從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法

2023-06-01 10:17:16

專利名稱：從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離方法，尤其涉及一種採用離子交換樹脂從核糖核酸(RNA)酶解液中分離核苷酸的方法。
核苷酸，如5』-腺苷酸(簡稱5』-AMP)、5』-烏苷酸(簡稱5』-GMP)、5』-胞苷酸(簡稱5』-CMP)和5』-尿苷酸(簡稱5』-UMP)及其衍生物為重要的生物化工原料，可以作為食品添加劑、保健食品和醫藥中間體。
一般，通過連續發酵培養高核酵母，然後從中提取分離可獲得RNA，亦可從啤酒酵母或其他酵母中分離獲得RNA。將RNA用核酸酶P1(或磷酸二酯酶)酶解，然後對酶解液進行分離，即可獲得所說的5』-腺苷酸、5』-烏苷酸、5』-胞苷酸和5』-尿苷酸。目前，已有一些文獻報導了分離方法，如文獻核苷酸類物質的生產和應用，中國科學院微生物研究所編，科學出版社1971，報導了一種分離方法，該方法通過陽-陰離子樹脂結合的方法，進行核苷酸的分離，該方法雖然可以一次分離出大量的5』-腺苷酸，但5』-烏苷酸、5』-胞苷酸和5』-尿苷酸的分離效果並不好，5』-尿苷酸的損失將近50％，5』-烏苷酸和5』-胞苷酸的損失將近40％，生產周期長，料液容易變質，分離總收率約為65％；該文獻同時報導了另一種分離方法，該方法直接採用陰離子交換樹脂進行分離，該方法分離周期長，氣溫高時上柱液容易長黴，流出液體積大，耗水量多，沒有工業應用價值。
隨著核苷酸及其衍生物藥物療效的發掘和作為保健品的應用，其需求量日益增大，原有的生產方法已不能滿足人們的需要，有關的產業部門希望提供更為有效的生產方法。
本發明的目的在於公開一種從RNA酶解液中分離核苷酸，包括5』-腺苷酸、5』-烏苷酸、5』-胞苷酸和5』-尿苷酸的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷，滿足人們的需要。
本發明的構思是這樣的
本發明採用二根陽離子交換樹脂柱、一根大孔弱鹼陰離子交換樹脂柱和一根弱鹼陰離子交換樹脂柱，將酶解液串聯上柱，分段洗脫。由於5』-AMP、5』-GMP、5』-CMP具有氨基，在較低的pH的條件下，如pH=1.5的條件下，氨基被離解，帶有正電荷，故首先與陽離子交換樹脂進行離子交換，被吸附，而5』-UMP無氨基，因此不被陽離子交換樹脂所吸附，而進入陰離子交換樹脂柱；當酶解液經過大孔弱鹼陰離子交換樹脂柱時，比5』-UMP具有更強交換勢的少量雜質，如肌苷酸等，被首先被交換吸附，而5』-UMP幾乎不損失地通過大孔弱鹼陰離子交換樹脂柱，並使酶解液的pH值升高，使5』-UMP更容易被強鹼陰離子交換樹脂柱所交換吸附。
二根陽離子交換樹脂柱洗脫的基本原理是這樣的由於5』-AMP、5』-GMP和5』-CMP氨基的離解常數分別為3.70、2.30和4.24，因此當用水洗時，5』-GMP帶正電荷較弱，因此首先被洗脫下來；同時由於嘌呤與苯乙烯樹脂有親和性，故而雖然5』-CMP氨基離解常數略高於5』-AMP，但卻先於5』-AMP被洗脫。
因此採用分段洗脫的方法，可一次性地高收率分離出純度較高的核苷酸。
本發明的主要特徵是，通過陽陰離子交換樹脂的有序排列組合，一次分離純化得到高純度單核苷酸，並且具有所分離的單核苷酸濃度高，分離時間短，產品不易汙染等優點。
實現本發明目的的技術方案如下所述本發明所說的方法依次包括如下步驟①將含有四種5』-核苷酸、少量其他核苷酸(如5』-肌苷酸)以及核苷(如腺苷、烏苷、胞苷、尿苷、肌苷)等雜質pH值為1-2的酶解液按序流過兩根強酸陽離子交換樹脂柱、一根弱鹼大孔陰離子交換樹脂柱、一根強鹼陰離子交換樹脂柱，使5』-AMP被吸附在第一根強酸陽離子交換樹脂柱中，5』-GMP、5』-CMP主要被吸附在第二根強酸陽離子交換樹脂柱中，當溶液流過弱鹼大孔陰離子交換樹脂柱時，雜質被吸附在弱鹼大孔陰離子交換樹脂柱中，溶液的pH值亦將提高至7-8，並使5』-UMP被吸附在強鹼陰離子交換樹脂柱中；上柱完畢後，最好用pH為1-2的水充分淋洗，使殘留在兩根強酸陽離子交換樹脂柱中的5』-UPM全部進入到強鹼陰離子交換樹脂柱中；②用酸性氯化鈉溶液洗脫強鹼陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液，可得純度較高的5』-UMP溶液；③用去離子水洗滌兩根強酸陽離子交換樹脂柱，在第二根強酸陽離子交換樹脂柱部分收集純度較高的5』-GMP溶液和5』-CMP溶液。先流出的是5』-GMP溶液，然後流出的是5』-CMP溶液；④用去離子水洗滌第一根強酸陽離子交換樹脂柱，收集純度較高的5』-AMP溶液。
以下將通過附圖對本發明作進一步的說明。


圖1為流程圖。
由圖1可見，本發明所說的方法依次包括如下步驟①含有四種5』-核苷酸核、少量其他核苷酸(如5』-肌苷酸)以及核苷(如腺苷、烏苷、胞苷、尿苷、肌苷)等雜質pH值為1-2的酶解液按序流過兩根強酸陽離子交換樹脂柱1和2、一根弱鹼大孔陰離子交換樹脂柱3、一根強鹼陰離子交換樹脂柱4；上柱總量為陽樹脂總交換量的1.6％-2.4％，最佳為1.9-2.1％，即850毫昇陽離子交換樹脂約可交換9-13克核苷酸，最佳為10.5-11.5克，柱1和柱2的比例為1-(1.3∶1)；陰柱上樣總量為強鹼性陰離子交換總量的5％-10％，最佳為7-8％，即100毫升陰離子交換樹脂可交換1.7-3.4克5』-UPM，最佳為2.2-2.6克，柱3和柱4的比例為1-(1.3∶1)；上柱線速度為0.36-0.72米/小時；上柱液中核苷酸含量約為0.5-2％，最佳為0.8-1.2％；上柱完畢後，最好用pH為1-2的水充分淋洗，使殘留在兩根強酸陽離子交換樹脂柱中的5』-UPM全部進入到強鹼陰離子交換樹脂柱中；②用酸性氯化鈉溶液洗脫強鹼陰離子交換樹脂柱4，收集洗脫液；酸性氯化鈉溶液的用量為柱4樹脂體積的2-3倍，用量過大，則流出液濃度太低，反之，則不易洗脫徹底，收集流出的含有5』-UPM的溶液，約為樹脂體積的1倍；
③用去離子水洗滌兩根強酸陽離子交換樹脂柱1和2，在第二根強酸陽離子交換樹脂柱2處先收集純度較高的5』-GMP溶液，然後收集5』-CMP溶液；去離子的用量為樹脂體積的10-12倍，用量過大，則流出液濃度太低，反之，則不易洗脫徹底；④用去離子水洗滌第一根強酸陽離子交換樹脂柱1，在第一根強酸陽離子交換樹脂柱1的底部收集純度較高的5』-AMP溶液；去離子的用量為柱1樹脂體積的4-5倍，用量過大，則流出液濃度太低，反之，則不易洗脫徹底。
所說的陽離子交換樹脂為上海合成樹脂廠生產的732或0.01×7、美國Amberlite IR-120等強酸性苯乙烯陽離子交換樹脂中的一種，目數為80-200目，優選的為100-120目，柱3所用的陰離子樹脂為華東理工大學生產的D301或Amberlite IRA-93等，目數為20-80目，柱4所用的陰離子樹脂為上海合成樹脂廠生產的717或201×8、美國Amberlite IRA-40l、Iewatit M500等強鹼性苯乙烯陰離子交換樹脂中的一種，目數為80-200目，優選的為100-120目；所說的酸性氯化鈉溶液為0.1N HCl-3％NaCl的混合溶液，一般其pH值在1-2即可適用。
通過上述的分離過程，可高收率、高濃度地獲得5』-AMP、5』-GMP、5』-CMP和5』-UMP四種核苷酸，分離總收率可達90％，酶解液中的大部分雜質被截留在柱1和柱3中，將分離出的含有四種核苷酸的溶液通過常規的方法進行濃縮和精製，即可獲得純度為98％以上的高純度產品。
由上述公開的技術方案可見，本發明所說的方法，具有收率高、分離效果好、所得產品純度高以及適合大規模工業化生產等優點。
以下將通過實施例對本發明的有關細節作進一步的說明。
實施例1將1500毫升重量百分比為1％的RNA溶液加入150毫升核酸酶P1(酶活力為110u/ml)，於65℃下酶解反應2小時，過濾，超濾去除固體顆粒和蛋白，用6N HCl調節濾液的pH至1.5，其中，含5』-AMP 2.3克，5』-GMP 3.2克，5』-CMP 2.3克，5』-UMP2.4克，然後按序流過串聯的四根離子交換柱，線速度為0.36m/h；
柱1、2的尺寸為φ27×800mm，分別裝填再生過的0.01×7強酸陽離子樹脂(H型)400毫升，柱3、4的尺寸為φ16×700mm，柱3裝填再生過的D301弱鹼陰離子樹脂(OH型)80毫升，柱4裝填再生過的201×8強酸陰離子樹脂(Cl型)100毫升。
上柱完畢，用1000毫升pH值為1.5的水洗柱，使殘留在柱1、2和3中的5』-UMP能全部進入柱4。
然後用500毫升0.1NHCl-3％NaCl溶液洗滌柱4，收集洗滌液80毫升，其中含5』-UMP2.3克；將柱3與柱2斷開，用去離子水洗滌柱1、2，從柱2中先收集含5』-GMP部分的溶液1600毫升，其中含5』-GMP2.9克；然後收集含5』-CMP部分的溶液2000毫升，其中含5』-CMP2.1克；再用水洗滌柱1，收集柱1的流出液1600毫升，其中含5』-AMP2.1克。
5』-核苷酸分離總收率為92.1％，其中，5』-AMP2.1收率為91.3％，5』-GMP為90.6％，5』-CMP為91.3％，5』-UMP為95.8％。
將上述的收集的各部分溶液分別通過濃縮、乙醇沉澱、乾燥後，可獲得1.92克5』-AMP，3.46克5』-GMP(鈉鹽含15％結晶水)，1.89克5』-CMP，3.12克5』-UMP(鈉鹽含25％結晶水)，其含量均為98％以上。
實施例2將2000毫升，pH=1的酶解液(其中，含5』-AMP2.7克，5』-GMP3.4克，5』-CMP2.5克，5』-UMP3.0克)，按序流過串聯的四根離子交換柱，線速度為0.6m/h；柱1、2的尺寸為φ27×700mm，分別裝填再生過的Amberlite IR-120(120目)強酸陽離子樹脂(H型)，柱1裝填450毫升，柱2裝填400毫升，柱3、4的尺寸為φ16×700 mm，柱3裝填再生過的D301弱鹼陰離子樹脂(OH型)80毫升，柱4裝填再生過的Amberlite IRA-401(120目)強酸陰離子樹脂100毫升。
上柱完畢，用1000毫升pH值為1.5的水洗柱，使殘留在柱1、2和3中的5』-UMP能全部進入柱4。
然後用300毫升pH 0.1NHCl-3％NaCl溶液洗滌柱4，收集洗滌液85毫升，其中含5』-UMP2.72克。收率為90.6％；將柱3與柱2斷開，用去離子水洗滌柱1、2，從柱2中先收集含5』-GMP部分的溶液1200毫升，其中含5』-GMP3.1克，收率91.1％；然後收集含5』-CMP部分的溶液1800毫升，其中含5』-CMP2.3克，收率92.0％；再用水洗滌柱1，收集柱1的流出液2000毫升，其中含5』-AMP2.53克，收率90.0％。
將上述的收集的各部分溶液分別通過濃縮、乙醇沉澱、乾燥後，可獲得2.2克5』-AMP，3.7克5』-GMP(鈉鹽含15％結晶水)，2.1克5』-CMP，3.7克5』-UMP(鈉鹽含25％結晶水)，其含量均為98％以上。
權利要求
1．一種從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法，其特徵在於，通過陽陰離子交換樹脂的有序排列組合，一次分離純化得到高純度單核苷酸，依次包括如下步驟①含有四種5』-核苷酸核的RNA酶解液按序流過兩根強酸陽離子交換樹脂柱(1)和(2)、一根弱鹼大孔陰離子交換樹脂柱(3)、一根強鹼陰離子交換樹脂柱(4)；②用酸性氯化鈉溶液洗脫強鹼陰離子交換樹脂柱(4)，收集流出的含有5』-UPM的溶液；③用去離子水洗滌兩根強酸陽離子交換樹脂柱(1)和(2)，在第二根強酸陽離子交換樹脂柱(2)處先收集純度較高的5』-GMP溶液，然後收集5』-CMP溶液；④用去離子水洗滌第一根強酸陽離子交換樹脂柱(1)，在第一根強酸陽離子交換樹脂柱(1)的底部收集純度較高的5』-AMP溶液；採用常規的精製方法分別對收集的溶液進行處理，即可獲得所說的四種5』-核苷酸。
2．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，上柱完畢後，用pH為1-2的水充分淋洗。
3．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，上柱線速度為0.36-0.72米/小時。
4．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，上柱的RNA酶解液的pH為1-2。
5．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，酸性氯化鈉溶液的用量為柱(4)樹脂體積的2-3倍。
6．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，用去離子水洗滌兩根強酸陽離子交換樹脂柱(1)和(2)時，去離子的用量為柱(1)和(2)樹脂體積的10-12倍；用去離子水洗滌第一根強酸陽離子交換樹脂柱(1)時，去離子的用量為柱(1)樹脂體積的4-5倍。
7．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所說的陽離子交換樹脂為732、0.01×7或Amberlite IR-120強酸性苯乙烯陽離子交換樹脂中的一種，柱(3)所用的陰離子樹脂D301或Amberlite IRA-93，柱(4)所用的陰離子樹脂為717、201×8、Amberlite IRA-401或Iewatit M500強鹼性苯乙烯陰離子交換樹脂中的一種。
8．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所說的酸性氯化鈉溶液其pH值為1-2。
9．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，上柱總量為陽樹脂總交換量的1.6％-2.4％，柱1和柱2的比例為1-(1.3∶1)；陰柱上樣總量為強鹼性陰離子交換總量的5％-10％，柱3和柱4的比例為1-(1.3∶1)。
10．如權利要求9所述的方法，其特徵在於，上柱總量為陽樹脂總交換量的1.9-2.1％；陰柱上樣總量為強鹼性陰離子交換總量的7-8％。
全文摘要
本發明提供了一種從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法。本發明通過陽陰離子交換樹脂的有序排列組合,一次分離純化得到高純度單核苷酸。本發明採用二根陽離子交換樹脂柱、一根大孔弱鹼陰離子交換樹脂柱和一根弱鹼陰離子交換樹脂柱,將酶解液串聯上柱,分段洗滌,一次性高收率地分離出純度為98%以上的核苷酸。本發明公開的方法,收率高、分離效果好、所得產品純度高,產品不易汙染,適合大規模工業化生產。
文檔編號C07H1/00GK1286259SQ00119589
公開日2001年3月7日 申請日期2000年8月10日 優先權日2000年8月10日
發明者邱蔚然, 丁慶豹, 高淑紅, 謝勝 申請人:華東理工大學, 山東雙鳳股份有限公司