一種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法及其在菌種製備的應用的製作方法
2023-06-02 00:44:11 1
一種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法及其在菌種製備的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法及其在菌種製備的應用，該方法使用四角法將不同菌株來源的菌絲塊交叉接種於平板培養基的四角位置，待菌絲雜交形成融合菌絲時，將融合菌絲轉接於微鹼性培養基，並於低溫黑暗條件下培養可獲得大量羊肚菌菌核，該菌核可用於保存或者羊肚菌的母種、栽培種製作。使用四塊菌絲塊相互雜交融合的四角接種法保障了異核菌絲的高效生產，使用該菌絲並結合低溫、微鹼性的培養條件又保障了羊肚菌菌核的高產與穩產。
【專利說明】—種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法及其在菌種製備的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種羊肚菌菌種製作和菌核培養技術，特別涉及一種優化的菌絲雜交融合操作技術、菌核的高效培養方法及其在菌種製備的應用。
【背景技術】
[0002]羊肚菌Morchella esculenta (L.) Pers 隸屬於羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，是國際著名的珍貴食用菌，世界暢銷，是中國主要出口到法國等歐洲國家的食用菌產品。並且隨著德、法、意、美等國家對羊肚菌的需求量增大，其價格不斷攀升。
[0003]羊肚菌最早記載於《本草綱目》，在我國利用的歷史悠久。現代科學發現羊肚菌中富含蛋白質、脂肪酸和碳水化合物，特別是多種稀有胺基酸(如順-3-氨基-L-脯氨酸、2-氨基異丁酸、2，4-三氨基異丁酸等)、礦質元素(鉀、磷、鎂、鈣、鐵、鋅、銅、錳等)和多種維生素(硫胺素、核黃素、尼古酸、泛酸、葉酸、吡哆醇、生物素、抗壞血酸、VB12)等成分賦予了羊肚菌獨特的風味和營養價值，成為國際餐飲中的高檔食材。並且，羊肚菌食藥同源，現代醫學研究表明，羊肚菌能夠補腎、補腦、壯陽、提神、降血脂、抗腫瘤等作用。另外，羊肚菌可用於泡酒原料，其液體發酵培養物又可用於調味品的生產等，故其在食品、保健品、醫藥化工等多領域有著廣闊的應用前景。
[0004]目前，中國出口的羊肚菌大多採於自然野生，其遠遠不能滿足國內與國際市場的需求，並且野生資源的過度採集造成其產量急劇減少，極大破壞了羊肚菌的生物多樣性。因此，羊肚菌的人工或半人工栽培技術一直是國際食用菌研究的熱點，栽培試驗偶有成功，但其重複性差，出菇不穩定，至今不能進行成熟的商業化栽培。
[0005]多年的科學研究表明，在羊肚菌的生活史中，菌核的形成是生長子實體(即出菇)的必經階段，而使用雜交菌絲培養出的菌核進行大田中栽培實驗最易生長出子實體。實踐生產中發現，人工培育羊肚菌菌種時缺乏規範統一且科學高效的菌種雜交方法，並且在菌種製作過程中培養條件的不適宜性經常導致菌種不形成菌核或者菌核消失，造成羊肚菌減產甚至絕收，這是目前羊肚菌(半)人工栽培試驗不穩定的兩個重要原因。
[0006]提供一種優化、高效的羊肚菌雜交菌的菌核多產、穩產培養方法以及雜交菌種製作技術，是本發明力圖解決的問題。
【發明內容】
[0007]本發明的一個目的就是針對羊肚菌制種過程中的雜交效率不高、栽培試驗中菌核形成不穩定的不足，提供一種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法，該方法操作簡便、集約、快捷，菌絲雜交效率高，保障了羊肚菌融合菌絲的獲得；進一步根據羊肚菌的生長發育習性，設計了低溫、微鹼性的培養環境，能夠大量培養出羊肚菌菌核，一定程度上保障了羊肚菌大田栽培的成功出菇。
[0008]本發明的技術目的是通過如下方案來實現的: 一種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法，包括以下步驟:
將不同羊肚菌菌株來源的菌絲塊交叉接種於平板培養基的周邊，待菌絲雜交形成融合菌絲時，將融合菌絲轉接於微鹼性培養基，並於低溫黑暗條件下培養，得到羊肚菌雜交菌的菌核。
[0009]優選的，本發明中，微鹼性培養基的pH值為7.5-8.5,低溫暗黑條件下培養的培養溫度為10_15°C。培養基pH過高或過低都會降低菌絲生長速度以及減少菌核的形成數量。溫度過低影響菌絲生長速度，溫度過高不利於形成菌核。
[0010]採用培養基PH7.5-8.5，培養溫度10_15°C的環境，有利於羊肚菌形成更多穩定的菌核體，減少了以往羊肚菌培養過程中的菌核不形成或者菌核消失退化現象，進而降低了農業損失。
[0011]所述菌絲塊可以通過如下方法獲得，(I)使用羊肚菌成熟的野生或栽培菌菇的孢子或組織塊於培養基上20-25 V條件下進行萌發和菌絲純化；此處培養基為PDA培養基，配方為:馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，磷酸二氫鉀3克，硫酸鎂I克，VBi 50微克，水1000毫升，pH自然；其製作方法為:將馬鈴薯去皮，稱重，切成小塊，放入燒杯內，800毫升水加熱煮沸30分鐘左右，煮至馬鈴薯塊熟而不爛。然後用雙層紗布過濾，取其濾液，加入瓊脂，再加熱煮沸使瓊脂溶解，邊煮沸邊攪拌，防止液體溢出。待瓊脂完全溶化後，加入葡萄糖，加熱攪拌讓葡萄糖完全溶解。最後補足水分，使其達到1000毫升。趁熱分裝入試管和三角瓶中，防止凝固。試管加綿塞，三角瓶加封口膜。分裝好的培養基，及時於高壓鍋內滅菌，放氣三次以排除鍋內冷空氣，0.147兆帕左右滅菌30-40分鐘，停止加熱，待鍋內壓力指針歸零時且溫度達90 V以下後，打開鍋蓋取出培養基。試管斜放冷卻製作斜面培養基。三角瓶內培養基於無菌工作檯內製作平板培養基。
[0012]孢子的萌發與菌絲純化步驟為:於無菌工作檯內將孢子的雙蒸水懸液用接種環蘸取後於平板培養基上劃線接種；然後於20-25 V黑暗培養，待菌絲長到2-5 cm左右時，切取尖端菌絲並轉接在另一培養基上培養，連續轉接至少兩次後，獲得純化的羊肚菌菌絲塊。
[0013]菌菇組織塊的萌發與菌絲純化步驟為:於無菌工作檯內將去掉菌柄基部的剛成熟的羊肚菌子實體，在酒精火焰上方橫切開，於子實體內腔表面削取黃豆大小的組織，放在平板培養基上於20-25 V黑暗培養，待菌絲長到2-5 cm左右時，切取尖端菌絲並轉接在另一培養基上培養，連續轉接至少兩次後，獲得純化的羊肚菌菌絲塊。
[0014]優選的，所述羊肚菌菌株為兩種，尤其可以為野生種菌株和栽培種菌株，每種菌株的菌絲塊各自為兩塊，接種方式是將兩類菌絲塊，交叉接種於同一平板培養基的四角位置，並置於20-25°C的黑暗條件下培養，待菌絲塊萌生的次生菌絲於平板中間位置重疊、融合後，切取融合菌絲塊轉接於微鹼性斜面培養基上進行菌核培養或保存。
[0015]優選的，培養羊肚菌雜交菌菌核時，所用菌絲塊為四塊。當所用菌絲塊低於四塊時，雜交融合效率低；高於四塊時，雜交融合效率沒有明顯提升，且操作繁瑣，容易染菌。
[0016]本發明的另外一個目的是提供羊肚菌雜交菌的菌核在製備羊肚菌母種和栽培種上的應用，其方法參照現有技術即可。
[0017]本發明的有益效果:
本發明的方法操作簡便、集約、快捷，有效保障了羊肚菌融合菌絲的獲得；進一步根據羊肚菌的生長發育習性，設計了低溫、微鹼性的培養環境，能夠大量培養出羊肚菌菌核，一定程度上保障了羊肚菌大田栽培的成功出菇。
[0018]說明書附圖
圖1:製作融合菌絲的平板培養基四角接種法示意圖，圖中，I表示平板培養基；2與3表示來源於不同菌株的羊肚菌菌絲塊。
【具體實施方式】
[0019]實施例一:
1、在無菌操作臺內，將採於四川省綿陽市北川縣的羊肚菌的野生菌菇成熟乾燥孢子接種於平板培養基上(90mm直徑培養皿，PDA培養基，pH值自然；下同)，於25 V黑暗培養。
[0020]2、羊肚菌孢子暗培養2天後切取2 cm左右的菌絲尖端，轉接在另一培養基上培養，連續3次轉接獲得純化的羊肚菌菌種。貼標籤後於4 V保存。
[0021]3、於新的平板培養基上，圍繞中心點星狀均勻地分別接種1-8塊菌絲塊(相鄰菌絲塊為來源不同的菌株)，於25 V黑暗培養。每個菌絲塊數目做20個重複的平板培養。
[0022]4、待菌絲長滿平板且培養基全部呈現褐色時，於平板中心、菌絲塊組成的圓環環1/2半徑內隨機挑取50個菌絲，於顯微鏡下觀察記錄融合菌絲的數量，並計算其佔菌絲數量的比例，以20個重複實驗的平均值作記錄結果。
[0023]5、統計結果(見表I)顯示:同一塊培養基平板上接種1-3塊菌絲塊時，獲得羊肚菌融合菌絲的比例小於33%。接種多餘4-8塊菌絲塊時的菌絲融合效率為63.09%?66.00%,沒有顯著差異性，但其都明顯優於I?3塊菌種塊的融合效果；相比於5塊以上的接種塊，在平板培養基四角分別接種羊肚菌的「四角接種法在獲得高表達量融合菌絲的同時，能夠節約菌種用量、減少染菌風險，更值得實踐中推廣應用。
表I雜交接種菌絲塊數目對菌絲融合效率的影響
菌絲塊數目(塊)融合菌絲比例(%)
17.55
216.41
332.83
[0024]--
463.09
565.21
665.22
766.04
866.00
實施例二:
1、於無菌操作臺內，將同源的融合菌絲塊分別接種於PH4.0?11.0的PDA斜面培養基上(18mmX20cm試管,含約1ml培養基；下同)，菌絲塊大小相近，相同pH值的培養基接種20管。
[0025]2、將斜面培養基置於25 V黑暗條件下，觀察記錄羊肚菌的菌核形成數量，並於顯微鏡下測定菌核的直徑。
[0026]3、統計結果顯示(見表2):PDA培養基的pH值對羊肚菌菌核的形成數量和直徑大小具有明顯的影響作用。PH4.0的酸性條件中幾乎不能生長羊肚菌，而pH大於10.0的培養基也不利於羊肚菌的生長。相較於其他酸鹼性值，PH7.5~8.5的PDA培養基上能夠在接種第二周和第三周生長出更多的羊肚菌菌核，在大田實踐栽培中將更利於出菇。
[0027]表2培養基pH值對羊肚菌菌核形成的影響
【權利要求】
1.一種羊肚菌雜交菌的菌核培養方法，其特徵在於:包括以下步驟:將不同羊肚菌菌株來源的菌絲塊交叉接種於平板培養基的周邊，待菌絲雜交形成融合菌絲時，將融合菌絲轉接於微鹼性培養基，並於低溫黑暗條件下培養，得到羊肚菌雜交菌的菌核。
2.根據權利要求1所述的羊肚菌雜交菌的菌核培養方法，其特徵在於:所述羊肚菌菌株為兩種，每種菌株的菌絲塊各自為兩塊，接種方式是將兩類菌絲塊交叉接種於同一平板培養基的四角位置，並置於20-25°C的黑暗條件下培養，待菌絲塊萌生的次生菌絲於平板中間位置重疊、融合後，切取融合菌絲塊轉接於的微鹼性斜面培養基上進行菌核培養或保存。
3.根據權利要求2所述的羊肚菌雜交菌的菌核培養方法，其特徵在於:所述微鹼性斜面培養基的pH值為7.5-8.5。
4.根據權利要求1所述的羊肚菌雜交菌的菌核培養方法，其特徵在於:所述低溫黑暗條件的溫度為10-15°C。
5.一種羊肚菌雜交菌的菌核在製備羊肚菌母種和栽培種上的應用。
【文檔編號】A01G1/04GK104170653SQ201410432139
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】秦小波, 高繼海, 彭天祥, 時小東, 張國珍 申請人:四川省自然資源科學研究院, 高繼海