機成分的濃度與MS培養基相同，pH為5.5-6.0。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述培養基中，大量元素和微量元素的濃度為MS培養基的1/2，pH為5.8。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述桫欏孢子在培養之前，用含有36g/100mlNaClO和0.1-0.3g/100ml吐溫-80溶液進行消毒處理。4、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述消毒處理的時間為4.5—6min。5、根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述消毒處理為用含有5g/100ralNaC10和0.2g/100ml吐溫-80的溶液消毒5min。6、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述桫欏孢子的培養條件為在22—28t:下，先暗培養12-72h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為20-80Mmol'm^.s-1,光照時間為8—16h/d。7、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述桫欏孢子的培養條件為在25"下，先暗培養24h，然後將其轉至光照下繼續培養，光照強度為50pmol'm^s-1,光照時間為12h/d。8、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述桫欏孢子的繁殖方法還包括移栽所述孢子體苗的步驟。9、根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述移栽過程的管理條件為夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度2卜26X:，夜間溫度10-15。C，空氣溼度70-90%，緩苗20-35d後每月施一次1/2MS培養基。10、根據權利要求1或8所述的方法，其特徵在於所述桫欏為桫欏柳'/Wosa(Wa11.exHook.)Tryon)。全文摘要本發明公開了桫欏的一種繁殖方法。本發明涉及植物的繁殖方法，特別涉及桫欏(Alsophilaspinulosa(Wall.exHook.)Tryon)的一種繁殖方法。本發明所提供的桫欏的繁殖方法，是將桫欏的孢子滅菌後接種在MS培養基上進行培養，再經移栽管理，最終獲得孢子體苗。本發明方法用少量的孢子材料即可快速繁育出大量孢子體，70天左右即可成苗，定植成活率可達80％以上。本發明方法彌補了現有桫欏繁殖技術培育周期長、成本高和效率低的不足，開闢了一條人工快速繁殖桫欏的新途徑，使桫欏的規模化工業生產成為可能，從而滿足市場對桫欏的需求，同時可減少對其野生資源和環境的破壞。此外，本發明還為開展該物種遺傳育種和保護生物學等方面的研究提供了良好的試驗體系，具有廣泛的應用前景。文檔編號A01H4/00GK101194594SQ20071017969公開日2008年6月11日申請日期2007年12月17日優先權日2007年12月17日發明者東李,楊李,雷石申請人:中國科學院植物研究所