胃癌檢測用的標誌物和胃癌檢測方法

2023-07-03 05:04:46 1

專利名稱：胃癌檢測用的標誌物和胃癌檢測方法
技術領域：
本發明涉及將COTLl蛋白質作為胃癌檢測用標誌物，通過測定其在體液中的濃度來檢測胃癌的胃癌檢測方法。本發明還涉及包含能夠與用於檢測胃癌的上述蛋白質結合的物質的胃癌的檢測用試劑盒。
背景技術：
胃是具有將飲食物貯藏幾個小時，通過期間分泌的胃酸使飲食物變為酸性而防止腐敗，並且通過消化酶將飲食物消化的功能的重要的消化系統器官。胃癌的發生頻率，在日本每10萬人口大致為50 60人左右，男女比為I 2:1，呈現男性發病較高的傾向。另外，其死亡數每年約5萬人，佔所有癌的17%，從第二次世界大戰之後到1990年初，胃癌曾佔各部位癌死亡率的第一位。雖然現在隨著患者數逐年減少而緊隨肺癌列第二位，但依然是患者數較多的疾病。此外從全世界範圍來看，胃癌在日本、韓國、中國等亞洲地區以及南美的患者較多。作為胃癌的危險因子，一般可列舉吸菸、食鹽攝取過多的飲食習慣、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染等。胃癌的治療已知有內窺鏡治療、外科手術、化學療法、放射線療法等。綜合考慮病期、腫瘤的大小和/或侵入深度、轉移的程度等來施用。治療方針依照2004年日本胃癌學會製成的「胃癌治療方針」來確定。在早期胃癌的情況下，可以通過內窺鏡切除或者外科手術完全切除，復發率也非常低。另一方面，在進展期胃癌的情況下，即使摘除病變也存在手術時未能發現的微小的轉移病灶，復發的情況不少。胃癌在早期發現的情況下預後較好，通常90%以上可以完全治癒。但較大的腫瘤和/或轉移後的治療成績較差，為5年生存率約70%。因此其早期發現具有重要性。然而，大多數的胃癌在早期階段是無症狀的，很多情況下如果不是癌進展之後則不會出現明確的自覺症狀。因此通過自覺症狀來早期發現胃癌是困難的。作為自覺症狀，隨著胃癌的進展，可見軟便化、黑色便、噁心、胃部不適等，另外作為全身性症狀，可見易疲勞感、發燒、體重減輕、貧血等。隨著病情進一步進展，腫瘤增大，才會感覺到腹部有疙瘩。並且即使出現這樣的自覺症狀之後，患者也常有放置病情的傾向，通過體檢時的X射線照相才初次發現已經是進展的狀態的情況也不少。因此，開發出在早期階段高靈敏度且準確地檢查胃癌的檢測方法變得重要。作為胃癌的檢查法，有利用超聲波檢查、CT檢查、血管造影檢查、X射線照相等的圖像診斷法。圖像診斷法雖然對於發現早期較小胃癌是有用的方法，但在例如健康診斷等以大量被測人為對象時不能說是有效的方法，並且還存在診斷所需的費用比較高的問題。隨著近年的基因組分析或蛋白質組分析的技術進步，作為癌領域的研究成果各種新的腫瘤標誌物候選逐漸被發現(例如專利文獻I、專利文獻2)。由於對特定癌為特異性且靈敏度高的血中標誌物被認為能夠進行比較廉價且高通量的檢查和/或診斷，因而其開發被寄予厚望。作為探索標誌物的方法，可列舉比較癌細胞與非癌細胞在基因表達和/或蛋白質或細胞的代謝產物等的量的方法，和/或測定癌患者和非癌患者的體液中所含的mRNA、蛋白質或代謝產物等的量的方法。現在，作為被臨床使用的胃癌腫瘤標誌物，已知CEA、BFP、NCC-ST-439、CA72-4、CA 19-9等。此外在組織中發現了胃蛋白酶原C(非專利文獻I)、hnRNP A2/B1 (非專利文獻2)、NSP3、轉膠蛋白、抗增殖蛋白、HSP27、蛋白質二硫鍵異構酶A3、GRP58(非專利文獻3)等標誌物候選。然而，這些標誌物和標誌物候選特異性和/或檢測靈敏度的不足，還未能確立利用來自活體樣品的這些標誌物和標誌物候選的有效的檢測方法。因此，其利用僅限於治療後的跟蹤觀察這樣的有限目的，所以期盼特異性和檢測靈敏度更高的胃癌標誌物。現有技術文獻專利文獻
專利文獻I :國際公開W02005/001126專利文獻2 :國際公開TO2003/060121非專利文獻非專利文獻I :Melle, C.等、Journal of proteome research、2。。5、第 5 卷、p.1799-1804非專利文獻2 :Lee, C.等、Proteomics、2005、第 5 卷、p. 1160-1166非專利文獻3 :Ryu, J. W.等、Journal Korean Medical Science、2003、第 18 卷、p. 505-509

發明內容
發明要解決的課題本發明的課題是提供對胃癌檢測有用的腫瘤標誌物以及使用了該腫瘤標誌物的胃癌檢測方法。用於解決課題的方法為了解決上述課題，本發明者們對胃癌患者的血液和健常體的血液中存在的蛋白質群進行了比較，從而作為在胃癌患者的血液中被檢測出的新的腫瘤標誌物，發現了 C0TL1蛋白質，從而完成了本發明。「C0TL1」(肌動蛋白輔助蛋白樣I, coactosin-likel)蛋白質是肌動蛋白細胞 骨架結合性蛋白質，已報告在細胞內與5-脂氧合酶結合，被認為參與白三烯的生物合成(Provost P.等、2001 年、Journal of Biological Chemistry、第 276 卷、p. 16520-16527)。另外，已報告該蛋白質伴隨風溼的發病而其血中濃度升高(Eun-Heui J.等、2009年、Experimental and Molecular Medicine、第 41 卷、p. 354-361)。並且，已知在膜腺癌組織中表達高(Nakatsura T.等、2001 年、Biochemical and Biophysical ResearchCommuni cat ion、第256卷、p. 75-80)。然而,至今為止尚未知關於C0TL1蛋白質與胃癌的相關性的報告。因此，本發明包含以下發明。(I) 一種胃癌檢測方法，其中，體外測定來源於被測體的體液中存在的胃癌檢測用標誌物的量，並基於該量來確定胃癌的罹患，所述胃癌檢測用標誌物包含C0TL1蛋白質、該C0TL1蛋白質的突變體和/或它們的片段。
(2)根據⑴所述的方法，其中，上述COTLl蛋白質為序列號I所示的多肽。(3)根據(I)或(2)所述的方法，其中，在被測體的上述胃癌檢測用標誌物的量和健常體的該量相比統計學上有意義的多時，確定為罹患胃癌。(4)根據(3)所述的方法，其中，上述統計學上有意義的多的量是健常體的2倍以上。(5)根據(I) (4)的任一項所述的方法，其中，上述測定使用能和上述胃癌檢測用標誌物特異性結合的物質。(6)根據(5)所述的方法，其中，上述能和胃癌檢測用標誌物特異性結合的物質為抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段。 (7)根據⑴ (6)的任一項所述的方法，其中，上述胃癌為早期胃癌。(8)根據⑴ (7)的任一項所述的方法，其中，上述體液樣品為血液或尿。(9) 一種胃癌檢測用試劑盒，包含抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體、它們的片段和/或它們的化學修飾衍生物。本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本專利申請2010-046613號的說明書和/或附圖所記載的內容。發明的效果通過本發明，能夠容易且高可靠性地檢測胃癌。例如，僅通過測定胃癌患者的血液等體液樣品中所含的COTLl蛋白質的濃度，就可以容易地判定是否是胃癌。根據本發明的胃癌檢測方法，在早期癌的情況下也能夠檢出這方面是有效的。


圖I是通過蛋白質印跡法檢測胃癌患者和健常人的血漿中的COTLl蛋白質而得的圖。圖2是通過夾心ELISA法檢測胃癌患者和健常人的血漿中的CEA(圖2A)和CA 19-9 (圖2B)而得的圖。
具體實施例方式I.胃癌檢測用標誌物(概要)本發明的第一方式涉及用於檢測胃癌的胃癌檢測用標誌物。本發明是基於COTLl蛋白質在胃癌患者血液中的比健常人更多地存在的見解而做出的。如後述的本發明的第二方式中所說明的那樣，根據被測體的血液中存在的該蛋白質的量的多少，可以檢測出該被測體的胃癌的罹患。(發明的構成)在本發明中，「胃癌檢測標誌物」是用於檢測胃癌的生物學標誌物，是指成為顯示被測體罹患胃癌的指標的物質。本發明的胃癌檢測用標誌物包含COTLl蛋白質、該COTLl蛋白質的突變體和/或它們的片段(以下在本說明書中將它們歸納起來，有時稱為「C0TL1蛋白質等」)。本發明的「C0TL1蛋白質」如上所述是肌動蛋白細胞骨架結合性蛋白質。在本發明中，對應於由142個胺基酸組成的約17KDa的各生物種COTLl蛋白質，優選為來源於人的COTLl蛋白質(GenBank登錄號NP_066972. I)，具體為序列號I所示的多肽。另外，COTLl蛋白質還可以是COTLl蛋白質、特別是來源於人的COTLl蛋白質的突變體或野生型和/或突變型的COTLl蛋白質的片段。本發明者們搞清楚了，COTLl蛋白質等由胃癌細胞產生，在胃癌患者中，多於健常體的量漏出到體液中。在本說明書中，上述COTLl蛋白質「突變體」，是指在構成COTLl蛋白質、優選為序列號I所示的來源於人的野生型COTLl蛋白質的胺基酸序列或其部分序列中，包含I個以上、優選為I個 幾個胺基酸的缺失、置換、添加或插入的突變體，或者是指與該胺基酸序列或其部分序列顯示約80%以上、約85%以上、優選為約90%以上、更優選為約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上的同一性百分數的突變體。在這裡，「幾個」是指 約10、9、8、7、6、5、4、3或2個以下的整數。此外，「同一性百分數」可以使用利用BLAST和/或FASTA的蛋白質檢索系統，在導入間隙或者不導入間隙的條件下確定。(Karlin，S.等、1993 年、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、第 90 卷、p. 5873-5877 ;Altschul, S. F.等、1990 年、Journal of Molecular Biology> 第 215 卷、p. 403-410; Pearson, ff. R.等、1988 年、Proceedings of the NationalAcademic SciencesU. S. A.、第85卷、p. 2444-24488)。作為COTLl蛋白質的突變體的具體例，可列舉基於被測體的種類(例如，在被測人的情況下為種族)和/或個體的多態性(含SNIPs)、剪接突變
坐寸o在本說明書中，「片段」是指下述多肽片段，所述多肽片段包含構成野生型C0TL1蛋白質、優選為序列號I所示的來源於人的野生型C0TL1蛋白質或其突變體的胺基酸的至少7個以上且少於總數、至少10個以上且少於總數、至少15個以上且少於總數、優選至少20個以上且少於總數、至少25個以上且少於總數、更優選至少35個以上且少於總數、至少40個以上且少於總數、至少50個以上且少於總數的連續胺基酸殘基，且保持I個或幾個表位。這樣的片段可以與後述的本發明所涉及的抗體或其片段免疫特異性地結合。這樣的肽片段也包含在C0TL1蛋白質中的原因是，即使被片段化，只要能定量血液中的C0TL1蛋白質，就能實現本發明的目的，而且，血液中的上述野生型C0TL1蛋白質(優選為序列號I所示的來源於人的野生型C0TL1蛋白質)或其突變體的全長多肽，也可能被例如血液中存在的蛋白酶和/或肽酶等片段化而存在。2.胃癌檢測方法(概述)本發明的第二方式涉及檢測胃癌的方法。本發明是基於C0TL1蛋白質在胃癌患者的血液中比健常人更多地存在的見解，測定來源於被測體的體液中存在的本發明的胃癌檢測用標誌物的量，由其結果來檢測胃癌的方法。(發明的構成)本發明的方法包括⑴胃癌檢測用標誌物測定工序，和⑵罹患確定工序。以下對於各個工序進行詳細說明。2-1.胃癌檢測用標誌物測定工序「胃癌檢測用標誌物測定工序」，是體外測定來源於被測體的體液中存在的本發明的胃癌檢測用標誌物即C0TL1蛋白質、該C0TL1蛋白質的突變體和/或它們的片段的量的工序。在本說明書中，「被測體」是成為胃癌罹患的檢測對象的樣本，對應於脊椎動物，優選為哺乳動物，特別優選為人。在本說明書中，在被測體是人的情況下，以後特別稱為「被測人」。在本說明書中，「體液」是被提供用於胃癌檢測的樣品，是指生物學上的流體。體液只要是可能含有本發明的胃癌檢測用標誌物的生物學上的流體即可，不特別限定。包含例如，血液、尿、淋巴細胞培養上清、腦脊液、消化液(包含胃液、唾液)、汗、腹水、鼻粘液、淚、陰道分泌液、精液等。優選為血液或者尿。這裡所說的「血液」包含全血、血漿和血清。全血不分靜脈血、動脈血或臍帶血。體液也可以是由同一個體獲得的兩種以上不同體液的組合。由於本發明的胃癌檢測方法通過侵襲性低的血液和/或尿也能夠檢測，所以作為簡便的檢測方法非常有用。「來源於被測體的體液」是指已經從被測體採取的體液，本發明的方式並不包含採 取體液的行為本身。關於來源於被測體的體液，可以在從被測體採取之後直接用於本發明的方法，也可以在採取後直接或實施適當的處理之後進行冷藏或冷凍，並在供給至本發明的方法之前恢復到室溫再使用。作為冷藏或冷凍前的適當的處理，包括例如向全血中添加肝素等進行抗凝固處理後，再作為血漿或血清分離等。這些處理基於本領域公知的技術來進行即可。在本說明書中，「本發明的胃癌檢測用標誌物的量」是指來源於被測體的體液中存在的COTLl蛋白質等的量。該量可以是絕對量或相對量的任一種。在絕對量的情況下，對應於在規定的體液量中所含的胃癌檢測用標誌物的質量或者容量。在相對量的情況下，是指通過相對於特定的測定值的來源於被測體的胃癌檢測用標誌物的測定值來表示的相對的值。可列舉例如，濃度、螢光強度、吸光度等。胃癌檢測用標誌物的量可以在體外使用公知的方法測定。可列舉例如，使用與上述蛋白質等能夠特異性地結合的物質進行測定的方法。在本說明書中，「能夠特異性地結合」是指，某物質僅能夠與本發明的目標胃癌檢測用標誌物即COTLl蛋白質、該COTLl蛋白質的突變體和/或它們的片段實質地形成複合體。這裡的「實質地」是指除了非特異性結合以外的結合。作為「能夠特異性地結合的物質」，可列舉例如COTLl結合蛋白質等。更具體地說，例如，以COTLl蛋白質作為抗原，識別並結合該抗原的「抗COTLl抗體」;優選為識別並結合具有序列號I所示的胺基酸序列的多肽的抗體；或者以COTLl蛋白質的突變體作為抗原，識別並結合該抗原的「抗COTLl突變體抗體」;優選為識別並結合具有序列號I的突變體的胺基酸序列的多肽的抗體；和/或這些抗體的抗體片段。或者也可以是這些抗體的化學修飾衍生物。這裡「化學修飾衍生物」包括以下任一者在獲得或保持上述抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段的與COTLl蛋白質等特異性結合的活性方面所需的功能上的修飾；或者在檢測上述抗COTLl抗體，抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段方面所需的用於標記的修飾。功能上的修飾可列舉例如糖基化、去糖基化、PEG化。標記上的修飾可列舉利用例如螢光色素(FITC、羅丹明、德克薩斯紅(Texas Red)、Cy3、Cy5)、螢光蛋白質(例如PE、APC、GFP)、酶類(例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或者生物素或(鏈黴)親和素等進行的標記。抗體可以是多克隆抗體和單克隆抗體的任一者。為了能夠特異性地檢測，優選為單克隆抗體。與COTLl蛋白質等特異性地結合的抗COTLl多克隆抗體等(包含抗COTLl多克隆抗體、抗COTLl突變體多克隆抗體和/或對這些抗體的片段的多克隆抗體)或抗COTLl單克隆抗體等(包含抗COTLl單克隆抗體、抗COTLl突變體單克隆抗體和/或對這些抗體的片段的單克隆抗體)可以通過後述的方法製作。此外，抗人COTLl多克隆抗體已經由Protein Group公司等市售，也可利用該市售品。本發明的抗體的球蛋白類型只要具有上述特徵即可，不特別限定，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中任一種,優選為IgG和IgM0抗體片段包含例如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv、ScFv等，但不限於這些。還包含能夠通過遺傳工程學技術產生的抗體片段和衍生物。這樣的抗體包含例如合成抗體、重組抗體、多重特異性抗體(含雙重特異性抗體)、單鏈抗體等。本發明的抗COTLl蛋白質抗體等是針對包含上述蛋白質的至少5個、優選為至少8個胺基酸的I個或幾個表位的抗體。特異性的多克隆抗體例如可以通過以下方法製作，所述方法包括在瓊脂糖等載體上結合了 COTLl蛋白質等的柱 中通入免疫了該蛋白質的兔等的抗血清,再回收結合於柱載體上的IgG抗體的工序。(I)抗COTLl抗體的製作以下具體說明本發明中使用的抗COTLl多克隆抗體等和抗COTLl單克隆抗體等的製作方法。(1-1)免疫原的調製在本發明中製作抗體時，調製作為免疫原(抗原)的COTLl蛋白質等。能夠在本發明中作為免疫原使用的COTLl蛋白質，例如具有序列號I所示的胺基酸序列的人COTLl蛋白質或者其突變體或者其多肽片段，或者它們與其他肽(例如，信號肽、標記肽等)的融合多肽。作為免疫原的COTLl蛋白質，例如可以利用序列號I的胺基酸序列信息，通過本技術領域公知的方法、例如固相肽合成法等，來合成用作免疫原的COTLl蛋白質片段。在使用COTLl蛋白質片段作為免疫原的情況下，優選將其與KLH、BSA等載體蛋白質連接而使用。此外，作為免疫原的COTLl蛋白質等也可以利用公知的DNA重組技術獲得。編碼COTLl蛋白質等的cDNA可以通過cDNA克隆化法製作。從表達免疫原COTLl基因等的胃上皮細胞等生物體組織中提取總RNA，將其使用寡聚dT纖維素柱處理，從所得的多聚A (+) RNA通過RT-PCR法製作cDNA文庫，由該文庫通過雜交篩選、表達篩選、抗體篩選等篩選來獲得目標cDNA克隆。根據需要還可以通過PCR法將cDNA進一步擴增。這樣就可以得到與目標基因對應的cDNA。cDNA克隆化技術記載於例如Sambrook, J.和Russel, D.著、MolecularCloning, A LABORATORY MANUAL (分子克隆實驗指南)、Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001年I月15日發行、第I卷7. 42 7. 45、第2卷8. 9 8. 17。接下來，將通過上述方法等獲得的cDNA克隆整合到表達載體中，再通過培養用該載體進行了轉化或轉染的原核或真核宿主細胞，從而可以從該細胞獲得目標的C0TL1蛋白質等。此時，在從培養上清中獲取目標的蛋白質等的情況下，可以通過在編碼該多肽的DNA的5』末端側翼化編碼分泌信號序列的核苷酸序列，從而使成熟多肽分泌到細胞外。作為表達載體，可列舉來源於大腸菌的質粒(例如pET21a、pGEX4T、pC118、pC119、pC18、pC19等)、來源於枯草菌的質粒(例如pUBllO、pTP5等)、來源於酵母的質粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50等)，作為噬菌體DNA可列舉入-噬菌體(入gtll、入ZAP等)。並且，也可以使用牛痘病毒等動物病毒、杆狀病毒等昆蟲病毒載體。載體和表達系統可以從Novagen公司、寶酒造、第一化學藥品、Qiagen公司、Stratagene公司、Promega公司、RocheDiagnositics 公司、Invitrogen 公司、Genetics Institute 公司、GE Healthcare 公司等購得。為了向表達載體插入COTLl蛋白質等的cDNA，可採用首先，將純化後的DNA用適當的限制性酶切斷，再插入到合適的限制性酶位點或者多克隆位點而與載體連接的方法等。載體除了含有編碼該蛋白質的DNA之外，還可 以含有調節元件，例如啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、核糖體結合位點、複製起始位點、終止子、選擇標誌物等。此外為容易地純化多肽可以在多肽的C末端或者N末端連接標記肽而製成融合多肽。代表性的標記肽可列舉6 10個殘基的組氨酸重複、FLAG、myC肽、GFP蛋白質等，但標記肽不限於這些，此外，關於DNA重組技術在Sambrook, J.和Russel, D.(上述)中記載。為了將DNA片段與載體片段連接，使用公知的DNA連接酶。作為宿主細胞,可以使用細菌等原核細胞(例如大腸桿菌(Escherichia coli)等大腸菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等枯草菌)、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆蟲細胞(例如，Sf細胞)、哺乳動物細胞(例如，COS、CHO、BHK)等。向宿主細胞中導入重組載體的導入方法只要是向各個宿主導入DNA的方法即可，沒有特別限定。向細菌導入該載體的方法，可列舉例如，熱激法、使用鈣離子的方法、電穿孔法等。這些技術都是本領域公知的,在各種文獻中記載。例如可參照Sambrook, J.et. al. , (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Second Ed.(分子克隆實驗指南第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York0Jlt^,向動物細胞導入該載體的方法，優選使用例如脂質體轉染法(PNAS (1989) Vol. 86，6077)、(PNAS(1987) Vol. 84，7413)、電穿孔轉染法、磷酸鈣法(Virology (1973) Vol. 52，456-467)、使用脂質體的方法、DEAE-Dextran (DEAE-葡聚糖)法等。作為用於培養以大腸菌、酵母菌等微生物作為宿主獲得的轉化體的培養基，含有微生物能夠同化的碳源、氮源、無機鹽類等，只要是能有效地進行轉化體的培養的培養基即可，可以使用天然培養基、合成培養基的任一者。培養通常在震蕩培養或者通風攪拌培養等有氧條件下、在37°C進行6 24小時。培養過程中pH值保持在中性附近。pH值的調整使用無機或有機酸、鹼溶液等進行。培養中可根據需要在培養基中添加氨苄青黴素和/或四環素等抗生素。在培養哺乳動物細胞等的轉化體的情況下，也在適合各種細胞的培養基中培養後，回收培養上清或者細胞內所生產的蛋白質。此時培養基可以含有血清，也可以不含有血清，但更優選在無血清培養基中培養。在COTLl蛋白質等在菌體內或者細胞內的情況下，通過破碎菌體或細胞來提取蛋白質。此外在COTLl蛋白質等在菌體外或者細胞外生產的情況下，直接使用培養液，或者通過離心分離等除去菌體或者細胞。在不附加標記肽的情況下生產本發明的蛋白質的情況下，作為其純化法可列舉例如利用離子交換層析的方法。此外也可以是組合凝膠過濾層析和/或疏水性層析、等電點層析等的方法。此外，在該蛋白質上帶有組氨酸重複、FLAG、myc、GFP等標記肽的情況下,可以列舉利用一般使用的適合各種標記肽的親和層析的方法。優選構建分離和/或純化容易的表達載體。特別是如果以多肽與標記肽的融合蛋白質的形態表達的方式構建表達載體，用遺傳工程學的方法調製該蛋白質，則分離和/或純化也容易。是否真正獲得了 COTLl蛋白質等，可以通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳等來確認。(1-2)抗體的製作以這樣獲得的COTLl蛋白質等作為抗原，可以獲得特異性地識別COTLl蛋白質等的抗體。更具體地說，蛋白質、蛋白質片段、蛋白質突變體、融合蛋白質等，包含用於引起抗體形成的抗原決定簇或者表位，這些抗原決定簇或表位既可以是直鏈，也可以是更高級結構(斷續的)。此外，該抗原決定簇或表位可以通過在本技術領域已知的所有方法來鑑定。通過本發明的蛋白質可以誘導所有形態的抗體。只要分離出該蛋白質的全部或者一部分或者表位，就可以用常用的技術製造多克隆抗體和單克隆抗體的任一者。方法例如有 Kennet 等(主編)，Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension inBiological Analyses, Plenum Press, New York, 1980 中所列舉的方法。 (1-2-1)多克隆抗體的製作為了製作多克隆抗體，首先將所得的C0TL1蛋白質等在緩衝液中溶解調製免疫原。此外，根據需要，為了有效地進行免疫可以添加佐劑。作為佐劑的例子，可列舉市售的弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)等，可以將它們單獨或者混合使用。接下來，將上述調製的免疫原對哺乳動物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/C)、兔等施與、免疫。免疫原的一次的施與量根據免疫動物的種類、施與途徑等適宜確定，每I只動物約50 200 u g。作為免疫原的施與方法，可列舉例如，使用FIA或FCA進行的皮下注射、使用FIA進行的腹腔內注射、以及使用0. 15mol/L的氯化鈉進行的靜脈注射等，但不限於此。此外，對免疫的間隔不特別限定，初次免疫之後，以幾天到幾周間隔、優選以I 4周間隔進行2 10次、優選為3 4次追加免疫。初次免疫後，通過ELISA (Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,酶聯免疫吸附測定)法等來反覆測定免疫動物血清中的抗體效價，當抗體效價達到平高線(Plateau)時，向靜脈內或者腹腔內注射免疫原，作為最終免疫。免疫之後，可以從血液中回收針對C0TL1蛋白質等的多克隆抗體。在需要單克隆抗體的情況下，製作後述的產生抗C0TL1抗體的雜交瘤。(1-2-2)單克隆抗體的製作從免疫動物回收產生抗體的細胞根據本發明，可以製作生產特異性地識別C0TL1蛋白質等的抗C0TL1單克隆抗體的雜交瘤。這種雜交瘤能夠通過常用的技術產生並且鑑定。用於產生這種雜交瘤的方法之一，將動物用本發明的蛋白質免疫，從免疫後的動物採取產生抗體的細胞，並使該產生抗體的細胞與骨髓瘤(myeloma)細胞株融合，由此生產雜交瘤細胞，並且鑑定產生與C0TL1蛋白質等結合的單克隆抗體的雜交瘤即可。作為產生抗體的細胞，可列舉脾細胞、淋巴結細胞、末梢血細胞等，優選脾細胞或局部淋巴結細胞。這些細胞使用從用C0TL1蛋白質等免疫過的動物中摘出或者採取的即可。對動物免疫的方法依據上述多克隆抗體製作的項。作為與產生抗體的細胞融合的骨髓瘤細胞株，可以使用小鼠等動物的一般可以購得的株化細胞。作為使用的細胞株，優選具有藥劑選擇性，並具有在未融合的狀態下在HAT選擇性培養基(含有次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中無法生存、只有在與產生抗體的細胞融合了的狀態下才能生存的性質。此外株化細胞優選來源於與免疫動物同種系的動物。作為骨髓瘤細胞株的具體例，有來源於BALB/c小鼠的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺陷細胞株 P3X63-Ag. 8 株(ATCC TIB9)、P3X63_Ag. 8. Ul 株(JCRB9085)、P3/NSI/l_Ag4_l 株(JCRB0009)、P3x63Ag8. 653 株(JCRB0028)或 Sp2/0_Agl4 株(JCRB0029)等。細胞融合細胞融合，在不含血清的DMEM、RPMI-1640培養基等動物細胞用培養基中，將產生抗體的細胞和骨髓瘤細胞株以約I: I 20:1的比例混合，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應。作為細胞融合促進劑，可以以約10 80%濃度使用平均分子量為1500 4000道爾頓的聚乙二醇等。另外根據情況不同，為提高融合效率也可以並用二甲基亞碸等輔助齊U。還可以進一步使用利用了電刺激(例如電穿孔)的市售的細胞融合裝置來使產生抗體的細胞和骨髓瘤細胞株融合(Nature, 1977，Vol. 266，550-552)。雜交瘤的分選和克隆化從細胞融合處理後的細胞中分選出作為目標的產生抗COTLl抗體等的雜交瘤。作為其方法，將細胞懸浮液用例如含胎牛血清的RPMI-1640培養基等進行適當的稀釋後，在 微量滴定板上以200萬個/孔左右接種。向各孔內加入選擇培養基，之後適當地更換選擇培養基進行培養。培養溫度為20 40°C，優選為約37°C。在骨髓瘤細胞為HGPRT缺陷株或者胸苷激酶缺陷株的情況下，可以通過使用含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的選擇性培養基(HAT培養基)僅選擇性地培養具有產生抗體的能力的細胞與骨髓瘤細胞株的雜交瘤，使其增殖。其結果是，可以獲得從使用選擇培養基開始培養後約14天前後生長的細胞作為雜交瘤。接下來，篩選在增殖的雜交瘤的培養上清中是否存在目標抗體。雜交瘤的篩選按照通常的方法即可，不特別限定。例如，採取作為雜交瘤生長的孔中所含的培養上清的一部分，通過酶免疫測定法(EIA =Enzyme Immuno Assay、和ELISA)、放射線免疫測定法(RIA Radio Immuno Assay)等來進行。融合細胞的篩選通過有限稀釋法等來進行，最終樹立作為產生單克隆抗體的細胞的雜交瘤。本發明的雜交瘤如下所述，在利用RPMI-1640、DMEM等基本培養基的培養中是穩定的，並產生、分泌與來源於胃癌的COTLl蛋白質特異性地反應的單克隆抗體。抗體的回收單克隆抗體可以使用常用的技術回收。即，作為從樹立好的雜交瘤中採取單克隆抗體的方法，採用通常的細胞培養法或者腹水形成法等。在細胞培養中，將雜交瘤在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基、MEM培養基或者無血清培養基等動物細胞培養基中，在常用的培養條件(例如37°C、5% CO2濃度)下培養2 10天，從其培養上清中獲得抗體。在腹水形成法的情況下，可以將雜交瘤以約1000萬個施與至與骨髓瘤細胞所來源的哺乳動物同種系的動物的腹腔內，使雜交瘤大量增殖。然後在I 2周之後採取腹水或者血清。在上述抗體的採取方法中，如果需要純化抗體，則可以適宜選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析法、親和層析法、凝膠層析法等公知的方法，或者通過上述方法的組合，從而獲得被純化的本發明的單克隆抗體。本發明的單克隆抗體包含嵌合抗體，例如鼠科單克隆抗體的人化型。此外，根據本發明，還可提供上述抗體的抗原結合片段。作為可以使用常用的技術產生的抗原結合片段的例子，包含Fab及F(ab』)2片段，但不限於這些。此外也可提供可以通過遺傳工程學技術產生的抗體片段和衍生物。本發明的抗體在體外和體內的任一種情況都可以在用於檢測本發明的多肽或其(多)肽片段的存在的分析中使用。此外本發明的抗體也可以用於通過免疫親和層析法來純化蛋白質或者蛋白質片段。為了實現分析中的特異性檢測，優選使用單克隆抗體，但即使是多克隆抗體，也可以通過所謂吸收法獲得特異抗體，所述吸收法包含使抗體與結合有純化多肽的親和柱結
口 o(2)使用抗COTLl抗體等的本發明的胃癌檢測用標誌物的體外測定作為使用上述(I)所製作的抗COTLl抗體等，來體外測定來源於被測人的體液中所存在的本發明的胃癌檢測用標誌物、即COTLl蛋白質等的量的方法(用免疫學方法)，可列舉例如，酶免疫測定法(ELISA、EIA)、螢光免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)、發光免疫測定法、免疫比濁法、膠乳凝集反應、膠乳比濁法、紅血球凝集反應、顆粒凝集反應或者蛋白 質印跡法。在將本發明的胃癌檢測用標誌物測定方法通過酶免疫測定法、螢光免疫測定法、放射免疫測定法或者發光免疫測定法等使用標記的免疫測定法來實施的情況下，優選將上述抗COTLl抗體等進行固定化，或者將樣品中的成分固定化，從而進行這些免疫學反應。作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、膠乳、明膠、瓊脂糖、纖維素、Sepharose (瓊脂糖凝膠)、玻璃、金屬、陶瓷或者磁性體等材質製成的珠、微板、試管、棒或者試驗片等形狀的不溶性載體。固定化可以如下進行按照物理吸附法、化學結合法或它們的並用等公知的方法，使固相載體與上述抗COTLl抗體等或樣品成分結合。在本發明中，為了更容易地檢測上述抗COTLl抗體等與體液中的來源於胃癌細胞的本發明的胃癌檢測用標誌物的反應，可以通過標記上述抗COTLl抗體等來直接檢測該反 應，或者通過使用標記二抗來間接檢測該反應。在本發明的胃癌檢測方法中，從靈敏度的方面考慮，優選利用後者的間接檢測(例如夾心法等)。作為標記物質，在酶免疫測定法的情況下，可以使用過氧化物酶(POD)、鹼性磷酸酶、P -半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、澱粉酶或者生物素-親和素複合體等；在螢光免疫測定法的情況下，可以使用異硫氰酸螢光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、取代異硫氰酸羅丹明、二氯三嗪基異硫氰酸酯、Alexa或AlexaFluoro等；而且在放射免疫測定法的情況下，可以使用氚、碘125或碘131等。此外發光免疫測定法可以使用NADH-、FMNH2-、螢光素酶系、魯米諾-過氧化氫-POD系、吖啶酯系或者二氧雜環丁烷化合物系等。關於標記物質與抗體的結合方法，在酶免疫測定法的情況下，可以使用戊二醛法、馬來醯亞胺法、二硫化吡啶法或者高碘酸法等公知的方法；在放射免疫測定法的情況下，可以使用氯胺T法、鮑爾通-亨特(Bolton-Hunter)法等公知的方法。測定的操作法可以通過公知的方法(Current protocols in Protein Sciences、1995 年、John ffiley&Sons Inc.、Current protocols in Immunology、2001 年、John ffiley&Sons Inc.)進行。例如，在將上述抗COTLl抗體等直接標記的情況下，可以將體液中的成分固定化，使其與標記後的上述抗C0TL1抗體等接觸，形成本發明的胃癌檢測用標誌物(C0TL1蛋白質等)-抗C0TL1抗體等的複合體。然後清洗分離未結合的標記抗體，通過結合標記抗體量或未結合標記抗體量，可以測定體液中的胃癌檢測用標誌物(C0TL1蛋白質等)的量。
此外，例如，在使用標記二抗的情況下，使本發明的抗體與樣品反應(一次反應)，再與標記二抗反應(二次反應)。一次反應和二次反應可以以相反的順序進行，也可以同時進行，或延遲時間進行。通過一次反應和二次反應，形成固定化了的本發明的胃癌檢測用標誌物-抗COTLl抗體等-標記二抗的複合體、或者固定化了的抗COTLl抗體等-本發明的胃癌檢測用標誌物-標記二抗的複合體。然後清洗分離未結合的標記二抗，通過結合標記二抗量或未結合標記二抗量，可以測定樣品中的胃癌檢測用標誌物的質量。具體地，在酶免疫測定法的情況下，使標記酶在其最適條件下與底物反應，通過光學方法等測定其反應生成物的量。在螢光免疫測定法的情況下，測定標記螢光物質產生的螢光強度；在放射免疫測定法的情況下，測定放射性物質標記產生的放射能量。在發光免疫測定法的情況下，測定發光反應系統產生的發光量。在本發明的方法中，在對於將免疫比濁法、膠乳凝集反應、膠乳比濁法、紅血球凝集反應或顆粒凝集反應等的免疫複合體凝集物的生成，通過利用光學方法測定其透射光或散射光、或目測測定的測定法來實施的情況下，作為溶劑可以使用磷酸緩衝液、甘氨酸緩衝 液、Tris緩衝液或者Good緩衝液等，還可以在反應系中進一步含有聚乙二醇等反應促進劑和/或非特異性的反應抑制劑。顯示本發明的檢測法的優選實施方式的一例。首先將本發明的抗體作為一抗固定於不溶性載體。並優選將未吸附抗原的固相表面用與抗原無關的蛋白質(小牛血清、牛血清白蛋白、明膠等)進行封閉。接下來使固定化的一抗與被測樣品接觸。接著，使在與上述一抗不同的部位與本發明的胃癌檢測用標誌物反應的標記二抗接觸，檢測來自該標記的信號。這裡使用的「在與一抗不同的部位與胃癌檢測用標誌物反應的二抗」只要是識別一抗與胃癌檢測用標誌物(C0TL1蛋白質等)的結合部位以外的部位的抗體即可，不特別限制，無論免疫原的種類，可以是多克隆抗體、抗血清、單克隆抗體的任一種，還可以使用這些抗體的片段(如Fab、F(ab』)2、Fab、Fv、ScFv等)。此外作為二抗還可以使用多種單克隆抗體。此外，還可以與此相反，將本發明的抗體附加標記作為二抗，將在與本發明的抗體不同的部位與胃癌檢測用標誌物反應的抗體作為一抗固定於不溶性載體，使該固定化的一抗與被測樣品接觸，接著與作為二抗的帶標記的本發明的抗體接觸，檢測來自上述標記的信號。此外因為本發明的抗體如上所述與來源於胃癌細胞的胃癌檢測用標誌物特異性地反應，所以可以作為癌的檢測藥使用。本發明的檢測藥含有本發明的抗體，因此可以使用本發明的檢測藥，通過檢測從可能罹患胃癌的個體中採取的樣品中所含的來源於胃癌細胞的胃癌檢測用標誌物，來檢測該個體的胃癌罹患。另外，本發明的檢測藥，雖然只要是用於進行免疫學測定的方法就在任一方法中都可以利用，但通過與本技術領域公知的免疫層析用試紙條等簡便的方法組合使用，可以進一步簡便且迅速地檢測癌。免疫層析用試紙條例如由包含容易吸收樣品的材料的樣品接受部、含有本發明的檢測藥的試劑部、進行樣品與檢測藥的反應生成物的移動的展開部、使展開的反應生產物顯色的標記部、進行顯色的反應生產物的展開的提示部等構成，可以製成與妊娠診斷藥相同的形態。首先，在樣品接收部加入樣品後，樣品接收部吸收樣品而使樣品到達試劑部。接著，在試劑部，樣品中的來源於胃癌細胞的胃癌檢測用標誌物與抗COTLl抗體等的反應發生，反應生成的複合體移動通過展開部而到達標記部。在標記部，上述的反應複合體與標記二抗的反應發生,與該標記二抗的反應生成物展開抵達提示部,則顯色被確認。上述免疫層析用試紙條因為完全不會帶給使用者痛苦和/或試劑使用產生的危險性，所以可以在家庭中的監測中使用，將其結果在各醫療機構水平上精查和/或治療(外科手術切除等)，從而可以預防轉移和/或復發。而且現在該試紙條可以通過例如日本特開平10-54830號公報所記載的那樣的製造方法來廉價地大量生產。此外通過將本發明的檢測藥與已知的對胃癌的腫瘤標誌物的檢測藥組合使用，可以實現可靠性高的診斷。2-2.罹患確定工序「罹患確定工序」是基於上述胃癌檢測用標誌物測定工序中測定的蛋白質的質量來確定胃癌的罹患的工序。基於測定的胃癌檢測用標誌物、即COTLl蛋白質等的質量來確定胃癌的罹患。作為確定方法的一例，可列舉例如，在被測體的胃癌檢測用標誌物的量和健常體的該量相比在統計學上有意義的多時，確定為罹患胃癌的方法。 這裡所指的「健常體」至少是指未罹患胃癌的個體，優選為健康的個體。並且健常體要和被測體為同一生物種。例如，在供檢查的被測體為人(被測人)的情況下，健常體也必須為人(在本說明書中以下稱為「健常人」)。健常體的身體條件優選與被測體相同或近似。身體條件例如，在人的情況下，對應於種族、性別、年齡、身高、體重等。「統計學上有意義的」，可列舉例如，所得的值的危險率(有意義水準)小於5%、1%或者0. 1%的情況。因此「統計學上有意義的多」是指在將從被測體和健常體分別獲得的胃癌檢測用標誌物的量的差異進行統計學處理時，兩者之間存在有意義的差異，並且被測體的上述蛋白質的量要高於健常體的該量。通常，關於體液中的胃癌檢測用標誌物的量，被測體多達健常體的2倍以上，優選為3倍以上，更優選為4倍以上，最優選為以5倍以上。如果量的差異為3倍以上，則可以說信賴度高，統計學上也有意義的多。統計學的處理的檢驗方法只要適宜使用能夠判斷有意義性的有無的公知的檢驗方法即可，不特別限定。例如，可以使用學生t檢驗法、多重比較檢驗法等方法。健常體的體液中的胃癌檢測用標誌物的量，優選使用與在上述工序中已經說明的被測體的體液中的胃癌檢測用標誌物的量的測定方法同樣的方法來測定。健常體的體液中的胃癌檢測用標誌物的量還可以在每逢測定被測體的體液中的胃癌檢測用標誌物的量時測定，但也可以利用事先測定好的胃癌檢測用標誌物的量。特別是如果事先測定好各種身體條件的健常體的胃癌檢測用標誌物的量，並將其數值輸入電腦而資料庫化，則通過在該電腦中輸入被測體的身體條件，就可以馬上利用具有與該被測體相比較最適合的身體條件的健常體的胃癌檢測用標誌物的量，因此是方便的。被測體的體液中的胃癌檢測用標誌物的量與健常體的體液中的胃癌測出用標誌物的量相比在統計學上有意義的多的情況下，判定該被測體罹患胃癌。對成為本發明的對象的胃癌的病期並沒有特別的限制，遍及早期胃癌到晚期胃癌。特別在即使是早期胃癌也能夠實現其檢測這一點，有本發明的實際效益。「早期胃癌」是指局限於腫瘤發生的局部(黏膜內)，未向周圍組織浸潤的胃癌，或者即使有浸潤其範圍也局限於局部的胃癌。早期胃癌包含病期分類的0期和I期，胃癌的早期檢測顯著提高5年生存率。這樣，根據本發明的胃癌檢測方法，包括使用抗體免疫學測定體液樣品中的胃癌檢測用標誌物的工序。通過本發明的方法，不僅可以判定被測體是否罹患胃癌，還可以識別胃癌患者和非胃癌患者。
3.胃癌檢測用試劑盒本發明的第三方式是胃癌檢測用試劑盒「胃癌檢測用試劑盒」是指為了檢測胃癌罹患的有無、罹患的程度或改善的有無和/或改善的程度，以及為了篩選對預防、改善或者治療胃癌有用的候選物質，而直接或間接地被利用的試劑盒。本方式的試劑盒，作為其構成物，包含能夠特異性識別並結合以下蛋白質的物質，所述蛋白質是在與胃癌的罹患有關的體液樣品中、特別是血液、血清、血漿中表達變動的COTLl蛋白質，優選為具有序列號I所示的胺基酸序列或者其突變體序列的蛋白質。具體地說，包括例如抗COTLl蛋白質抗體等或其片段、或者它們的化學修飾衍生物。這些抗體可以與固相載體結合。此外，還可以包含例如，標記二抗、以及為檢測標記所需的底物、載體、清洗緩衝液、樣品稀釋液、酶底物、反應停止液、純化的作為標準物質的COTLl蛋白質等、使用 說明書等。實施例以下通過實施例來更具體地說明本發明。但本發明不受該實施例限制。(I)中空絲過濾器的製作將膜表面具有截留分子量約5萬的孔徑的聚碸中空絲100根捆成束，在不使中空絲中空部堵塞的前提下將兩末端用環氧樹脂系封裝劑固定在玻璃管上，製成微型模塊。該微型模塊(模塊A)可用於去除血清或血漿中的高分子量蛋白質，其直徑約7mm，長度約為17cm。同樣地使用截留分子量約3千的孔徑的膜製成用於濃縮低分子量蛋白質的微型模塊(模塊B)。微型模塊在一側具有與中空絲內腔連接的入口，另一側的端成為出口。中空絲入口和出口是通過矽管形成的封閉循環系流路，液體受蠕動泵的驅動而在該流路內循環。另夕卜，中空絲外套的玻璃管具備使從中空絲濾出的液體排出的埠，這就構成了一個模塊組件。在循環迴路的中途介由T字的連接器連接模塊，將3根模塊A和I根模塊B串聯連接製成一個中空絲過濾器。將該中空絲過濾器用蒸餾水清洗，填充PBS (含0. 15mM NaCl的磷酸緩衝液，PH值7. 4)水溶液。分級原液的血清或血漿從該中空絲過濾器的流路入口被注入，分級、濃縮之後由流路出口被排出。注入該中空絲過濾器中的血清或血漿在每個模塊A中與分子量約5萬的分子篩作用，分子量低於5萬的低分子的成分被模塊B濃縮、調製。(I)健常人及胃癌患者血中的蛋白質檢定調製從50多歲 70多歲的胃癌患者6名獲得的血清的混合液、以及從同齡的健常人6名獲得的血清的混合液。將各混合液通過孔徑0. 22 y m的過濾器過濾除去雜質，調製成蛋白質濃度50mg/mL。將該血漿再用25mM碳酸氫銨溶液(pH值8. 0)稀釋成12. 5mg/mL，使用參考例(I)所示的中空絲過濾器根據分子量進行分級。將分級後的血清樣本(總量1.8mL、最多含有250iig的蛋白質)凍結乾燥之後，使用100 y L的25mM碳酸氫銨溶液溶液(pH值8.0)再次溶解。對於該樣本，用總蛋白質量的1/50量的胰蛋白酶，在37°C、2 3小時的條件下進行肽消化，使用脫鹽柱(Waters公司)進行脫鹽處理後，再使用離子交換柱(KYA今」 D —文)8分級。將各個級分使用反向柱(KYA 」)D—文、進一步分級，對於溶出的肽，使用在線連接的質量分析儀Q-TOF Ultima (Micromass公司)，以使用Survey Scan模式進行3次測定。作為血液蛋白質的鑑定基準，使用如下兩個基準，在能夠極力排除錯誤的蛋白質鑑定的條件下進行分析，所述基準為(i)在屬於該蛋白質的肽中，至少一條以上以P值
0.05以下的高可靠性被檢出；(ii)肽的MS數據的測定值和MS/MS數據的測定值、與肽的理論值之間的誤差為0. 3道爾頓以下。將數據在健常人和癌患者之間進行比較，在被鑑定的蛋白質中，作為3次的胃癌患者的樣本測定的MASCOT得分的平均值與健常人樣本測定MASCOT得分的平均值相比有意義的聞的蛋白質，發現了 COTLl蛋白質(表I)。表I [Wt Hit fm- 健常胃癌 Pfl胃癌
__(第I次)(第2次)(第3次)(平均)(第I次}(第2次)(第3次)(平均)
M\SCOT
得分000 0 131 130 114 125(2)通過蛋白印跡法檢測血液中的COTLl蛋白質從胃癌患者16名(I期7名、III期5名、IV期4名)以及健常對照12名獲得血漿樣本。向IOOiI L各樣本中加入IOOiiL的Affi-Gel藍膠(Bio-Rad)和50 y L的ProteinA-Sepharose (GE Healthcare),在4°C下反應一夜,去除了樣本中的白蛋白和免疫球蛋白。將這樣得到的樣本使用SDS上樣緩衝液(50mM Tris鹽酸、pH值6. 8、ImM DTT,5%SDS、10%甘油)進行可溶化和沸騰處理，進行SDS聚丙烯醯胺凝膠(16% )電泳，然後將蛋白質轉移到PVDF膜上。使其與兔多克隆抗體(Proteintech Group公司)以及過氧化物酶標記二抗反應°使用 SuperSignal West Femto MaximumSensitivitySubstrate (Pierce 公司)使X射線膜感光從而將免疫反應的蛋白質可視化,使用Scion Image (Scion Corporation)通過圖像分析將相當於COTLl的條帶的信號強度數值化。其結果是，在早期和進展期胃癌患者中，檢測到了高於健常對照人的值的血漿中C0TL1蛋白質濃度(圖I)。(I)與胃癌檢測中的CEA和CA-19的性能比較。作為比較對象的腫瘤標誌物，選擇CEA和CA-19。CEA (癌胚抗原)是在臨床上最廣泛且頻繁地被利用的腫瘤標誌物的一種，除胃癌之外，在肺癌、乳腺癌、膽道癌、胰腺癌、大腸癌等的檢測中使用。另一方面，CA19-9已知主要在胃癌、大腸癌和胰腺癌、膽囊及膽管癌的進展例中顯示高的陽性率。然而，兩種標誌物均靈敏度低，不適合早期癌的檢測。使用CagAg CEA EIA試劑盒(富士 > e才社)測定胃癌患者血漿和健常對照中的CEA水平(圖2A)。CEA僅在IV期顯示高值，不能檢測出早期胃癌。使用CagAg CA19-9EIA試劑盒(富士 >匕' 才社)測定CA 19-9水平(圖2B)。雖然存在CA19-9在III期和VI期中顯示特別高值的樣本，但不能檢測出早期胃癌。由從以上的結果證明，本發明在早期胃癌檢測上是極為優異的方法。產業可利用性本發明由於能通過簡易且廉價的方法有效地檢測胃癌，因而可以實現胃癌的早期發現、診斷和治療。此外，通過本發明的方法，能夠使用患者血液非侵襲性地檢測胃癌，因而可以簡便且迅速地檢測胃癌。 本說明書中引用的全部發行物、專利和專利申請均作為參考而引入本說明書中。
權利要求
1.一種胃癌檢測方法，其中，體外測定來源於被測體的體液中存在的胃癌檢測用標誌物的量，並基於該量來確定胃癌的罹患，所述胃癌檢測用標誌物包含C O T LI蛋白質、該COTLl蛋白質的突變體和/或它們的片段。
2.根據權利要求I所述的方法，其中，上述COTLl蛋白質為序列號I所示的多肽。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中，在被測體的上述胃癌檢測用標誌物的量和健常體的該量相比統計學上有意義的多時，確定為罹患胃癌。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，上述統計學上有意義的多的量是健常體的2倍以上。
5.根據權利要求I 4的任一項所述的方法，其中，上述測定使用能和上述胃癌檢測用標誌物特異性結合的物質。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，上述能和胃癌檢測用標誌物特異性結合的物質為抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段。
7.根據權利要求I 6的任一項所述的方法，其中，上述胃癌為早期胃癌。
8.根據權利要求I 7的任一項所述的方法，其中，上述體液樣品為血液或尿。
9.一種胃癌檢測用試劑盒，其包含抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體、它們的片段和/或它們的化學修飾衍生物。
全文摘要
本發明的目的在於提供對被測人的侵襲性低、且檢測靈敏度和準確度高的胃癌檢測方法。本發明提供體外測定來源於被測人的體液樣品中的COTL1蛋白質、該COTL1蛋白質的突變體和/或它們的片段，並基於其量來檢測胃癌罹患的有無的檢測方法，並且提供包含能夠與該蛋白質特異性結合的抗體的胃癌診斷用試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK102782500SQ20118001205
公開日2012年11月14日 申請日期2011年3月3日 優先權日2010年3月3日
發明者岡部寬, 坂井義治, 小林道元, 田中祥德, 鄭基晚, 金森智子 申請人:東麗株式會社, 國立大學法人京都大學