麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法
2023-06-01 12:16:51
專利名稱：麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法
技術領域：
本發明屬於植物天然蛋白質的分離純化技術領域，具體涉及一種麻瘋樹種仁毒蛋 白Curcin的分離純化方法。
背景技術：
麻瘋樹屬於大戟科(Euphorbiaceae)油料植物，廣泛分布於我國西南地區，是我 國重要的資源植物。麻瘋樹種子含油量高達40%，是理想的生物柴油生產原料，具有良好 的應用前景。同時，麻瘋樹種仁中蛋白質含量也相當豐富。近年已有文獻報導，從麻瘋樹種 仁中分離得到了一種毒蛋白，被命名為Curcin。經實驗證明，Curcin屬於I型核糖體失活 蛋白(林娟等，「麻瘋樹核糖體失活蛋白的分離純化和作用機制研究」，高技術通訊，2002， 11，36-40，現有技術1)。核糖體失活蛋白是一類細胞毒素蛋白，如將其與單克隆抗體結合， 製成免疫毒素(imimmotoxic)，可大大提高其作用的專一性，有望開發成專一殺傷癌細胞的 藥物，在癌症治療方面具有很大的發展潛能(Lin JY，Tserng KY，Chen CC，Lin LT，Tung TC. Abrin and ricin :new anti-tumour substances. Naturel970 ;227 :292_293.)。隨著Curcin的成功分離，對於Curcin的抗腫瘤、抗真菌活性研究也相繼展開。 抗腫瘤活性的研究顯示，Curcin對胃癌細胞系SGC-7901、骨髓瘤細胞系Sp2/0、人肝癌 細胞系(human hepatoma)等三株細胞的蛋白合成有較強的抑制作用(Lin Juan et al, "Antitumor effects of curcin from seeds of Jatropha curcas，，,Acta Pharmacologica Sinica，2003，24 (3)，241-246)。抗真菌活性的體外研究顯示，Curcin對水稻稻瘟病菌、松 赤枯病菌、玉米紋枯病菌、油菜菌核病菌等四種農作物病原菌有明顯的抑制作用(魏琴等， 「麻瘋樹毒蛋白(Curcin)的抗真菌活性研究」，中國油料作物學報，2004，26 (3)，71-75)。這 些研究顯示，Curcin作為I型核糖體失活蛋白，在癌症治療、作物育種、農藥開發等方面具 有很大的開發潛能及廣闊的應用前景。因此，Curcin的提取及分離純化也就顯得十分的重 要了。目前，麻瘋樹種仁毒蛋白Curcin的分離純化方法已有報導(林娟等，「麻瘋樹核糖 體失活蛋白的分離純化和作用機制研究」，高技術通訊，2002，11，36-40)。該方法披露的分 離純化過程簡單敘述如下將麻瘋樹種仁加入磷酸緩衝液中浸泡，之後在植物勻漿機上勻漿。4°C下攪拌後離 心取上層清液，用60%、95%兩個飽和度依次進行硫酸銨沉澱，收集第二次硫酸銨沉澱的沉 澱組分，重新溶解於少量磷酸緩衝液，得到Curcin粗提液。粗提液經過透析，最後進行凝膠 過濾分離，得到Curcin純品。但綜合分析上述Curcin分離純化方法，尚存在以下一些不足第一，由於該方法僅採用了凝膠過濾一種層析方法對Curcin粗提液進行蛋白純 化，因而使得終產品Curcin中還含有相當數量的雜蛋白(見圖5中的1號泳道)，其純度尚 不能很好的滿足基於Curcin的各種毒理、藥理等基礎研究。第二，由於該方法使用的凝膠過濾層析流速慢，工藝耗時較長，因而不利於Curcin活性的保持。第三，根據該方法的描述，其工藝耗時約58小時(透析耗時48小時，凝膠過濾耗 時10小時)，因而工藝周期較長，不利於生產成本的控制及終產物活性的保持。第四，由於該方法採用的凝膠過濾是穿透性層析，要得到理想的分離效果，上樣量 須小於柱體積的5%。如果工藝需要放大，則不可避免的造成樣品體積增大，要維持原有分 離效果，就需要大幅增加柱體積以滿足上樣量的增加。但凝膠過濾填料十分昂貴，柱體積的 增加必然造成成本的大幅上升。同時，由於柱體積大幅上升，層析柱也需同步更換為更粗或 更長的層析柱，因而勢必帶來生產成本的大幅上升，所以該方法的可放大性不夠。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術存在的問題，提供一種終產物活性和純度高，純化 工藝周期短，工藝可放大性好的麻瘋樹種仁毒蛋白Curcin的分離純化方法，以便為更深入 研究開發Curcin在癌症治療、作物育種、農藥開發等方面的應用價值創造必要的條件。本發明提供的麻瘋樹種仁毒蛋白Curcin的分離純化方法，該方法是將製備的 Curcin粗提液先進行脫鹽及緩衝液交換並收集上樣後第一個280nm吸收峰的組分，然後將 收集的組分進行陰離子交換層析並收集上樣後穿透組分，再後將收集的穿透組分用緩衝液 進行稀釋，最後將稀釋後的組分溶液進行陽離子交換層析，並收集最高的280nm吸收峰的 組分，該組分即為最終的Curcin純品。上述方法使用的Curcin粗提液是按照林娟等公開的「麻瘋樹核糖體失活蛋白的 分離純化和作用機制研究」(高技術通訊，2002，11，36-40)中的方法製備的。該Curcin粗 提液的電泳結果見圖4第2泳道。該方法中脫鹽及緩衝液交換步驟是先用緩衝液A進行柱平衡，然後將Curcin粗 提液作為樣品上樣，並收集上樣後第一個280nm吸收峰的組分，其中緩衝液A為Tris_HCl 緩衝液，填料採用S印hadex G 25 superfine填料，流速為100-200cm/h，檢測器波長選擇 280nm。本步驟耗時1小時。該方法中陰離子交換層析步驟是先用緩衝液A進行柱平衡，然後將脫鹽及緩衝液 交換步驟收集的組分作為樣品上樣，上樣後收集穿透組分，其中緩衝液A為Tris-HCl緩衝 液，填料採用Q Sepharose FF填料，流速為100-200cm/h，檢測器波長選擇280nm。本步驟 耗時0. 5小時。該方法中稀釋步驟用緩衝液B對陰離子交換層析步驟收集的組分進行稀釋，稀釋 倍數10-30倍，其中緩衝液B為檸檬酸三鈉緩衝液。本步驟耗時很短，可忽略不計。該方法中陽離子交換層析步驟採用具有二元泵混合系統的液相色譜儀，其中A泵 輸送緩衝液B，B泵輸送緩衝液C，且A、B兩泵的液體能以任意比例混合，層析時，先用A泵 輸送緩衝液B進行柱平衡，然後將稀釋步驟稀釋後的組分溶液作為樣品上樣，上樣後先用A 泵輸送緩衝液B衝洗2-4個柱體積，再用A、B兩泵同時輸送緩衝液B、C並依次進行階段洗 脫和線性梯度洗脫，階段洗脫的長度為4-6個柱體積，線性梯度洗脫的長度為18-22個柱體 積，並收集線性梯度洗脫階段最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品， 其中緩衝液B為檸檬酸三鈉緩衝液，緩衝液C為檸檬酸三鈉-氯化鈉緩衝液，填料採用SP Sepharose HP填料，流速為100_200cm/h，檢測器波長選擇280nm。本步驟耗時1. 5小時。
以上方法使用的緩衝液A，即Tris-HCl緩衝液中Tris的濃度為20_50mM， pH8. 0-8. 5。以上方法使用的緩衝液B，即檸檬酸三鈉緩衝液中檸檬酸三鈉的濃度為20_50mM， pH 4. 8-5. 2。以上方法使用的緩衝液C，即檸檬酸三鈉_氯化鈉緩衝液是在緩衝液B中加入 0. 9-1. 1M氯化鈉經攪拌溶解均勻而成，pH 4. 8-5. 2。以上方法在階段洗脫時B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量為 9-11%,在線性梯度洗脫時，B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量由起始點以 線性方式逐漸增加至結束點。其中起始點的體積百分含量為9-11%，結束點的體積百分含 量為 38-42%。另外，需要說明的是，上述方法所使用的填料均為通用電器醫療集團生產的產品。本發明與現有技術相比具有以下優點1、由於現有技術(林娟等，「麻瘋樹核糖體失活蛋白的分離純化和作用機制研 究」，高技術通訊，2002，11，36-40，)所涉及的技術方案僅採用了凝膠過濾一種層析方法對 Curcin粗提液進行蛋白純化，因而其所用的蛋白分離原理較為單一，所得的終產物Curcin 純品中還存在一定數量的雜帶(見圖5中的1號泳道)。而本發明由於採用了陰離子交換、 陽離子交換這兩種基於不同原理的層析方法對Curcin粗提液進行聯合分離提純，故其工 藝分離提純能力不僅有所提高，且其終產物純度也有明顯提升(對比圖5的1號和2號泳 道)。從圖中可見，經過本發明技術方案製得的Curcin純品的純度已達到電泳純標準，這使 得本發明所涉及的新工藝能更好的應用於基於Curcin的各種產品研發以及基於Curcin的 深入而精細的基礎研究，如Curcin抗腫瘤、抗真菌機理的深入研究以及各種毒理、藥理研 允。2、參照趙琦等公開的「一種快速微量的非放射性核糖體失活蛋白活性檢測方 法」(四川大學學報(自然科學版)，2007，44，168-172)對Curcin的生物學活性進行測定。 該方法用抑制蛋白翻譯百分率為50%時對應的Curcin濃度(IC5(1)表示Curcin的活性(IC5(1 越小，樣品中Curcin的活性越大)。將現有技術1製得的Curcin純品(樣品1)和本發明 實施例3製得的Curcin純品(樣品2)分別進行IC5(I值測定。根據趙琦等公開的活性檢 測方法，首先測定加入了不同濃度的Curcin純品(從10_12mol/L至10_6mol/L)時的螢光素 酶活性百分率(測定結果見下表)，然後根據測得的數據，以Curcin濃度的常用對數值為 橫坐標(x軸)，以螢光素酶活性百分率為縱坐標(y軸)作圖(如圖6)，根據圖中數據點， 做出一條直線，求得線性回歸方程。根據此方程，計算出當螢光素酶活性百分率為50%時， 對應的Curcin濃度常用對數值，進而計算出對應的Curcin濃度(即IC5(1值)。經計算， 樣品1的回歸方程為:y = -15. 918x-103. 33，IC50 = 0. 233nmol/L，樣品2的回歸方程為y =-23. 44x-186. 46，IC50 = 0. 081nmol/L,故樣品 1 的 IC50 值是樣品 2 的 2. 88 倍，也即樣品 2的活性是樣品1的2. 88倍。即，本發明的分離純化工藝較之現有技術更能保持Curcin的 生物學活性。
3、由於本發明方法分離提純獲得的Curcin純品採用Bradford法(Bradford M M. AnalBiochem, 1970,72 248)進行蛋白濃度測定，並根據濃度和Curcin純品的體積計算 出最終的蛋白含量，根據最初所用種仁重量計算出的終產物得率為3. 12mg/100g種仁，而 據現有技術1所述其Curcin純品得率為2. 91mg/100g種仁，故本發明可在終產物純度和活 性提高的基礎上，使終產物的得率有所提高了。4、如下表所示，現有技術的工藝總共耗時58小時，而本發明所採用的純化工藝總 共耗時3小時，僅為現有技術的5. 2%，因而工藝周期可大大縮短，以利於生產成本的控制 及終產物活性的保持。 5、由於現有技術採用的是凝膠過濾一步純化的方法，該方法屬於穿透性層析，其 要想得到理想的分離效果，上樣量須小於柱體積的5%，因而當工藝需要放大時，則需要增 加柱體積來滿足上樣量的增加。柱體積的增加就意味著所使用的凝膠過濾填料的增加，而 因凝膠過濾填料十分昂貴，不僅會使成本的大幅上升，且層析柱也需同步更換為更粗或更 長的層析柱，這又將帶來了生產投入的大幅上升。而本發明不僅採用了兩步離子交換代替 了凝膠過濾，且陰離子交換層析及陽離子交換層析因均為吸附性層析，故而對樣品體積沒 有限制，所以當工藝需要放大時，既不必大幅度增加柱體積，又不需同步更換為更粗或更長 的層析柱，從而避免了成本的大幅上升。加之，本發明所使用的填料均為適合工業化生產的 填料，具有成本低，重複使用次數多，便於在位清洗等優點，故更適合大規模生產時採用。
圖1為本發明實施例3脫鹽及緩衝液交換步驟的層析峰型圖(或稱色譜圖)。其 中實線曲線表示280nm吸收值(單位為mAU)，長虛線曲線表示色譜基線，短虛線曲線表示 電導值(單位為mS/cm)，陰影部分表示需要收集的組分。圖2為本發明實施例3陰離子交換層析步驟的層析峰型圖(或稱色譜圖)。其中 實線曲線表示280nm吸收值(單位為mAU)，長虛線曲線表示色譜基線，短虛線曲線表示電 導值(單位為mS/cm)，陰影部分表示需要收集的組分。圖3為本發明實施例3陽離子交換層析步驟的層析峰型圖(或稱色譜圖)。其中實線曲線表示280nm吸收值(單位為mAU)，長虛線曲線表示色譜基線，短虛線曲線表示電 導值(單位為mS/cm)，陰影部分表示需要收集的組分。圖4為變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖(考馬斯亮藍R-250染色)。泳道1 蛋白質分 子量標準；泳道2 :CUrcin粗提液；泳道3 本發明實施例3脫鹽及緩衝液交換步驟中收集的 組分；泳道4 本發明實施例3陰離子交換層析步驟中收集的組分；泳道5 本發明實施例3 陽離子交換層析步驟中收集的組分(也即採用本發明涉及的新純化工藝得到的Curcin純 品)。圖中箭頭所指位置即為Curcin的對應電泳條帶(根據現有技術1所述，Curcin理論 分子量為28. 2kD)。圖5為變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖(考馬斯亮藍R-250染色)，其目的是對不同工 藝製備的Curcin純品的純度進行分析和比較。泳道1 經過現有技術1製得的Curcin純 品；泳道2 本發明實施例3陽離子交換層析中收集的組分(也即經過本發明涉及的新純化 工藝製得的Curcin純品)。泳道3 蛋白質分子量標準。圖中箭頭所指位置即Curcin的對 應電泳條帶。圖6為Curcin抑制蛋白翻譯活性測定圖，其目的是為了對不同工藝製得的Curcin 純品的生物學活性進行計算和比較。橫坐標為Curcin濃度的常用對數值(Curcin的濃度 單位為mol/L)；縱坐標為螢光素酶活性百分率(% )。圖中■表示樣品1的數據點(樣品 1為採用現有技術1製得的Curcin純品)，▲表示樣品2的數據點(樣品2為採用本發明 實施例3製得的Cure in純品)。
具體實施例方式下面給出實施例以對本發明作進一步說明。有必要在此指出的是以下實施例不能 理解為對本發明保護範圍的限制，如果該領域的技術熟練人員根據上述本發明內容對本發 明作出一些非本質的改進和調整，仍屬於本發明保護範圍。實施例1第一步製備Curcin粗提液。按照現有技術1公開的方法製備Curcin粗提液。第二步脫鹽及緩衝液交換。先用緩衝液A，即Tris濃度為35mM，pH為8. 2的 Tris-HCl緩衝液進行柱平衡，平衡5個柱體積，然後將Curcin粗提液作為樣品上樣，並收 集上樣後第一個280nm吸收峰的組分。其中儀器採用AKTA purifier UPC 10 (通用電器醫 療集團產品)，填料採用S印hadex G 25 superfine填料，流速為200cm/h，檢測器波長選擇 280nm。第三步陰離子交換層析。先用緩衝液A(配比、濃度和pH同前一步驟)進行柱平 衡，平衡5個柱體積，然後將脫鹽及緩衝液交換步驟收集的組分作為樣品上樣，上樣後收集 穿透組分(未與填料結合的組分)。其中儀器採用AKTA purifier UPC 10 (通用電器醫療 集團產品)，填料選用Q Sepharose FF填料，流速為200cm/h，檢測器波長選擇280nm。第四步稀釋。用緩衝液B，即檸檬酸三鈉濃度為35mM，pH為5. 0的檸檬酸三鈉緩 衝液，對第三步收集的組分進行稀釋，稀釋倍數20倍。稀釋後的溶液作為下一步層析的樣
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m o第五步陽離子交換層析。本步驟採用通用電器醫療集團生產的具有二元泵混合 系統的AKTA purifier UPC 10液相色譜儀，其中A泵輸送緩衝液B，B泵輸送緩衝液C，且
7A、B兩泵的液體能以任意比例混合。層析時，先用A泵輸送緩衝液B進行柱平衡，平衡5個 柱體積，然後將稀釋步驟稀釋後的組分溶液作為樣品上樣。上樣後先用A泵輸送緩衝液B 衝洗3個柱體積，以去除未結合蛋白，再用A、B兩泵同時輸送緩衝液B、C並依次進行階段 洗脫和線性梯度洗脫。在階段洗脫時B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量為 10%，在線性梯度洗脫時，B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量由起始點以線 性方式逐漸增加至結束點。其中起始點的體積百分含量為10%，結束點的體積百分含量為 40%。階段洗脫的長度為5個柱體積，線性梯度洗脫的長度為20個柱體積，並收集線性梯 度洗脫階段最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品。其中緩衝液B為 檸檬酸三鈉緩衝液(配比、濃度和PH同前一步驟)，緩衝液C為檸檬酸三鈉-氯化鈉緩衝 液，其中檸檬酸三鈉濃度為35mM，氯化鈉0. 9M，溶液pH為5. 0，填料採用SP Sepharose HP 填料，流速為200cm/h，檢測器波長選擇280nm。實施例2第一步製備Curcin粗提液。按照現有技術1公開的方法製備Curcin粗提液。第二步脫鹽及緩衝液交換。先用緩衝液A，即Tris濃度為20mM，pH為8. 0的 Tris-HCl緩衝液進行柱平衡，平衡5個柱體積，然後將Curcin粗提液作為樣品上樣，並收集 上樣後第一個280nm吸收峰的組分。其中流速為150cm/h。第三步陰離子交換層析。先用緩衝液A(配比、濃度和pH同前一步驟)進行柱平 衡，平衡5個柱體積，然後將脫鹽及緩衝液交換步驟收集的組分作為樣品上樣，上樣後收集 穿透組分(未與填料結合的組分)。其中流速為150cm/h。第四步稀釋。用緩衝液B，即檸檬酸三鈉濃度為20mM，pH為4. 8的檸檬酸三鈉緩 衝液，對第三步收集的組分進行稀釋，稀釋倍數10倍。稀釋後的溶液作為下一步層析的樣
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m o第五步陽離子交換層析。層析時，先用A泵輸送緩衝液B進行柱平衡，平衡5個 柱體積，然後將稀釋步驟稀釋後的組分溶液作為樣品上樣。上樣後先用A泵輸送緩衝液B衝 洗2個柱體積，以去除未結合蛋白，再用A、B兩泵同時輸送緩衝液B、C並依次進行階段洗脫 和線性梯度洗脫。在階段洗脫時B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量為9%， 在線性梯度洗脫時，B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量由起始點以線性方 式逐漸增加至結束點。其中起始點的體積百分含量為9%，結束點的體積百分含量為38%。 階段洗脫的長度為4個柱體積，線性梯度洗脫的長度為18個柱體積，並收集線性梯度洗脫 階段最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品。其中緩衝液B為檸檬酸 三鈉緩衝液(配比、濃度和pH同前一步驟)，緩衝液C為檸檬酸三鈉-氯化鈉緩衝液，其中 檸檬酸三鈉濃度為20mM，氯化鈉1M，溶液pH為4. 8，流速為150cm/h。本實施例各步驟所用儀器、填料和檢測器波長選擇同實施例1，略。實施例3第一步製備Curcin粗提液。按照現有技術1公開的方法製備Curcin粗提液。第二步脫鹽及緩衝液交換。先用緩衝液A，即Tris濃度為40mM，pH為8. 0的 Tris-HCl緩衝液進行柱平衡，平衡5個柱體積，然後將Curcin粗提液作為樣品上樣，並收集 上樣後第一個280nm吸收峰的組分。其中流速為150cm/h。此步對應的層析峰型圖(或稱色譜圖)見圖1。具體收集位置見圖1中陰影部分，
8收集組分的電泳結果見圖4第3泳道。第三步陰離子交換層析。先用緩衝液A(配比、濃度和pH同前一步驟)進行柱 平衡，平衡5個柱體積，然後將脫鹽及緩衝液交換步驟收集的組分作為樣品上樣，上樣後收 集穿透組分(未與填料結合的組分)。其中流速為150cm/h。此步對應的層析峰型圖(或叫色譜圖)見圖2，具體收集位置見圖2中陰影部分， 收集組分的電泳結果見圖4第4泳道。第四步稀釋。用緩衝液B，即檸檬酸三鈉濃度為40mM，pH為5. 0的檸檬酸三鈉緩 衝液，對第三步收集的組分進行稀釋，稀釋倍數10倍。稀釋後的溶液作為下一步層析的樣品。第五步陽離子交換層析。層析時，先用A泵輸送緩衝液B進行柱平衡，平衡5個 柱體積，然後將稀釋步驟稀釋後的組分溶液作為樣品上樣。上樣後先用A泵輸送緩衝液B 衝洗3個柱體積，以去除未結合蛋白，再用A、B兩泵同時輸送緩衝液B、C並依次進行階段 洗脫和線性梯度洗脫。在階段洗脫時B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量為 10%，在線性梯度洗脫時，B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量由起始點以線 性方式逐漸增加至結束點。其中起始點的體積百分含量為10%，結束點的體積百分含量為 40%。階段洗脫的長度為4個柱體積，線性梯度洗脫的長度為20個柱體積，並收集線性梯 度洗脫階段最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品。其中緩衝液B為 檸檬酸三鈉緩衝液(配比、濃度和PH同前一步驟)，緩衝液C為檸檬酸三鈉-氯化鈉緩衝 液，其中檸檬酸三鈉濃度為40mM，氯化鈉1. 0M,溶液pH為5. 0，流速為150cm/h。此步對應的層析峰型圖(或叫色譜圖)見圖3。具體收集位置見圖3中陰影部分， 收集組分的電泳結果見圖4第5泳道。本實施例各步驟所用儀器、填料和檢測器波長選擇同實施例1，略。實施例4第一步製備Curcin粗提液。按照現有技術1公開的方法製備Curcin粗提液。第二步脫鹽及緩衝液交換。先用緩衝液A，即Tris濃度為50mM，pH為8. 5的 Tris-HCl緩衝液進行柱平衡，平衡5個柱體積，然後將Curcin粗提液作為樣品上樣，並收集 上樣後第一個280nm吸收峰的組分。其中流速為lOOcm/h。第三步陰離子交換層析。先用緩衝液A(配比、濃度和pH同前一步驟)進行柱平 衡，平衡5個柱體積，然後將脫鹽及緩衝液交換步驟收集的組分作為樣品上樣，上樣後收集 穿透組分(未與填料結合的組分)。其中流速為lOOcm/h。第四步稀釋。用緩衝液B，即檸檬酸三鈉濃度為50mM，pH為5. 2的檸檬酸三鈉 緩衝液，對第三步收集的組分進行稀釋，稀釋倍數30倍。稀釋後的溶液作為下一步層析的樣品。第五步陽離子交換層析。層析時，先用A泵輸送緩衝液B進行柱平衡，平衡5個 柱體積，然後將稀釋步驟稀釋後的組分溶液作為樣品上樣。上樣後先用A泵輸送緩衝液B 衝洗4個柱體積，以去除未結合蛋白，再用A、B兩泵同時輸送緩衝液B、C並依次進行階段 洗脫和線性梯度洗脫。在階段洗脫時B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量為 11%,在線性梯度洗脫時，B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量由起始點以線 性方式逐漸增加至結束點。其中起始點的體積百分含量為11%，結束點的體積百分含量為42%。階段洗脫的長度為6個柱體積，線性梯度洗脫的長度為22個柱體積，並收集線性梯 度洗脫階段最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品。其中緩衝液B為 檸檬酸三鈉緩衝液(配比、濃度和PH同前一步驟)，緩衝液C為檸檬酸三鈉-氯化鈉緩衝 液，其中檸檬酸三鈉濃度為50mM，氯化鈉1. 1M，溶液pH為5. 2，流速為lOOcm/h。
本實施例各步驟所用儀器、填料和檢測器波長選擇同實施例1，略。
權利要求
一種麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法是將製備的Curcin粗提液先進行脫鹽及緩衝液交換並收集上樣後第一個280nm吸收峰的組分，然後將收集的組分進行陰離子交換層析並收集上樣後穿透組分，再後將收集的穿透組分用緩衝液進行稀釋，最後將稀釋後的組分溶液進行陽離子交換層析，並收集最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品。
2.根據權利要求1所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法中脫鹽及緩衝 液交換步驟是先用緩衝液A進行柱平衡，然後將Curcin粗提液作為樣品上樣，並收集上樣 後第一個280nm吸收峰的組分，其中緩衝液A為Tris-HCl緩衝液，填料採用S印hadex G 25superfine填料，流速為100_200cm/h，檢測器波長選擇280nm。
3.根據權利要求1所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法中陰離子交換層 析步驟是先用緩衝液A進行柱平衡，然後將脫鹽及緩衝液交換步驟收集的組分作為樣品上 樣，上樣後收集穿透組分，其中緩衝液A為Tris-HCl緩衝液，填料採用QSepharose FF填料， 流速為100-200cm/h，檢測器波長選擇280nm。
4.根據權利要求1所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法中稀釋步驟用緩 衝液B對陰離子交換層析步驟收集的組分進行稀釋，稀釋倍數10-30倍，其中緩衝液B為檸 檬酸三鈉緩衝液。
5.根據權利要求1所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法中陽離子交換層 析步驟採用具有二元泵混合系統的液相色譜儀，其中A泵輸送緩衝液B，B泵輸送緩衝液C， 且A、B兩泵的液體能以任意比例混合，層析時，先用A泵輸送緩衝液B進行柱平衡，然後將 稀釋步驟稀釋後的組分溶液作為樣品上樣，上樣後先用A泵輸送緩衝液B衝洗2-4個柱體 積，再用A、B兩泵同時輸送緩衝液B、C並依次進行階段洗脫和線性梯度洗脫，階段洗脫的 長度為4-6個柱體積，線性梯度洗脫的長度為18-22個柱體積，並收集線性梯度洗脫階段 最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品，其中緩衝液B為檸檬酸三鈉 緩衝液，緩衝液C為檸檬酸三鈉_氯化鈉緩衝液，填料採用SP Sepharose HP填料，流速為 100-200cm/h，檢測器波長選擇280nm。
6.根據權利要求2或3所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法使用的緩衝 液 A，即 Tris-HCl 緩衝液中 Tris 的濃度為 20_50mM，pH 8. 0-8. 5。
7.根據權利要求4或5所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法使用的緩衝 液B，即檸檬酸三鈉緩衝液中檸檬酸三鈉的濃度為20-50mM，pH 4. 8-5. 2。
8.根據權利要求5所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法使用的緩衝液C， 即檸檬酸三鈉_氯化鈉緩衝液是在緩衝液B中加入0. 9-1. IM的氯化鈉經攪拌溶解均勻而 成，pH 4. 8-5. 2。
9.根據權利要求5或8所述的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，該方法在階段洗脫 時B泵輸送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量為9-11%，在線性梯度洗脫時，B泵輸 送的緩衝液C在混合液體中的體積百分含量由起始點以線性方式逐漸增加至結束點。其中 起始點的體積百分含量為9-11%，結束點的體積百分含量為38-42%。
全文摘要
本發明公開的麻瘋樹種仁毒蛋白的分離純化方法，是將製備的Curcin粗提液先進行脫鹽及緩衝液交換並收集上樣後第一個280nm吸收峰的組分，然後將收集的組分進行陰離子交換層析並收集上樣後穿透組分，再後將收集的穿透組分用緩衝液進行稀釋，最後將稀釋後的組分溶液進行陽離子交換層析，並收集最高的280nm吸收峰的組分，該組分即為最終的Curcin純品。由於本發明的分離提純能力高，因而不僅提高了終產物的純度和活性，終產物得率有所提高，且工藝周期耗時大大縮短，工藝可放大性好，生產成本低，可為Curcin的各種產品研發以及基於Curcin的深入而精細的基礎研究提供強有力的支撐。
文檔編號C07K1/18GK101891798SQ20101011547
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月2日 優先權日2010年3月2日
發明者徐鶯, 蔡峰, 陳放 申請人:四川大學