用於生產莫納甜和其前體的多肽和生物合成途徑的製作方法

2023-06-01 09:13:26 1

專利名稱：用於生產莫納甜和其前體的多肽和生物合成途徑的製作方法
技術領域：
本發明提供了可用於生產吲哚-3-丙酮酸、2-羥基2_(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)和/或莫納甜的多肽和生物合成途徑。
背景技術：
吲哚丙酮酸吲哚-3-丙酮酸是一種強效抗氧化劑，相信它抵消了氧氣濃度高的組織中的氧化應激(Politi 等色氨酸研究的最近進展」(Recent advances in Tryptophan research),G.A.Filippini等編,普利諾出版社(Plenum Press),紐約，1996,第291-8頁)。卩引哚丙酮酸也是作為主要的植物生長激素生長素(可擴散的生長促進因子)的吲哚-乙酸(IAA)的產生途徑中的中間物。在生理過程包括頂端優勢、向性、紙條伸長、誘導形成層細胞分裂和生根中，亞微克量的IAA是有活性的。園藝中用合成生長素誘導生根並促進果實形成和發育。在高濃度時，合成生長素是有效的闊葉植物除草劑。可認為，通過發酵生產的天然生長素比化學生產的除草劑對環境更友好。1999年生長調節劑的全球銷售額為4億英鎊(14億美兀)。關於吲哚乙酸和其 衍生物的專利的一些例子包括:美國專利5，843，782 「薔薇科植物的微體繁殖，用於培養基的生長素(Micropropagation of rose plants, auxin usedinculture medium) 」和美國專利5，952，231 「薔薇科植物的微體繁殖(Micropropagationofrose plants)」。除了植物相關用途以夕卜，吲哚乙酸還用於藥物應用。例如，美國專利號5，173，497 「 α -氧代吡咯並[2，3-Β]吲哚乙酸和衍生物的製備方法(方法preparingalpha-oxopyrrolo [2, 3-B] indole acetic acids and derivatives)，，提出，用這些化合物治療記憶損傷，如伴隨阿爾茨海默病和老年性痴呆的記憶損傷。美國專利號5，173,497中提出的機制是這些化合物抑制乙醯膽鹼酯酶並提高大腦中的乙醯膽鹼水平。通過過氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸產生吲哚-3-甲醇，且可容易地轉化成二吲哚甲烷。據報導，兩種化合物能夠消除毒素並促進產生有益於女性健康的激素。色氨酸衍生物氯化D-色氨酸被鑑定為非營養性甜味劑，對探索其它衍生物的興趣持續增加。
莫納甜是組成類似於胺基酸色氨酸的天然甜味劑。它可提取自南非灌木似冬青葉硬木朔(Sclerochiton ilicifolius)的根皮，作為高強度甜味劑在食品和飲料工業中有前途。關於莫納甜的專利的一些例子包括:美國專利號5，994，559 「合成莫納甜-高強度天然舌甘味劑，，(Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener);美國專利號 4，975，298 "3-(1-氨基-1, 3- 二羧基-3-羥基-丁 -4-基)_ 吲哚化合物」 (3-(l_amino-l, 3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-1ndole compounds);美國專利號 5, 128, 164 「含有3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基-丁-4-基)-吲哚化合物的供人類消費的組合物，，(Compositionfor human consumption containing3- (1-amino-l, 3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) -1ndolecompounds)和美國專利號 5, 128, 482 「生產 3-1 (1-氨基-1, 3- 二羧基-3-輕基-丁-4-基)口引哚的方法」(Process for the production of3_l (1-amino-
1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole)。本文所述的一些莫納甜前體也可用作合成甜味劑或合成莫納甜衍生物的中間體。發明概述本發明提供了由葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或通過莫納甜前體如吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸製備莫納甜的幾種生物合成途徑。公開了可用於製備莫納甜、吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的多肽和核酸序列。為了簡明，無論在說明書和權利要求書中的什麼地方提到形成的中間體/產物(如莫納甜或莫納甜前體)，只要合理均可包含術語「和/或其鹽」。換言之，例如，術語「將吲哚-3-丙酮酸轉變為莫納甜前體」應理解為「將吲哚-3-丙酮酸轉變為莫納甜前體和和/或其鹽」。實際上，本領域普通技術人員應理解，在所示的反應條件下，實際上存在或也存在中間體/產物的鹽。可通過包含一種或多種合適底物和一種或多種所選多肽的反應混合物發生反應來生產莫納甜。合適底物可包括但不限於:葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、莫納甜前體(如吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸)和其混合物。可將用於生產莫納甜的反應混合物中存在的合適底物加入反應混合物和/或可以在反應混合物中原位生產所述合適底物。可將所選多肽加入反應混合物中和/或可以由反應混合物中存在的微生物生產(例如用表達所選多肽的微生物發酵該反應混合物)。可通過吲哚-3-丙酮酸、2-羥基2_(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸(莫納甜前體，MP，莫納甜的α酮形式)、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖來產生莫納甜(

圖1)。產生或製造莫納甜或其中間體的方法見圖1-3和11-13，包括將底物轉化為第一種產物，然後將第一種產物轉化為第二種產物，等等，直到產生所需終產物。圖1-3和11-13在方框中顯示了可能的中間產物和終產物。例如，可用這些方法進行一種產物到另一種產物的轉化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到ΜΡ、ΜΡ到莫納甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。可用化學方法或生物學方法促進這些轉化。術語「轉化」指在將第一種中間體轉變成第二種中間體的反應中使用化學方法或多肽。術語「化學轉化」指不由多肽主動促進的反應。術語「生物轉化」指由多肽(如酶)主動促進的反應。轉化可在體內或體外發生(如用合適微生物發酵營養肉湯)。當使用生物轉化時，多肽和/或細胞能固定於支持物如化學附著於聚合物支持物上。可用本領域普通技術人員已知的任何反應器，例如在分批或連續反應器中完成轉化。 也提供了方法，包括使第一種多肽接觸底物，製造第一種產物，然後使產生的第一種產物接觸第二種多肽，產生第二種產物，然後使產生的第二種產物接觸第三種多肽，產生第三種產物，例如莫納甜。所用多肽和所產生的產物見圖1-3和11-13。公開了可用於進行圖1-3和11-13中所示轉化的多肽及其編碼序列。在一些實施例中，具有一個或多個改變多肽的底物特異性和/或活性的點突變的多肽可用來製造莫納甜。公開了產生莫納甜的分離和重組細胞。這些細胞可以是任何細胞，如植物、動物、細菌、酵母、藻類、古菌或真菌細胞。這些細胞可用於通過發酵含有該細胞的營養培養基合成莫納甜。所述營養培養基可包含用於合成莫納甜的任何合適分子，包括但不限於:葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或莫納甜前體如吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-yl甲基)-4-酮戊二酸。在具體實施例中，公開的細胞包括一種或多種以下活性，例如兩種或多種或者三種或多種以下活性:色氨酸轉氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族胺基酸)轉氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無 EC 號，Hadar 等，J.Bacterioll25:1096-1104,1976 和 Furuya 等，BiosciBiotechnol Biochem64:1486-93，2000)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2._)、D-色氨酸轉氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國際維生素B6和擬基催化討論會會議錄》(Proceedings of 8th International Symposium onVitamin B6 andCarbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4)和亮氨酸(支鏈)脫氫酶(EC1.4.1.9)。在另一實施例中，細胞包括一種或多種，例如兩種或多種、三種或多種以下活性:吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1. 1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3_(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28,1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3._)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、酪氨酸(芳族胺基酸)轉氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉氨酶(EC2.6.1._)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、支鏈轉氨酶(BCAT，EC2.6.1.42)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、亮氨酸(支鏈)脫氫酶(EC1.4.1.9)、D_胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D_色氨酸轉氨酶和/或D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)。此外，公開的細胞可包括一種或多種以下活性，如兩種或多種或者三種或多種以下活性:色氨酸轉氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族胺基酸)轉氨酶伍02.6.1.5)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無EC編號)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3_(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28,1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、支鏈轉氨酶(BCAT，EC2.6.1.42)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、，亮氨酸(支鏈)脫氫酶(EC1.4.1.9)和/或D-色氨酸轉氨酶。能生產莫納甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨酸和/或吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物轉化成吲哚-3-丙酮酸；本領域技術人員理解選擇用於此步驟的多肽理想地表現出適當特異性)，所得吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽，其中第2種多肽將吲哚-3-丙酮酸轉化成2-羥基2-(吲哚-3基甲基)-4_酮戊二酸(MP)，MP接觸第3種多肽，其中第3種多肽將MP轉化成莫納甜。能用於這些轉化的示範多肽示於圖2和3。本發明另一方面提供了組合物如MP，含有在至少一種外源核酸序列上編碼的至少兩種多肽、或有時至少三種或至少四種多肽的細胞。通過以下詳述和說明性實施例將明白本發明的這些和其它方面。附圖簡要說明圖1顯示用於生成莫納甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑。一種途徑通過色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一種通過吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。隨後通過2-羥基2-(吲哚-3基甲基)-4_酮戊二酸(MP)中間體生成莫納甜。框中所示化合物是底物和生物合成途徑中生成的產物。與箭頭相鄰的組合物是輔因子或可在底物轉化成產物期間使用的反應物。所用輔因子或反應物取決於生物 合成途徑的特定步驟使用的多肽。輔因子PLP(批哆醛5』-磷酸)能催化不依賴於多肽的反應，因此僅提供PLP可從底物進行到產物。圖2是使用MP中間體的生物合成途徑的更詳細圖。框中顯示了途徑中各步驟的底物。允許在底物之間發生轉化的多肽列於底物間的箭頭附近。各多肽通過其常用名稱和酶分類(EC)號描述。圖3顯示將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑的更詳細圖。框中顯示了底物，而允許在底物之間發生轉化的多肽列於底物間的箭頭附近。各多肽通過其常用名稱和酶分類(EC)號描述。圖4顯示一種經化學方法產生MP的可能反應。圖5A和5B是色譜圖，顯示酶法生成的莫納甜的LC/MS鑑定。圖6是酶法合成的莫納甜的電噴射質譜。圖7A和7B顯示了酶混合物中生成的莫納甜的LC/MS/MS子離子分析色譜圖。圖8是色譜圖，顯示酶法生成莫納甜的高分辨質譜測量。圖9A-9C是色譜圖，顯示(A) R-色氨酸、⑶S-色氨酸和(C)酶法生成莫納甜的手性分離。圖10是柱狀圖，顯示IPTG誘導後細菌細胞中生成的莫納甜的相對量。(_)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。圖11-12是示意圖，顯示用於增加莫納甜產量的途徑，莫納甜產生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
圖13是示意圖，顯示能用於增加莫納甜產量的途徑，莫納甜產生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。序列表所附序列表中列出的核酸和胺基酸序列是用標準字母縮寫(核酸鹼基)和三字母編碼(胺基酸)表示的。只顯示各核酸序列的一條鏈，但參照所示鏈應理解包括互補鏈。SEQ ID NO:1和2分別顯示來自苜猜根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的轉氨酶(tatA基因，在文獻中稱為酪氨酸轉氨酶或芳族胺基酸轉氨酶)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:3和4分別顯不來自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的酪氨酸轉氨酶(2.4.1)(與基因組軟體預測為「天冬氨酸轉氨酶」的tatA(SEQ ID NO:1和2)同源)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:5和6分別顯示來自類球紅細菌(35053)(新穎，根據2.4.1序列SEQIDNO:3和4克隆)的轉氨酶的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:7和8分別顯示來自碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的廣譜底物轉氨酶(bsat)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:9和10分別顯示來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的芳族胺基酸轉氨酶(araT)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO: 11 和 12 分別顯不來自食澱粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)的芳族胺基酸轉氨酶(araT)(通過同源性鑑定為芳族胺基酸轉氨酶)的新核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:13和14分別顯示來自類球紅細菌(35053)的多底物轉氨酶(msa)(通過與登錄號AAAE01000093.1，bpl4743_16155和登錄號ZP00005082.1同源鑑定為多底物轉
氨酶)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:15和16顯示用於克隆枯草芽孢桿菌D-丙氨酸轉氨酶(dat)序列的引物。SEQ ID NO:17和18顯示用於克隆苜蓿根瘤菌tatA序列的引物。SEQ ID NO:19和20顯示用於克隆枯草芽孢桿菌araT轉氨酶序列的引物。SEQ ID NO:21和22顯示用於克隆類球紅細菌(2.4.1和35053)多底物轉氨酶序列的引物。SEQ ID NO:23和24顯示用於克隆碩大利什曼原蟲bsat序列的引物。SEQ ID NO:25和26顯示用於克隆食澱粉乳桿菌araT序列的引物。SEQ ID NO:27和28顯示用於克隆類球紅細菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物。SEQ ID NO:29和30顯示用於克隆大腸桿菌aspC序列(基因序列Genbank登錄號:AE000195.1，蛋白質序列Genbank登錄號:AAC74014.1)的引物。SEQ ID NO:31和32分別顯示來自大腸桿菌的芳族胺基酸轉氨酶(tyrB)的核酸和胺基酸序列 。SEQ ID NO:33和34顯示用於克隆大腸桿菌tyrB序列的引物。SEQ ID NO: 35-40顯示用於克隆具有4_羥基-2-酮戊二酸醛縮酶(KHG)(EC4.1.3.16)活性的多肽的引物。
SEQ ID NO:41和42顯示來自大腸桿菌的色氨酸酶(tna)基因和來自弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)的酪氨酸-酹裂合酶(tpl)基因的核酸序列，它們分別編碼蛋白質 P00913(G1:401195)和 P31013 (G1:401201)。SEQ ID NO:43_46顯示用於克隆色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶(酪氨酸酚_裂合酶)多肽的引物。SEQ ID NO:47_54顯示用於使色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶多肽突變的引物。SEQ ID NO:55_64顯示用於克隆具有4_羥基_4_甲基_2_酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)活性的多肽的引物。SEQ ID NO:65和66顯示來自睪丸酮叢毛單胞菌的4_羥基_4_甲基_2_酮戊二酸醛縮酶(ProA)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:67_68顯示用於在pET30Xa/LIC中具有大腸桿菌aspC的操縱子中克隆睪丸酮叢毛單胞菌4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶(ρι.οΑ)的引物。SEQ ID NO:69_72顯示用於在pESC-his中克隆大腸桿菌aspC和睪丸酮叢毛單胞菌proA的引物。

SEQ ID NO:73_74顯示加到用於克隆本文所公開基因的引物5』端的序列。SEQ ID NO:75和76分別顯示HEX基因和基因產物的核酸和胺基酸序列(NCBI登錄號1AHF_AG1: 1127190) (HEXAspC氨基轉移酶胺基酸序列)。SEQ ID NO:77和78顯示用於克隆大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶(aspC)或突變的aspC轉氨酶(HEX)基因序列的引物。SEQ ID NO:79和80顯示用於克隆大腸桿菌酪氨酸轉氨酶(tyrb)的引物。SEQ ID NO:81和82顯示用於克隆運動發酵單胞菌(Z.mobilis)的khg基因的引物。SEQ ID NO:83和84分別顯示了運動發酵單胞菌khg基因(登錄號:AE008692.1G1: 56542470)和基因產物(登錄號:AAV89621.1G1: 56543467)的核酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:85_86 顯示用於克隆以 G1: 48994873 鹼基 2496317-2495079 保藏於NCBI的大腸桿菌yf dZ基因序列的引物，該基因序列編碼蛋白G1: 1788722 (蛋白質IDAAC75438.1)。SEQ ID NO:87和88分別顯不來自豌豆根瘤菌(Rhizobium Ieguminosarum)香豆生物型rhiz23g02-plk_1009_341 (桑格研究所(Sanger Institute))的醒縮酶的核酸和氨
基酸序列。
具體實施方式
的詳述縮寫和術語提供下列術語和方法的解釋以更好地描述本說明書並指導本領域普通技術人員實踐本發明。如本文所用，「含有」指「包括」。此外，除非上下文另有明確規定，單數形式「一個」或「一種」或「這種」也包括複數。例如，提到「含有一種蛋白質」包括一種或多種這樣的蛋白質，提到「含有這種細胞」包括一種或多種細胞以及本領域技術人員已知的它的等價物，等等。術語「約」包括發生於任何測定中的實驗誤差的範圍。除非另有說明，假定所有的測定數字前面都有「約」字，即使沒有明顯地使用「約」字。
除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同。雖然類似於或等同於本文所屬方法和材料和方法和材料可用於實施或測試本發明，但下面描述了合適的方法和材料。材料、方法和實施例僅為說明性，不應為限制性。通過以下詳述和權利要求書可看出本發明的其它特徵和優點。cDNA(互補DNA):缺少內部非編碼節段(內含子)和決定轉錄的調節序列的一段DNA。可在實驗室中通過提取自細胞的信使RNA逆轉錄合成cDNA。保守取代:用一種胺基酸取代多肽中的另一種胺基酸，該取代對多肽活性影響很小或無影響。如果交換的胺基酸似乎在結構或功能上相似，則認為該取代是保守取代。例如，包含一個或多個保守取代的色氨酸轉氨酶多肽理想地保持色氨酸轉氨酶活性。可通過用，例如標準方法如定位誘變或PCR或本領域已知的其它方法來操作編碼該多肽的核苷酸序列來產生含有一個或多個保守取代的多肽。可用來取代蛋白質中原始胺基酸、並且如果對多肽活性影響很小或無影響被認為是保守取代的胺基酸的非限制性例子包括:用絲氨酸或蘇氨酸取代丙氨酸；用穀氨醯胺、組氨酸或賴氨酸取代精氨酸；用穀氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸取代天冬醯胺；用天冬醯胺、穀氨酸或穀氨醯胺取代天冬氨酸；用絲氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；用天冬醯胺、穀氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代穀氨醯胺；用天冬氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸或精氨酸取代穀氨酸；用脯氨酸取代甘氨酸；用天冬醯胺、賴氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、酪氨酸取代組氨酸；用亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代異亮氨酸；用異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；用天冬醯胺、穀氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、精氨酸取代賴氨酸；用異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；用蘇氨酸、丙氨酸取代絲氨酸；用絲氨酸或丙氨酸取代蘇氨酸；用苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；用組氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；用甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸取代纈氨酸。關於保守取代的其它信息可參見Ben-Bassat等(J.Bacteriol.169:751-7,1987)、O，Regan 等(Ge ne77:237-51，1989)、Sahin-Toth 等(Protein Sc1.3:240-7，1994)、Hochuli 等(Bio/Technology6:1321-5，1988)、W000/67796 (Curd 等)和遺傳學和分子生物學的標準教科書。衍生:出於說明書和權利要求書的目的，如果發生以下一種或多種事件則稱一種物質「衍生」自生物體或來源:1)該物質存在於該生物體/來源中；2)從天然宿主中取出該物質；或者，3)從天然宿主中取出或者(例如)通過誘變產生該物質。酶學生產:術語「酶學生產」或類似術語如「用酶學方法生產」或「酶學合成」指用至少一種多肽體外(如用一種或多種多肽在試管或反應器中)或體內(如在完整細胞或發酵反應中)生產產物(如莫納甜)。儘管「酶學生產」產物不排除採用化學試劑或反應，但它包括在生產該產物時採用促進至少一種反應的至少一種多肽。外源性:在提到核酸和特定細胞時本文所用術語「外源性」指在天然情況下不是源自該特定細胞的任何核酸。因此，認為在引入細胞時，非天然存在的核酸對細胞來說是外源性的。對於特定細胞而言，天然存在的核酸也可以是外源性的。例如，當將分離自人X的細胞的整個染色體引入人Y的細胞時，它對Y的細胞來說是外源性核酸。功能等效:具有等效功能。在酶中，功能等效的分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通過酶序列中的序列改變來提供功能等效物，其中具有一個或多個序列改變的肽保持了未改變肽的功能，以使其保持酶活性。在具體實施例中，色氨酸轉氨酶功能等效物保持了將色氨酸轉變成吲哚-3-丙酮酸的能力。序列改變的例子包括但不限於:保守取代、缺失、突變、移碼和插入。在一個實施例中，給定多肽與抗體結合，功能等效物是與相同抗體結合的多肽。因此，功能等效物所包括的肽具有與多肽相同的結合特異性並可用作代替該多肽的試劑。在一個實施例中，功能等效物包括結合序列不連續、抗體與線性表位結合的多肽。因此，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO:12的胺基酸1_10)，功能等效物包括不連續的表位，可以是(#=任何數量的間插胺基酸):NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L_C00H。在這個例子中，如果該多肽的三維結構使其可以結合能結合SEQ ID NO:12的胺基酸1_10的單克隆抗體，那麼該多肽與SEQ ID NO:12的胺基酸1_10功能等效。雜交:本文所用術語「雜交」指根據互補的單鏈DNA和/或RNA形成雙鏈體分子的能力來測試兩個核酸分子的核苷酸序列的互補性的方法。在本發明範圍內，核酸雜交技術可用於獲得分離的核酸。簡要說，與SEQ ID NO:11所列序列有一些同源性的任何核酸可用作在中等至高度嚴謹條件下雜交鑑定相似核酸的探針。鑑定後，可純化、測序並分析該核酸，以確定它是否在本發明範圍內。可通過Southern或 Northern分析進行雜交來分別鑑定與探針雜交的DNA或RNA序列。可用生物素、洋地黃毒苷、多肽或放射性同位素如32P來標記探針。可以在瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離待分析的DNA或RNA，轉移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其它合適的膜上，用本領域熟知的標準技術用探針雜交，如Sambrook等(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning),第二版,紐約州普萊恩維尤的冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory, Plainview, NY)的第7.39-7.52節所述。探針的長度一般至少約20個核苷酸。例如，對應於SEQ ID NO:11所列20個毗連核苷酸序列的探針可用於鑑定相同或相似的核酸。此外，可採用長於或短於20個核苷酸的探針。本公開也提供了長度至少約為12個鹼基(如，長度至少約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000個鹼基)並
且在雜交條件下與具有SEQ ID NO:11所列核酸序列的正義或反義鏈雜交的分離核酸序列。雜交條件可以是中等或高度嚴謹的雜交條件。就本公開目的而言，中等嚴謹的雜交條件意味著在約42 °C下在含有25mMKP04(pH7.4)、5X SSC、5X 鄧氏溶液(Denhart solution)、50 μ g/mL 經超聲處理的變性鮭精DNA、50%甲醯胺、10%葡聚糖硫酸酯和l_15ng/mL探針(約5xl07cpm/ μ g)的雜交溶液中進行雜交，而在約50°C下用含有2X SSC和0.1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進行洗滌。高度嚴謹的雜交條件意味著在約42°C下在含有25mM KPO4 (pH7.4)、5X SSC、5X鄧氏溶液、50 μ g/mL經超聲處理的變性鮭精DNA、50%甲醯胺、10%葡聚糖硫酸酯和l_15ng/mL探針(約5xl07cpm/y g)的雜交溶液中進行雜交，而在約65°C下用含有0.2X SSC和0.1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進行洗滌。分離:本文所用術語「分離」指由其天然宿主中取出的任何物質；該物質不一定經過純化。例如，「分離核酸」指不與來源於天然存在的生物體基因組中直接毗連(一個在5』端，一個在3』端)的序列直接毗連的天然存在的核酸。例如，分離的核酸可以是，但不限於:在天然存在的基因組中，通常發現重組DNA分子側翼的一個核酸序列被去除或不存在的任何長度的重組DNA分子。因此，分離的核酸包括但不限於:以獨立於其它序列的分離分子(如用PCR或限制性內切核酸酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA以及摻入載體、自主複製的質粒、病毒(如逆轉錄病毒載體、腺病毒或皰疹病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA的重組DNA。此外，分離的核酸可包括作為雜交或融合核酸序列的一部分的重組DNA分子。當提及核酸時，本文所用術語「分離」也包括任何非天然存在的核酸，因為在自然中未發現非天然存在的核酸序列，且在天然存在的基因組中非天然存在的核酸序列不具有直接毗連的序列。例如，非天然存在的核酸如工程改造的核酸被認為是分離核酸。可用普通的分子克隆技術或化學核酸合成技術來製造工程改造的核酸。分離的非天然存在的核酸可以獨立於其它序列，或摻入載體、自主複製的質粒、病毒(如逆轉錄病毒載體、腺病毒或皰疹病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA。此外，非天然存在的核酸可包括作為雜交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。再例如，認為cDNA或基因組文庫、或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠片中中數百至數百萬其它核酸分子中存在的核酸不是分離核酸。核酸:本文所用術語「核酸」包括RNA和DNA，DNA包括但不限於cDNA、基因組DNA和合成(如化學合成)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈核酸。其中單鏈核酸可以是正義鏈或反義鏈。此外，核酸可以是環形或線狀。操作性連接:當第一核酸序列與第二核酸序列發生功能性關係時，第一核酸序列「操作性連接」於第二核酸序列。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄，將啟動子操作性連接於編碼序列。通常，操作性連接的DNA序列是毗連的，當需要時可將兩個多肽編碼區連接在相同的閱讀框中。多肽修飾:本公開包括酶，及其合成實施方式。此外，本文所述方法可採用具有所需酶活性的類似物(非 肽有機分子)、衍生物(用所公開的肽序列為起點獲得的化學功能化的肽分子)和變體(同源物)。本文所公開的肽包括可以是L-胺基酸和/或D-胺基酸，天然存在或非天然存在的胺基酸序列。可通過各種化學技術修飾肽，產生活性與未修飾肽基本相同，並任選地具有其它所需特性的衍生物。例如，可以藥學上可接受的陽離子鹽，或酯化形成C1-C16酯，或轉化成式NR1R2的醯胺的形式提供肽的羧酸基團(羧基端或側鏈)，其中R1和R2各自獨立地為H或C1-C16烷基或者結合形成雜環如5-元環或6-元環。肽的氨基(氨基端或側鏈)可以是藥學上可接受的酸加成鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、甲苯磺酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽和其它有機鹽形式，或可被修飾為C1-C16烷基或二烷基氨基或進一步轉化為醯胺的形式。可用熟知技術將肽側鏈的羥基轉化為C1-C16烷氧基或轉化為C1-C16酯。可用一個或多個滷原子如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或這種羧酸的醯胺來取代肽側鏈的苯基或酚環。肽側鏈的亞甲基可以延伸到同源的C2-C4亞烷基中。可用許多良好公認的保護基團中的任何一個，如乙醯胺基團來保護硫醇。本領域技術人員也將認識到將環結構引入本公開肽中以選擇和提供對結構的構象約束，導致穩定性提高。例如，可以向肽加入C-末端或N-末端半胱氨酸，以致當氧化時，該肽將含有二硫鍵，產生環狀肽。其它肽環化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端醯胺和酯。肽模擬物和有機模擬物實施方式也是在本公開範圍之內，這種肽模擬物和有機模擬物的化學組成的三維排列模擬肽骨架和成分胺基酸側鏈的三維排列，導致此公開蛋白的肽模擬物和有機模擬物具有可檢測的酶活性。對於計算機建模應用而言，使藥效團理想化，生物活性的結構要求的三維定義。用當前的計算機建模軟體(採用計算機輔助藥物設計或CADD)，可設計適合各藥效團的肽模擬物和有機模擬物。為了解用於CADD的技術的說明，可參見例如Walters,《藥物的計算機輔助建模》(Computer-Assisted Modeling of Drugs),刊於 Klegerman 和 Groves (編)，《製藥生物技術》(Pharmaceutical Biotechnology), 1993,伊利諾斯州布法羅溝的國際藥物出版社(Interpharm Press, Buffalo Grove, IL),第165-74頁和第 102 章,Munson(編)，《藥理學原理》(Principles of Pharmacology), 1995,Chapman和Hall。用這些技術製備的模擬物也包括在本發明範圍內。在一個實施例中，模擬物模擬酶或其變體、片段或融合所產生的酶活性。ProA醛縮酶:雖然在歷史上「ProA」和/或「ProA醛縮酶」僅用於鑑定獲自睪丸酮叢毛單胞菌的4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶，但本文所用術語「ProA」和/或「ProA醛縮酶」指具有4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶活性的任何多肽，除非另有說明。ProA或ProA醛縮酶的合適例子包括睪丸酮叢毛單胞菌ProA (SEQ ID NO:66)和苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登錄號:CAC46344)，或顯示與睪丸酮叢毛單胞菌ProA (SEQ ID NO:66)和/或苜蓿根瘤菌ProA (NCBI登錄號:CAC46344)同源的酶。例如，合適酶與睪丸酮叢毛單胞菌ProA(SEQ ID NO:66)和/或苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登錄號:CAC46344)的序列相同性可能至少約為 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 和 / 或 99%。探針和引物:可根據本文提供的胺基酸序列和核酸序列容易地製備核酸探針和引物。「探針」包括含有可檢測標記或報導分子的分離核酸。示範性標記包括但不限於:放射性同位素、配體、化學發光劑和多肽。例如，SambiOOk等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第2版,第 1-3卷,冷泉港實驗室出版社(ColdSpring Harbor Laborato ry Press),紐約冷泉港(Cold Spring Harbor, Ν.Υ.), 1989,和Ausubel 等(編)《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols inMolecular Biology),格林出版社和威利國際科學出版社(Greene Publishing andWiley-1nterscience),紐約(定期更新)，1987中討論了標記方法和適合各種目的的標記的選擇指南。「引物」一般是具有10個或更多個核苷酸的核酸分子(如具有約10-100個核苷酸的核酸分子)。引物可通過核酸雜交退火到互補靶核酸鏈上，在引物和靶核酸鏈之間形成雜交體，然後通過例如，DNA聚合酶多肽沿靶核酸鏈延伸。可通過例如，聚合酶鏈反應(PCR)或本領域已知的其它核酸擴增方法將引物對用於擴增核酸序列。例如，在參考文獻如SambiOOk等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版,第 1-3 卷，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarbor Laboratory Press)，紐約冷泉港，1989 ；Ausubel 等(編)，《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology),格林出版社和威利國際科學出版社(Greene Publishing and Wiley-1nterscience),紐約(定期更新)，1987 ;和Innis 等(編)，《PCR 方法:方法和應用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications),學術出版社(Academic Press):聖地牙哥，1990中描述了探針和引物的製備和使用方法。例如，可通過用於此目的的電腦程式如Primer(0.5版, 1991,懷特黑德生物醫學研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research),麻薩諸塞州劍橋(Cambridge, Mass.))從已知序列獲得PCR引物對。本領域技術人員將理解,具體的探針或引物的特異性隨長度而提高，但探針或引物的尺寸範圍是序列全長到短至五個連續核苷酸的序列。因此，例如，20個連續核苷酸的引物可退火到具有特異性高於僅15個核苷酸的相應弓I物的靶上。因此，為了獲得更大的特異性，探針和引物可選自例如:10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050，3100,3150,3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450 或更多個連續核苷酸。啟動子:指導核酸轉錄的一系列核酸控制序列。啟動子包括在轉錄起始位點附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子的情況下的TATA元件。啟動子可包括可位於距轉錄起始位點多達幾千鹼基對的遠端增強子或阻抑元件。純化的:本文所用術語「純化的」不要求絕對純淨；而打算作為相對術語。因此，例如，純化的多肽或核酸製劑可以是主題多肽或核酸的濃度高於它們在生物體天然環境中的濃度或高於取出它們的環境中的濃度的製劑。重組:「重組」核酸是一種具有以下序列的核酸:(1)在表達它的生物體中不天然存在的序列或(2)由兩種分離的、較短的序列人工組合而成的序列。常常用化學合成，更常見的是如用遺傳工程技術人工操作核酸的分離節段來完成此人工組合。「重組」也用於描述已人工操作的，但含有與發現於分離出該核酸的生物體的調節序列和編碼區相同的核酸分子。序列相同性:用序列之間的相似性，或稱為序列相同性來表示胺基酸序列之間的相似性。常常通過相同性百分數(或相似性或同源性)來量度序列相同性；此百分數越高，兩個序列越相似。當用標準方法比對時，多肽的同源物或變體，如SEQ ID N0:12具有相對較高的序列相同性。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。各種程序和比對算法見=Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981 ;Needleman和 Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-53,1970 ;Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444-8,1988 ;Higgins和Sharp, Gene73:237-44，1988 ；Higgins 和 Sharp, CAB10S5:151-3，1989 ；Corpet 等，NucleicAcids Researchl6:10881-90,1988 ;和 Altschul 等，Nature Genet.6:119-29,1994。可從幾種來源獲得NCBI局部序列比對基本檢索工具(BLAST ) (Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-10，1990)，包括國家生物技術信 息中心(NCBI，馬裡蘭州貝塞斯達(Bethesda, MD))和網際網路，與序列分析軟體 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx聯合使用。肽變體一般的特徵是經缺口 blastp設置為默認參數的NCBI Blast2.0進行胺基酸序列全長比對計算具有至少50%序列相同性。對於比較大於約30個胺基酸的胺基酸序列而言，採用Blast2序列函數，用設置為默認參數的默認BLOSUM62矩陣，(存在缺口損失11，每殘基缺口損失I)。當比對短肽(少於約30個胺基酸)時，用Blast2序列函數，用設置為默認參數的PAM30矩陣(開放缺口 9，延伸缺口罰分I)進行比對。當用此方法評價時，與參比序列相似性更大的蛋白顯示出相同性百分數提高，如序列相同性為至少80%、至少90%、至少95%、至少98%，甚至至少99%。當比較少於完整序列的序列相同性時，在10-20個胺基酸的短窗口中同源物和變體的序列相同性一般至少為80%，且序列相同性可以為至少85%、至少90%、至少95%或98%，這取決於它們與參比序列的相似性。在此短窗口中確定序列相同性的方法見位於馬裡蘭州貝塞斯達的國家生物技術信息中心維護的網站。本領域技術人員將理解，提供這些序列相同性的範圍僅是為了指導；完全可能獲得在所提供範圍之外的非常有效的同源物。類似的方法可用於確定核酸序列的序列相同性百分數。在具體實施例中，比對同源序列與天然序列，通過計算兩個序列中存在的相同核苷酸或胺基酸殘基的位置的數量來確定匹配數量。通過將匹配數量除以鑑定序列(如SEQ ID NO:11)中所列序列長度，或除以分節長度(如來自鑑定序列中所列序列的100個連續核苷酸或胺基酸殘基)，然後將得到的值乘以100來確定序列相同性百分數。例如，與SEQ ID N0:11所列序列比對時具有1166個匹配的核酸序列與SEQ ID NO: 11所列序列的相同性為75.0% (即(1166 +1554) *100=75.0)。應注意，序列相同性百分數值四捨五入到最接近的十分之一。例如，75.11,75.12,75.13 和 75.14 四捨五入到 75.1，而 75.15,75.16,75.17,75.18 和 75.19四捨五入到75.2。也應注意，長度值總是整數。在另一個實施例中，含有與如下所述鑑定序列的20個連續核苷酸比對的20-核苷酸區域的靶序列含有與該鑑定序列的序列相同性為75%(即 15 + 20*100=75)的區域。I20靶序列:AGGTCGTGTACTGTCAGTCAI N IN INI Illl鑑定序列:ACGTGGTGAACTGCCAGTGA特異性結合物:能夠特異性結合於本文所述任何多肽的物質。例子包括但不限於:多克隆抗體、單克隆抗體(包括人源單克隆抗體)和單克隆抗體的片段如？&13、？(&13』)2和Fv片段以及能夠特異性結合於這種多肽的表位的任何其它物質。本文所提供的多肽(或其片段、變體或融合物)的抗體可用於純化或鑑定這種多肽。本文所提供的胺基酸和核酸序列可用於生產識別本文所述多肽的基於特異性抗體的結合物。可生產多肽、部分多肽或其變體的單克隆或多克隆抗體。多肽抗原上產生抗一個或多個表位的抗體宜特異性檢測該多肽。即，產生抗特定多肽的抗體將識別和結合該特定多肽，基本不會識別和結合其它多肽。通過許多標準免疫測定方法中的任何一種，如Western印跡(參見例如，Sambrook等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarbor Laboratory Press), 紐約冷泉港，1989)來確定抗體與特定多肽特異性結合。為通過Western印跡測定給定抗體製劑(如在小鼠中產生的抗具有SEQ ID NO:12所列胺基酸序列的多肽的製劑)特異性檢測合適的多肽(如具有SEQ ID N0:12所列胺基酸序列的多肽)，從細胞中抽提細胞總蛋白，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離。然後，可將分離的細胞總蛋白轉移到膜(如硝酸纖維素)上，用抗體製劑孵育該膜。洗滌膜去除非特異性結合的抗體後，可用合適的偶聯於多肽如鹼性磷酸酶的第二抗體(如抗鼠抗體)檢測存在的特異性結合的抗體，因為通過免疫定位的鹼性磷酸酶應用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基藍四唑鎗導致產生深藍色化合物。適合用作免疫原的基本純的多肽可獲自轉染細胞、轉化細胞或野生型細胞。通過，例如Amicon過濾裝置濃縮將最終製劑中多肽濃度調整到幾微克/微升的水平。此外，大小範圍是全長多肽至少達9個胺基酸殘基的多肽可用作免疫原。這種多肽可在細胞培養物中產生、可用標準方法化學合成或可通過將大多肽切割成可純化的較小多肽而獲得。在主要組織相容性複合體(MHC)分子如I型MHC分子或II型MHC分子的情況下，當呈遞給免疫系統時，長度少達9個胺基酸殘基的多肽可具有免疫原性。因此，具有本文所公開的任何胺基酸序列的至少 9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、I100、1150、1200、1250、1300、1350或更多個連續胺基酸殘基可用作生產抗體的免疫原。可根據Kohler和Milstein的經典方法(Nature256:495-7，1975)或其衍生方法從鼠雜交瘤製備本文所公開的任何多肽的單克隆抗體。可通過用多肽(或其片段)免疫合適的動物來製備含有本文所公開任何多肽的異源表位的抗體的多克隆抗血清，該多肽可以是未修飾或經修飾提高免疫原性的多肽。免疫兔的有效方法可參見 Vaitukaitis 等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33:988-91，1971)。可用抗體片段代替整個抗體，並可在原核宿主細胞中容易地表達抗體片段。製造和使用單克隆抗體的免疫有效部分，也稱為「抗體片段」的方法是熟知的，包括 Better 和 Horowitz (Methods Enzymol.178:476-96，1989)、Glockshuber 等(Biochemistry29:1362 -7, 1990)、美國專利號5，648，237 ( 「功能性抗體片段的表達"(Expression ofFunctional Antibody Fragments))、美國專利號 4，946，778 (「單多妝鏈結合分子」(SinglePolypeptide Chain Binding Molecules))、美國專利號 5，455，030 (「米用單鏈多肽結合分子的免疫療法」(Immunotherapy Using Single Chain PolypeptideBinding Molecules))和其中引用的參考文獻中描述的方法。立體反轉性轉氨酶:「立體反轉性轉氨酶」採用手性相反的底物作為氨基供體時能夠優選或選擇性產生手性胺基酸產物(如莫納甜)的多肽。例如，立體反轉性轉氨酶可以是優選或選擇性採用L-穀氨酸作為底物來產生R，R莫納甜的D-苯基甘氨酸轉氨酶(也稱為D-4-羥基苯基甘氨酸轉氨酶)。立體反轉性轉氨酶的非限制性例子包括D-甲硫氨酸轉氨酶(EC2.6.1.41)和具有D-苯基甘氨酸轉氨酶活性或D-4-羥基苯基甘氨酸轉氨酶活性的酶。轉化的:「轉化的」細胞是通過例如分子生物學技術引入了核酸分子的細胞。轉化包括可將核酸分子引入細胞的所有技術，包括但不限於:用病毒載體轉染、接合、用質粒載體轉化和通過電穿孔引入裸DNA、脂質轉染和基因槍加速。變體、片段或融合蛋白:所公開的蛋白包括其變體、片段和融合物。經工程改造，編碼蛋白質(例如SEQ ID NO:12)、融合蛋白或蛋白片段或變體的DNA序列(例如SEQ IDN0:11)可在真核細胞、細菌、昆蟲和/或植物中表達該蛋白。為了獲得表達，可改變DNA序列，且操作性連接於其它調節序列。將含有調節序列和蛋白的最終產物稱為載體。可將該載體引入真核細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和/或植物細胞。引入細胞後，該載體可產生所述蛋白。融合蛋白可包括連接於不抑制所需蛋白活性，例如將色氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸的能力的其它胺基酸序列的蛋白，如色氨酸轉氨酶(或其變體、多態形式、突變體或片段)如SEQ ID NO:120在一個實施例中，所述其它胺基酸序列的長度不超過約10、12、15、20,25,30或50個胺基酸。本領域普通技術人員將理解，可用不影響編碼蛋白生物活性的許多方式改變DNA序列。例如，可用PCR在編碼蛋白的DNA序列中產生變異。這種變體可以是用於表達該蛋白的宿主細胞中密碼子偏好優化的變體，或促進表達的其它序列改變。載體:將核酸分子引入細胞，產生轉化細胞。載體可包括允許它在細胞中複製，如含有複製起點的核酸序列。載體也可包括一個或多個可選擇標記基因和本領域已知的其它遺傳元件。生物合成途徑概述如圖1-3和11-13所示，可用許多生物合成途徑產生莫納甜或其中間體如吲哚-3-丙酮酸或MP。對於各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)向各產物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫納甜)的轉化，可採用幾種不同多肽。而且，可在體內、體外、或通過體內反應和體外反應的組合，如包括無酶化學反應的體外反應來進行這些反應。因此，圖1-3和11-13是示範，顯示可用於獲得所需產物的多種不同途徑。葡萄糖到色氨酸 許多生物體能從葡萄糖合成色氨酸。含從葡萄糖和/或色氨酸生成莫納甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的構建物可克隆入這種生物體中。本文顯示色氨酸可轉化成吳納甜。在其它例子中，用已知多肽改造生物體可產生色氨酸或過量產生色氨酸。例如，美國專利號4，371，614(納入本文作參考)描述了用含野生型色氨酸操縱子的質粒轉化大腸桿菌菌株。美國專利號4，371,614所述色氨酸的最大效價約為230ppm。類似地，W08701130(納入本文作參考)描述了經遺傳改造以生成色氨酸的大腸桿菌菌株並討論了增加發酵生產的L-色氨酸。本領域技術人員認識到能從葡萄糖生成色氨酸的生物體也能利用其它可轉化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，結果類似。示範性碳源和能源包括但不限於蔗糖、果糖、澱粉、纖維素或甘油。色氨酸到吲哚-3-丙酮酸可用一些多肽將色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。示範性多肽包括酶種類(EC) 2.6.1.27,1.4.1.19,1.4.99.1,2.6.1.28,1.4.3.2,1.4.3.3,2.6.1.5,2.6.1.-、
2.6.1.1和2.6.1.21。這些種類包括稱為色氨酸轉氨酶的多肽(也稱為L-苯丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨酶、色氨酸轉氨酶、5-羥基色氨酸-酮戊二酸轉氨酶、羥基色氨酸轉氨酶、L-色氨酸氨基轉移酶、L-色氨酸轉氨酶、和L-色氨酸:2_酮戊二酸轉氨酶)，它將L-色氨酸和2-酮戍二酸轉化成Π引哚-3-丙酮酸和L-穀氨醯胺；D_色氨酸轉氨酶，它將D-色氨酸和2-含氧酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和胺基酸；色氨酸脫氫酶(也稱為NAD (P) -L-色氨酸脫氫酶、L-色氨酸脫氫酶、L-Trp-脫氫酶、TDH和L-色氨酸:NAD (P)氧化還原酶(脫氨))，它將L-色氨酸和NAD (P)轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD (P) H ；D-胺基酸脫氫酶，它使D-胺基酸和FAD轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2 ;色氨酸-苯基丙酮酸轉氨酶(也稱為L-色氨酸-α -酮異已酸轉氨酶和L-色氨酸:苯基丙酮酸轉氨酶)，它將L-色氨酸和苯基丙酮酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-胺基酸氧化酶(也稱為蛇胺基酸氧化酶和L-胺基酸:氧氧化還原酶(脫氨))，它使L-胺基酸和H2O和O2轉化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ；D-胺基酸氧化酶(也稱為蛇胺基酸氧化酶和D-胺基酸:氧氧化還原酶(脫氨)),它將D-胺基酸和H2O和O2轉化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ;色氨酸氧化酶,它使L-色氨酸和H2O和O2轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H202。這些種類也含有酪氨酸(芳族)轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、D-胺基酸(或D-丙氨酸)轉氨酶和有多種轉氨酶活性的廣(多底物)轉氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和胺基酸。轉氨酶種類 中有這種活性的11個成員描述於下面的實施例1，包括SEQ IDN0:11和12所示的新轉氨酶。因此，本發明提供分離的核酸和蛋白序列，與SEQ IDN0:11和12有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少99%的序列相同性。本發明也涵蓋SEQ ID NO: 11和12的片段和融合體，它們保持轉氨酶活性或編碼具有轉氨酶活性的蛋白。示範性片段包括但不限於至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000個SEQ IDNO: 11 的毗連核苷酸或至少 6、10、15、20、25、50、75、100、200、300 或 350 個 SEQ ID NO: 12 的毗連胺基酸。所示序列(和其變體、片段和融合體)可以是載體的一部分。載體能用於轉化宿主細胞，從而生成重組細胞，重組細胞可從色氨酸產生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能進一步產生MP和/或莫納甜。L-胺基酸氧化酶(1.4.3.2)是已知的，其序列可分離自一些不同來源，如地中海蜂(Vipera lebetine) (sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah) (sp P81383)、紅口峻(Agkistrodon rhodostonma) (sp P81382)、西部菱斑響尾蛇(Crotalus atrox) (spP56742)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepaica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄桿菌(Caulobacter cresentus)、萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Musmusculus)、丁香假單胞菌(P.Syringae)和紅球菌屬(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述於文獻且可分離自例如鬼傘屬(Coprinus) SF-1、有根腫病的大白菜、擬南芥和哺乳動物的肝。下面在實施例5中討論可將色氨酸轉變為吲哚-3-丙酮酸的L-胺基酸氧化酶分類的一個成員，以及其它分子克隆來源。在用於分子克隆的資料庫中可獲得許多D-胺基酸氧化酶基因。色氨酸脫氫酶是已知的，並可分離自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黃花牧豆樹(Prosopisjuliflora)、豌豆、牧豆樹、小麥、玉米、番爺、菸草、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)和乳桿菌(Lactobacilli)。許多D-氛基酸脫氧酶基因序列已知。美國5，728，555公開了苯丙氨酸脫氨酶(EC3.5.1._)，它也可在水存在下將色氨酸轉變為吲哚-3-丙酮酸和銨。這些廣泛特異性酶可從變形菌屬(Proteus)微生物分離，如產粘變形菌(Proteus myxofaciens)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、普通變形菌(Proteusvulgaris)和摩氏變形菌(Proteus morganii),對相應基因進行克隆和測序。參見例如普通變形菌脫氨酶(蛋白質登錄號:BAA90864.1G1: 7007412 ;基因登錄號:AB030003.161:7007411);奇異變形菌脫氨酶(蛋白質登錄號:AAA86752.161:1015426 ;基因登錄號:U35383.1G1: 1015425)。普羅威登斯菌(Providencia)和摩根菌(Morganella)也含有可將色氨酸轉變為11引哚_3_丙酮酸的L-脫氨酶。參見H.Drechsel, A.Thieken,R.Reissbrodt, G.Jung和 G.ffinlcelmann, J.Bacterid.，175:2727_2733(1993)。如圖11-13所示，如果用胺基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸，能加入過氧化氫酶以減少或甚至去除過氧化氫的存在。吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的反應可通過各種多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111 多肽類的成員。1.1.1.110多肽類包括吲哚乳酸脫氫酶(也稱為吲哚乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.1.27,1.1.1.28和1.1.2.3類包括乳酸脫氫酶(也稱為乳酸脫氫酶、乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.1.222類包括(R) -4-羥苯基乳酸脫氫酶(也稱為D-芳族乳酸脫氫酶、R-芳族乳酸脫氫酶和R-3-(4-羥苯基)乳酸:NAD (P)+2-氧化還原酶)且1.1.1.237類包括3-(4-羥苯基丙酮酸)還原酶(也稱為羥苯基丙酮酸還原酶和4-羥苯基乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.3.-類包括乳酸氧化酶，1.1.1.111類包括(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(也稱為(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸:NAD(P) +氧化還原酶)。可能這些種類中的一些多肽能從吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。實施例4提供了這種轉變的例子。化學反應也可用於將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。這種化學反應包括能用一些方法完成的氧化步驟，例如:使用B2催化劑的空氣氧化(China ChemicalReporter,13卷，28期，18頁(I)，2002)，金屬催化劑存在時稀釋高錳酸鹽和高氯酸鹽或過氧化氫。P引哚-3-丙酮酸到2-羥基2_(吲哚-3基甲基)_4_酮戊二酸(MP)
一些已知多肽能用於使吲哚-3-丙酮酸轉化成MP。示範多肽種類包括4.1.3.-、
4.1.3.16,4.1.3.17和4.1.2._。這些種類包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2種羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC4.1.3.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電體，而EC4.1.2.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作為親電體。例如，EP1045-029中所述多肽(EC4.1.3.16,4-羥基-2-酮戊二酸乙醛酸-裂合酶，也稱為4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶、2-氧-4-羥基戊二酸醛縮酶或KHG醛縮酶)將乙醛酸和丙酮酸轉化成4-羥基-2-酮戊二酸，多肽4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17，也稱為4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛縮酶)縮合2種酮酸如2個丙酮酸到4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸。本文描述利用這些裂合酶的反應。圖1-2和11-13顯示這些反應的示意圖，其中3_碳(C3)分子結合吲哚_3_丙酮酸。EC4.1.2.-和4.1.3.-的許多成員，特別是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是胺基酸如絲氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇縮合需要此途徑的3個碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作為C3碳源且可轉化成丙酮酸。可通過許多利用PLP的轉氨酶來轉氨以產生丙酮酸，包括許多上述的轉氨酶。可通過β消除反應(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)獲得丙酮酸和氨，反應用於L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有足夠離去基團的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-絲氨酸、O-苄基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-醯基-L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介導的β -裂合酶反應中用作丙酮酸的來源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC4.1.99.2，也稱為酪氨酸-酚裂合酶)催化的反應。通過在(4.1.99.1-2)多肽上進行定點誘變可增加β-裂合酶反應速率，如Mouratou等(J.Biol.Chem274:1320-5,1999)和實施例5所述。這些修飾使多肽接受二羧基胺基酸底物。乳酸鹽也能用作丙酮酸的來源，且通過加入乳酸脫氫酶和氧化輔因子或乳酸氧化酶和氧來氧化成丙酮酸。這些反應的例子在下文描述。例如，如圖2和圖11-13所示，當丙酮酸用作C3分子時，ProA醛縮酶能接觸吲哚_3_丙酮酸。也可採用化學反應，如實施例8所述的醇醛縮合產生MP。MP到莫納甜MP到莫納甜的轉化可由下列I個或多個催化:色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)或更多轉氨酶家族(2.6.1.-)的一般成員如天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸轉氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)轉氨酶(圖2)。轉氨酶類的11個成員在下文描述(實施例1)，包括SEQ ID NO: 11和12所示新的種類成員，實施例15提供證明轉氨酶和脫氫酶活性的反應。此反應也能用化學反應進行。通過還原性氨基化用氨和氰基硼氫化鈉進行酮酸(MP)氨基化。圖11-13顯示其它多肽，它們能用於使MP轉化成莫納甜，以及提供增加來自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫納甜產量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供體，天冬氨酸轉氨酶能用於使天冬氨酸轉化成草醯乙酸(圖11)。草醯乙酸通過脫羧酶(如草醯乙酸脫羧酶)轉化成丙酮酸和二氧化 碳(圖11)。此外，如果賴氨酸用作氨基供體，賴氨酸ε轉氨酶(EC2.6.1.36)可用於使賴氨酸轉化成ε -醛基賴氨酸(圖12)。ε -醛基賴氨酸自發轉化成1-哌啶6-羧酸鹽(圖12)。類似於圖12的類似方法採用鳥氨酸δ-轉氨酶(EC2.6.1.13)代替賴氨酸ε轉氨酶，鳥氨酸用作氨基供體。如果能催化還原性氨基化反應的多肽(如穀氨酸脫氫酶)用於將MP轉化成莫納甜，可使用能再循環NAD (P) H和/或產生揮發性產物的多肽，如甲酸脫氫酶。設計生物合成途徑中的其它考慮根據採用哪種多肽產生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜，給生產細胞提供輔因子、底物和/或其它多肽以增加產物形成。去除過氧化氫過氧化氫(H2O2)是一種產物，如果產生，可對生產細胞有毒、並可損害多肽或產生的中間體。上述L-胺基酸氧化酶產生H2O2作為產物。因此，如果使用L-胺基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平減少以降低對細胞或產物的潛在損傷。過氧化氫酶能用於降低細胞中的Η202水平(圖11-13)。生產細胞可表達編碼過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化過氧化氫分解成水和氧氣。例如，過氧化氫酶可從轉染入生產細胞的載體中表達。能使用的過氧化氫酶例子包括但不限於:tr Q9EV50 (木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr | Q9KBE8 (嗜喊芽抱桿菌(Bacillus halodurans)、tr | Q9URJ7 (白假絲酵母(Candida albicans))、tr IP77948 (天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor))、tr | Q9RBJ5 (野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)) (SwissProt登錄號)。使用L-胺基酸氧化酶、D-胺基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反應器也能包含過氧化氫酶多肽。PLP (吡哆醛-5』 -磷酸)有效性的調節如圖1所示，PLP可用於本文所述I個或多個生物合成步驟。能補充PLP濃度，從而PLP不成為對反應總效率的限制。已充分研究大腸桿菌中維生素B6 (PLP的前體)的生物合成途徑且已結晶一些蛋白質(Laber等，FEBS Letters，449:45-8，1999)。其它代謝途徑中需要2個基因(印d或gapB和serC),而3個基因(pdxA、pdxB和pdxj)是卩比卩多醒磷酸生物合成獨有的。大腸桿菌途徑中的起始物質之一是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。從共同的2和3碳中心代謝物合成此前體是由多肽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前體是從4_碳糖，D-赤蘚糖4-磷酸形成的蘇氨酸衍生物。轉化到磷酸-4-羥基-L蘇氨酸(HTP)所需的基因是^cUpdxB和serC。形成PLP的最後一個反應是DXP與HTP間的複雜分子內縮合和閉環反應，由pdxA和pdxj的基因產物催化。如果PLP成為發酵生產莫納甜期間的限制營養物，可增加I個或多個途徑中的基因在生產宿主細胞中的表達來提高莫納甜產量。宿主生物體可包含多拷貝的天然途徑基因，或非天然途徑基因的拷貝可摻入生物體的基因組中。另外，可在宿主生物體內克隆入多拷貝的拯救途徑基因中。在所有生物體中保守的I個拯救途徑使各種維生素B6的衍生物再循環成活性PLP形式。參與此途徑的多肽是PdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。過量表達I個或多個這些基因可增加PLP有效性。可通過去除或阻抑宿主生物體中天然生物合成途徑基因的代謝調節提高維生素B6水平。PLP阻抑參與黃桿菌屬(Flavobacterium)菌株238-7中前體蘇氨酸衍生物的生物合成的多肽。此細菌菌株無代謝控制，過量產生吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以類似方式遺傳操作產生莫納甜的宿主生物體可增加PLP生成而不過度表達生物合成途徑基因。銨利用通過製備更能利用的氨或去除水能驅動色氨酸酶反應趨向合成方向(從吲哚生成色氨酸)。還原性氨基化反應如由穀氨酸氫化酶催化的反應，也能通過銨過量來驅動。氨可作為碳酸或磷酸緩衝系統中的碳酸銨或磷酸銨鹽而得到。氨也能作為丙酮酸銨或甲酸銨提供。另外，如果反應偶聯於產生氨的反應如穀氨酸脫氫酶、色氨酸脫氫酶或支鏈脫氫酶，可提供氨。加入EC4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能產生氨，底物會水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通過酶水解其優選底物也能使增加的合成產物的產量超過正常平衡量。除去產物和副產物

色氨酸經色氨酸轉氨酶轉化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影響吲哚-3-丙酮酸的產率，因為反應生成穀氨醯胺並需要共底物2-酮戊二酸(α-酮戊二酸)。穀氨醯胺可引起轉氨酶的抑制，反應會消耗大量共底物。此外，高穀氨酸濃度對下遊分離過程有害。多肽穀氨酸脫氫酶(GLDH)將穀氨酸轉化成2_酮戊二酸，從而在反應中再循環共底物，反應由色氨酸轉氨酶催化。GLDH也產生還原性等效物(NADH或NADPH)，能用於在需氧條件下產生細胞所用能量(ATP)。通過GLDH利用穀氨酸也減少副產物形成。另外，反應產生氨，它能用作細胞的氮源或作為圖1所示最後步驟中還原性氨基化的底物。因此，過度表達GLDH多肽的生產細胞能用於增加產量和降低培養基和/或分離方法的成本。在色氨酸到莫納甜的途徑中，如果使用來自適當酶類的轉氨酶，步驟3的氨基供體(如穀氨酸或天冬氨酸)可反轉化成步驟I所需的氨基受體(如2-酮戊二酸或草醯乙酸)。使用此途徑的2種獨立的轉氨酶能提高此途徑的效率，其中I種轉氨酶的底物非競爭性抑制其它轉氨酶的活性。所述途徑中的許多反應是可逆的，因此可達到底物和產物間的平衡。可通過從多肽中連續取出產物來增加途徑的產量。例如，用通透酶或其它轉運蛋白使莫納甜分泌入發酵液，或者從生物催化反應器流中選擇性結晶莫納甜並伴隨底物再循環會提高反應產量。另一種增加反應產量的方法是通過另外的酶反應或通過氨基供體基團的取代來去除副產物。實施例21和圖11-13顯示了幾個例子。理想的是，通過相變(蒸發)或自發轉變為無反應性的終產物如二氧化碳使產生的副產物不能以反方向反應。底物庫的調節可通過增加色氨酸前體生成和/或改變包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代謝途徑調節吲哚庫。例如，可通過宿主細胞中編碼EC4.1.1.74的基因功能性缺失來減少或去除從吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸。可通過功能性缺失宿主細胞中編碼EC4.1.99.1的基因減少或去除從色氨酸生成吲哚。另外，過量吲哚能用作體外或體內過程中的底物，結合增加量的編碼EC4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.andBioeng.,82:604-6,1996)。可 進行遺傳修飾以增加中間體，如D-赤蘚糖-4-磷酸和分支酸的水平。在大多數生物體中調節了色氨酸產量。一種機制是通過反饋抑制該途徑中的某些酶；隨著色氨酸水平提高，色氨酸的生產速率降低。因此，採用經工程改造通過色氨酸中間體生產莫納甜的宿主細胞時，可採用對色氨酸濃度不敏感的生物體。例如，通過重複接觸高濃度的5-甲基色氨酸選擇對多種色氨酸類似物的生長抑制作用有抗性的長春花(Catharanthus roseus)品系(Schallenberg 和 Berlin, Z Naturforsch34:541-5,1979)。得到的該品系的色氨酸合酶活性受產物抑制作用的影響較小，可能是由於基因突變的緣故。相似地，可優化用於生產莫納甜的宿主細胞。可通過採用定向演化以產生對產物抑制作用敏感性較低的多態，以優化色氨酸生產。例如，可在培養基中不含色氨酸、但含有高水平不可代謝的色氨酸類似物的的平板上進行篩選。美國專利5，756，345 ;4，742，007 ;和4，371，614描述了用於提高發酵生物的色氨酸產量的方法。色氨酸生物合成的最後一個步驟是將絲氨酸加入吲哚；因此可提高絲氨酸的有效性，以提高色氨酸產量。可通過提高宿主生物產生的丙酮酸產量提高發酵生物產生的莫納甜產量。某些酵母，如皮狀絲抱酵母(Trichosporon cutaneum) (Wang 等，Lett.Appl.Microbiol.35:338-42, 2002)和光滑球擬酵母菌(Torulopsis glabrata) (Li 等，ApplMicrobiol.Biotechnol.57:451-9，2001)過量產生丙酮酸，並可用於實施本文所述的方法。此外，可對生物體，如大腸桿菌菌株W14851ip2進行遺傳修飾，以促進丙酮酸生產(Kawasaki 等，J.Ferm.andBioeng.82:604-6,1996)。控制手性通過控制分子的立體化學(手性)能改變莫納甜的味覺特性。例如，不同食物系統的濃度不同的混合物中需要不同的莫納甜異構體。通過pH和多肽的組合控制手性可。
權利要求
1.一種生產莫納甜的方法，包括將色氨酸和/或吲哚-3-乳酸轉化為莫納甜，所述方法包括: 將色氨酸或吲哚-3-乳酸與第一多肽接觸，所述第一多肽將色氨酸或吲哚-3-乳酸轉化為吲哚-3-丙酮酸； 將吲哚-3-丙酮酸與第二多肽和C3碳源接觸，所述第二多肽將吲哚-3-丙酮酸與所述C3碳源轉化為2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和 將2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸與第三多肽接觸，所述第三多肽將2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸轉化為莫納甜。
2.如權利要求1所述的方法，所述第一多肽 a)選自:色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、酪氨酸(芳族胺基酸)轉氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸氧化酶、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D_胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D_色氨酸轉氨酶、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、及其組合，所述第一多肽將色氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸； b)選自:吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)和乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)或其組合，所述第一多肽將吲哚-3-乳酸轉化為吲哚-3-丙酮酸； c)包含 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登錄號:NP_388848.UGenbank 登錄號:ΖΡ00005082.1或Genbank登錄號:AAC74014.1中所示胺基酸序列； d)包含與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登錄號:ΝΡ_388848.1、Genbank登錄號:ΖΡ00005082.1或Genbank登錄號:AAC74014.1中所示序列至少90%相同的胺基酸序列； e)包含與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登錄號:ΝΡ_388848.1、Genbank登錄號:ΖΡ00005082.1或Genbank登錄號:AAC74014.1相比區別不到50個保守胺基酸取代的胺基酸序列，所述胺基酸序列將色氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸；或者 f)包含胺基酸氧化酶(EC1.4.3.-)或過氧化氫酶(EC1.11.1.6)，並將色氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸。
3.如權利要求1所述的方法，所述第二多肽a)是EC4.1.2.-酶或 EC4.1.3.-酶; b)包含SEQ ID NO:66、Genbank 登錄號:CAC46344、Genbank 登錄號:CAB14127.1、Genbank登錄號:AAC74920.1或Genbank登錄號:CAC47463.1中所不胺基酸序列； c)包含與SEQ ID NO:66、Genbank 登錄號:CAC46344、Genbank 登錄號:CAB14127.1、Genbank登錄號:AAC74920.1或Genbank登錄號:CAC47463.1至少90%相同的胺基酸序列；或 d)包含與SEQ ID NO:66、Genbank 登錄號:CAC46344、Genbank 登錄號:CAB14127.1、Genbank登錄號:AAC74920.1或Genbank登錄號:CAC47463.1相比區別不到50個保守胺基酸取代的胺基酸序列，所述胺基酸序列將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸轉化為MP。
4.如權利要求1所述的方法，所述第三多肽 a)選自:酪氨酸(芳族胺基酸)轉氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、D-色氨酸轉氨酶、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、多底物轉氨酶(EC2.6.1._)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)及其組合； b)包含SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登錄號:NP_388848.UGenbank 登錄號:ΖΡ00005082.1或Genbank登錄號:AAC74014.1中所示胺基酸序列； c)包含與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登錄號:ΝΡ_388848.1、Genbank登錄號:ΖΡ00005082.1或Genbank登錄號:AAC74014.1中所示胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列； d)包含與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登錄號:ΝΡ_388848.1、Genbank登錄號:ΖΡ00005082.1或Genbank登錄號:AAC74014.1相比區別不到50個保守胺基酸取代的胺基酸序列，所述胺基酸序列將色氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸； e)包含天冬氨酸轉氨酶，其中，2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸與天冬氨酸接觸生成草醯乙酸和莫納甜； f)包含賴氨酸ε轉氨酶,其中，2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸另與賴氨酸接觸； g)包含具有還原性氨基化活性的酶和能夠再循環NAD(P)H的肽。
5.一種能夠用權利要求1所述方法生產莫納甜的細胞，其中，所述第一、第二和第三多肽中的一個或多個由異源核酸序列編碼。
6.一種生產莫納甜的方法，包括在丙酮酸與第一和第二多肽存在下將吲哚-3-丙酮酸轉化為莫納甜，所述第一多肽是醛縮酶，所述第二多肽選自酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉氨酶(2.6.1.1)、O-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、O-色氨酸轉氨酶、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、或其組合。
7.—種能夠生產莫納甜的細胞，所述細胞含有: (a)編碼第一多肽的第一異源核酸序列，所述第一多肽將色氨酸、吲哚-3-乳酸或其組合轉化為吲哚-3-丙酮酸，所述第一多肽選自:色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸氧化酶、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、D-色氨酸轉氨酶、吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28,1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3、1.4.1.4)及其組合；(b)編碼第二多肽的第二異源核酸序列，所述第二多肽將吲哚-3-丙酮酸和C3碳源轉化為2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸，所述第二多肽選自:4_羥基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、4_羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)及其組合； (c)編碼第三多肽的第三異源核酸序列，所述第三多肽將2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸轉化為莫納甜，所述第三多肽選自:色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸氧化酶、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)，D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、D-色氨酸轉氨酶、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)及其組合。
8.一種分離的核酸，由SEQ ID NO:1構成。
9.一種載體,包含權利要求8所述分離的核酸。
10.一種重組細胞 ，包含權利要求9所述載體，所述細胞選自:植物細胞、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞，藻類細胞，古菌細胞或真菌細胞。
11.一種分離的蛋白質，其由權利要求8所述核酸編碼，所述蛋白質由SEQ IDNO:12構成。
全文摘要
本文提供了可用於由葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸製備莫納甜的方法和組合物。也公開了生產吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中間體的方法。所提供的組合物含有核酸分子、多肽、化學結構和細胞。方法包括體外和體內方法，體外方法包括化學反應。
文檔編號C12P17/10GK103074394SQ20121057161
公開日2013年5月1日 申請日期2006年4月26日 優先權日2005年4月26日
發明者P·M·西克斯, S·C·麥克法蘭 申請人:嘉吉有限公司