一種培育抗江蘇省穗頸瘟水稻品種的育種方法
2023-07-03 16:33:11
專利名稱：一種培育抗江蘇省穗頸瘟水稻品種的育種方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗江蘇省穗頸瘟水稻品種的育種方法，屬水稻遺傳改良與生物技術應用領域。背景技術：
稻痕病是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;無性態Pyriculariaoryzae)引起的水稻上最具毀滅性的病害之一，俗稱水稻的「癌症」。水稻整個生育期過程中都會受到稻瘟病病菌的侵染，依據感染的部位不同可以分為苗瘟，葉瘟，葉枕瘟、節瘟，穗頸瘟、穀粒瘟等。 其中穗頸瘟的危害大於葉瘟和其它的危害，嚴重時可以導致顆粒無收。稻瘟病在全球85個有水稻種植的國家和地區均有發生。據統計，在1975 1990年的16年間，由稻瘟病引起的全球水稻產量損失高達I. 57億噸。我國每隔7-10年就發生一次較大規模的稻瘟病危害，受害面積達300-600萬hm2，稻穀損失70-125萬噸。水稻是江蘇省第一大糧食作物，單產水平居全國之首，其中粳稻面積佔水稻面積的80%以上。稻瘟病也是江蘇省的主要水稻病害，在20世紀90年代初，發病面積達166. 67萬hm2，減產35萬噸，苗、葉、穗頸瘟都有發生，但穗頸瘟的潛在威脅最大。因此江蘇省在粳稻新品種審定過程中對穗頸瘟達到4 級的採取直接淘汰制度。稻瘟病的防治主要通過化學防治和種植抗性品種來控制病害，實踐證明，選育和推廣抗稻瘟病品種是解決這一問題的最有效、安全和環保的方法。發掘抗源和鑑定抗性基因是培育抗病品種的基礎和前提。目前從不同抗病品種中鑑定出大約80個稻瘟病抗性基 m，Pi-b、Pi_ta、Pi-d2、Pi9、Pi-21等至少20個抗稻瘟病基因已經被克隆。但除了 Pbl外這些稻瘟病抗性基因的研究都集中在苗瘟、葉瘟的抗性上，不能明確其對穗頸瘟的抗性。選擇穗頸瘟的抗病基因是穗頸瘟抗性育種的前提。我們利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi_b的功能標記對江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種進行基因型檢測，結合穗頸瘟抗性結果，通過關聯分析初步明確了 Pi-to、/74聯合效應對江蘇省粳稻稻瘟病尤其是穗頸瘟具有較好的抗性。在稻瘟病抗性育種中抗性的鑑定是基礎，鑑定方法主要有人工接種鑑定和病區自然誘發鑑定。傳統水稻抗稻瘟病種質資源的鑑定主要是大田噴霧測定，該方法所需時間較長，需要消耗大量的材料，並且受環境因素影響較大。與田間鑑定方法相比，接種鑑定可在植株生長早期進行，不受外界氣候因素影響，佔用空間小。但在品種的抗性鑑定中還存在許多問題，如鑑定方法、評價標準不統一，鑑定方法不標準、不規範，鑑定效率低，鑑定中條件難以控制等，從而使得出的鑑定結果不準確，難以用統一
標準來判斷衡量，進而影響了抗病育種工作。利用基因功能標記輔助選擇技術是根據抗病基因本身序列的差異設計引物進行的基因型選擇，利用該方法開展穗頸瘟抗性育種工作不僅選擇精確，且不受時間和環境限制。因此，在江蘇省粳稻穗頸瘟抗性育種過程中發明一種高效轉育和鑑定穗頸瘟抗性基因的育種方法，聚合高產、多抗病基因於一體，是本發明的宗旨。三、發明內容技術問題本發明涉及一種培育抗江蘇省穗頸瘟水稻品種的育種方法，採用高效轉育和抗性基因聚合選擇的育種方法，將高產、抗病基因聚合於一體，減少育種成本、縮短育種周期是本發明的宗旨。技術方案
一種培育抗江蘇省粳稻穗頸瘟水稻新品種的育種方法，其特徵在於
1)選用中感穗頸瘟的江蘇高產水稻品種淮稻10(.Pi-taPi-tapi-bpi-b)為母本、感穗頸痕的南粳38 ipi-tapi-taPi-bPi-b)為父本配製雜交配組；
2)種植FpF2、F3,成熟後全部單株混收；
3)F4代開始進行稻瘟病抗病基因Pi-te、Pi-b的分子標記輔助選擇，苗期各單株DNA 的提取採用SDS法
(1)利用2對等位基因特異PCR引物分子檢測稻瘟病抗性基因的存在
用Pita引物對
Pita-F AGCAGGTTATAAGCTAGGCC ；Pita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有1042 bp特徵條帶說明該單株含有基因；
用Npita引物對
Npita-F AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT ；Npita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有1042 bp特徵條帶說明該單株不含有朽-h基因；
在F4代中選擇用Pita引物對擴增出1042bp的特徵條帶，同時Npita引物對不能擴增出1042bp目的條帶的單株即為基因純合的單株；
(2)利用2對等位基因特異PCR引物稻分子檢測瘟病抗性基因的的存在
用Pib引物對
Pib-F GAACAATGCCCAAACTTGAGA ；Pib-R GGGTCCACATGTCAGTGAGC 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有365 bp特徵條帶說明該單株含有基因；
用Npib引物對
Npib-F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT ； Npib-R GGGAAGCGGATCCTAGGTCT 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有803 bp特徵條帶說明該單株不含有基因；
在F4代中選擇用Pib引物對擴增出365bp的特徵條帶、同時用Npib引物對不能擴增出803bp目的條帶的單株即為基因純合的單株；
4)在F4代中選擇同時含有基因純合和基因純合的單株，即為獲得的抗江蘇省粳稻穗頸瘟的水稻品種。或者將F4代中同時含有朽-te基因純合和基因的純合的單株分別種成F5小區，F5小區在水稻孕穗初期，進行穗頸瘟接種鑑定，於水稻成熟後按調查標準調查結果，穗頸瘟鑑定標準如下，0級無病，免疫；I級1 /4以下枝梗發病或穗頸有斑點，抗病；2級 I /4以上枝梗發病或主軸中部發病，或頸部有病，但對產量影響不大，中抗；3級主軸中部或頸部發病，對產量有顯著影響，感病；4級穗頸發病造成白穗，高感；選擇對穗頸瘟表現為穗頸瘟抗性為0-1級)的F5小區即為即為獲得的抗江蘇省粳稻穗頸瘟的水稻品種。5)將F4代中同時含有朽-te基因純合和基因的純合的單株分別種成F5小區，F5小區內選擇株高9(Tl00cm、每株8 10穗、每穗140 150粒的單株加代穩定，於F6代獲得農藝性狀穩定一致、抗穗頸瘟的水稻品系。其中水稻品系南京14128，該品系株高98 102cm，每株8 10穗，平均穗長17 18cm， 直立穗型，每穗總粒數140 150粒，結實率94% 98%，千粒重26 27g。有益效果
本發明提供的一種培育抗江蘇省粳稻穗頸瘟水稻新品種的育種方法，具有以下優點 本發明方法中涉及輔助選擇的基因標記均為PCR標記，操作簡單，成本低，不僅可以在育種世代中快速準確地鑑定出含有Pi-b純合體的水稻植株，同時由於是對基因本身的選擇，因此可以減去田間鑑定的過程，簡化育種程序，降低了育種成本，極大的提高了選擇效率，縮短育種年限。四
圖I淮稻10/南粳38F4群體不同單株種抗病基因的分子檢測 (M DL2000 ；1 :淮稻10 ；2 :南粳38 ;3_24 =F4群體的部分單株)
圖2淮稻10/南粳38F4群體不同單株種抗病基因7^/4的分子檢測 (M DL2000 ；1 :淮稻10 ；2 :南粳38 ;3_24 =F4群體的部分單株)
圖3抗穗頸瘟高產新品種「南京14128」選育系譜圖五具體實施例方式
選擇親本淮稻10號(原名淮9836)，江蘇省高產粳稻品種，江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所育成，2007年江蘇省審定並定名。Pi-ta位點上基因型為Pi-taPi-ta, Pi~b位點上基因型為Pi-如i-匕該品種全生育期155天，株高96 100釐米，每株有效穗If 12個，每穗實粒數KKTllO粒，結實率90 92%，千粒重25 26克。南粳38 (原名南京72031)，江蘇省高產粳稻品種，江蘇省農業科學院糧食作物研究所育成，2001年江蘇省審定並定名oPi-b位點上基因型為位點上基因型為pi-tapi-ta,該品種葉色清秀，後期轉色好，熟相好。株高90、5，每株有效穗If 12個， 每穗實粒數120 125粒，結實率90 95%，千粒重26 27克。以上兩個品種均為公知公用材料，江蘇省農業種質資源中期庫可免費提供。具體參考文獻為(袁生堂等，淮稻10號(淮9836)的選育及應用，中國稻米，2007，5，34-35 ;仲維功等，中粳稻新品種南粳38的選育與應用，江蘇農業科學，2001，5，35-37)。品種選育2005年選用Pi-ta位點上基因型為中感穗頸瘟的江蘇高產粳稻品種淮稻10號為母本早與位點上基因型為的高產優質感穗頸瘟粳稻品種南粳38，為父本色雜交配組，2006年在南京種植F1, 2007年種植混收F2代種子，2008 年種植F3,成熟後混收種子。2009年在南京種植F4,根據分子標記輔助育種的結果選擇目的單株，種植F5小區，根據分子標記輔助育種的結果以及農藝性狀的表現在個別小區內繼續選擇單株。中選單株2010年種成小區(F6),篩選出表現穩定一致、高抗穗頸瘟、綜合豐產性好的粳稻新品系南京14128。分子標記輔助選擇 F4代開始進行稻瘟病抗性基因的分子標記輔助選擇，苗期各單株DNA的提取採用SDS法(參照Dellaporta S L, et al. , Plant MolBiol Rep, 1983，I (I): 19-21)，略有改動。具體步驟為取水稻苗期葉片，在_20°C預冷的研缽中用液氮研磨並裝入I. 5 ml離心管；加入600 ul提取液(20% SDS, IM Tris-HCl,
0.5M EDTA, 5M NaCl，65°C預熱)，搖勻，65°C溫浴30 min，中間振蕩:次；加入1/4體積5M KAC,搖勻後置冰上30 min ;加入氯仿-異戊醇(24:1) 300 400 ul，在搖床上充分振蕩， 120 rpm, 30 min ；8000^10000 rpm離心15分鐘,液面分層，下層顏色較深,上層微帶黃綠色，取上清(400 ul左右)至另一離心管；加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)，搖床上充分振蕩,80 90 rpm, 30 min ；8000 rpm離心15分鐘,轉移上清(400 ul左右)至新的離心管；力口 A 2倍體積_20°C預冷的無水乙醇，輕輕搖勻直到有絮狀物產生，12000 rpm離心6 min ;棄無水乙醇，加入4°C 70%乙醇，放置10 min，棄上清，超淨工作檯上風乾I h ;加入100 200 ulTE，-20°C保存。稻瘟病抗性基因的分子檢測，利用2對等位基因特異PCR引物
Pita-F AGCAGGTTATAAGCTAGGCC
Pita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA Npita-F AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT Npita-R ； CTACCAACAAGTTCATCAAA
擴增水稻品種的基因組DNA，20 ii L的反應體系包括模板DNA (約15ng/y L) 2 y L， 引物(4pmol/ii L) L，IOX 緩衝液(25 mmol/ L) 2 u L, MgC12 (25 mmol/ L) I. 2 u L, dNTP (2.5 mmol/ L) 0. 4u L, Taq 酶(5 U/u L )0. 2u L，滅菌雙蒸水 12. 2 y L。在 Eppendorf PCR儀上進行擴增，反應條件為(I )94°C預變性5分鐘；(2)94°C，I分鐘；58°C, I分鐘；72°C，I. 5分鐘；共35個循環.(3) 72°C再延伸10分鐘。反應產物在在I %的瓊脂糖上進行分離電泳，溴化乙錠染色，然後在紫外凝膠成像儀上觀察並照相，選擇Pita擴增出1042bp的特徵條帶，同時Npita不能擴增出1042bp目的條帶的基因純合的單株。稻瘟病抗性基因的Pi-b分子檢測，利用2對等位基因特異PCR引物
Pib-F GAACAATGCCCAAACTTGAGA
Pib-R GGGTCCACATGTCAGTGAGC Npib-F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT Npib-R ；GGGAAGCGGATCCTAGGTCT
擴增水稻品種的基因組DNA，20 ii L的反應體系包括模板DNA (約15ng/y L) 2 y L， 引物(4pmol/ii L) L，IOX 緩衝液(25 mmol/ L) 2 u L, MgC12 (25 mmol/ L) I. 2 u L, dNTP (2.5 mmol/ L) 0. 4u L, Taq 酶(5 U/u L )0. 2u L，滅菌雙蒸水 12. 2 y L。在 Eppendorf PCR儀上進行擴增，反應條件為(I )94°C預變性5分鐘；(2)94°C，I分鐘；58°C, I分鐘；72°C，I. 5分鐘；共35個循環.(3) 72°C再延伸10分鐘。反應產物在在I %的瓊脂糖上進行分離電泳，溴化乙錠染色，然後在紫外凝膠成像儀上觀察並照相，選擇Pib擴增出365bp的特徵條帶，同時Npib不能擴增出803bp目的條帶的基因純合的單株。將F4代中同時含有朽-te基因純合和基因純合的單株分別種成F5小區，在水稻孕穗初期，參照羅楚平等(羅楚平等，水稻稻瘟病接種技術及2009年江蘇省區試品種抗性鑑定，江蘇省農業科學，2009，6: 178-179)進行穗頸瘟接種鑑定。於水稻成熟後按調查標準調查結果。穗頸瘟鑑定標準如下，0級無病，免疫；I級1/4以下枝梗發病或穗頸有斑點，抗病；2級1 /4以上枝梗發病或主軸中部發病，或頸部有病，但對產量影響不大，中抗；3級主軸中部或頸部發病，對產量有顯著影響，感病；4級穗頸發病造成白穗，高感。選擇對穗頸瘟表現為抗病(穗頸瘟抗性為0-1級)，同時含有朽-te ,Pi-b基因純合體的F5小區。在上述F5小區內選擇株高9(Tl00cm、每株8 10穗、每穗140 150粒的單株加代穩定，於F6R獲得一批農藝性狀穩定一致、抗穗頸瘟的水稻品系。其中水稻品系南京14128， 該品系株高98 102cm，每株8 10穗，平均穗長17 18cm，直立穗型，每穗總粒數140 150粒， 結實率94% 98%，千粒重26 27g。
權利要求
1.一種培育抗江蘇省粳稻穗頸瘟水稻新品種的育種方法，其特徵在於1)選用中感穗頸瘟、基因型為/如 的江蘇高產水稻品種淮稻10作母本，與感穗頸瘟、基因型為的南粳38作父本配製雜交配組；2)種植FpF2、F3,成熟後全部單株混收；3)F4代開始進行稻瘟病抗病基因Pi-b的分子標記輔助選擇，苗期各單株DNA 的提取採用SDS法(1)利用2對等位基因特異PCR引物分子檢測稻瘟病抗性基因Pi-ia的存在用Pita引物對Pita-F AGCAGGTTATAAGCTAGGCC ；Pita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有1042 bp特徵條帶說明該單株含有A'-ia基因；用Npita引物對Npita-F AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT ；Npita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有1042 bp特徵條帶說明該單株不含有/基因；在F4代中選擇用Pita引物對擴增出1042bp的特徵條帶，同時Npita引物對不能擴增出1042bp目的條帶的單株即為Pi-ia基因純合的單株；(2)利用2對等位基因特異PCR引物稻分子檢測瘟病抗性基因的的存在用Pib引物對Pib-F GAACAATGCCCAAACTTGAGA ；Pib-R GGGTCCACATGTCAGTGAGC 擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有365 bp特徵條帶說明該單株含有基因；用Npib引物對Npib-F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT Npib-R GGGAAGCGGATCCTAGGTCT擴增水稻單株的基因組DNA並經溴化乙錠染色後觀察，如果具有803 bp特徵條帶說明該單株不含有基因；在F4代中選擇用Pib引物對擴增出365bp的特徵條帶、同時用Npib引物對不能擴增出803bp目的條帶的單株即為Pi-ia基因純合的單株；4)在F4代中選擇同時含有基因純合和基因純合的單株，即為獲得的抗江蘇省粳稻穗頸瘟的水稻品種。
2.根據權利要求I所述的育種方法，其特徵在於在F4代中選擇同時含有基因純合和基因純合的單株分別種成F5小區，F5 小區中在水稻孕穗初期，進行穗頸瘟接種鑑定，於水稻成熟後按調查標準調查結果，穗頸瘟鑑定標準如下，O級無病，免疫；I級1 /4以下枝梗發病或穗頸有斑點，抗病；2級1 /4 以上枝梗發病或主軸中部發病，或頸部有病，但對產量影響不大，中抗；3級主軸中部或頸部發病，對產量有顯著影響，感病；4級穗頸發病造成白穗,高感；選擇對穗頸瘟表現為穗頸瘟抗性為0-1級)的F5小區即為即為獲得的抗江蘇省粳稻穗頸瘟的水稻品種。
3.根據權利要求I或2所述的育種方法，其特徵在於在F4代中選擇同時含有基因純合和基因純合的單株分別種成F5小區，F5 小區內選擇株高9(Tl00cm、每株8 10穗、每穗14(Tl50粒的單株加代穩定，於F6代獲得農藝性狀穩定一致、抗穗頸瘟的水稻品系。
4.根據權利要求3所述的育種方法，其特徵在於所述水稻品系南京14128，該品系株高98 102cm，每株8 10穗，平均穗長17 18cm，直立穗型，每穗總粒數140 150粒，結實率94% 98%，千粒重26 27g。
全文摘要
本發明涉及一種培育抗江蘇省粳稻穗頸瘟水稻新品種的育種方法，屬水稻遺傳改良與生物技術應用領域。選用中感穗頸瘟品種淮稻10(含有Pi-ta基因)與感穗頸瘟品種南粳38(含有Pi-b基因)配製雜交配組；F1、F2、F3代單株混收，F4代開始進行稻瘟病抗病基因Pi-ta和Pi-b分子標記輔助選擇，聚合2個抗性基因獲得基因型為Pi-taPi-taPi-bPi-b的雙基因純合體；後續世代經產量與農藝性狀選擇，至F6代選育出農藝性狀穩定一致、抗江蘇粳稻穗頸瘟的高產水稻新品系。本發明不僅能夠快速選育出抗江蘇省粳稻穗頸瘟的水稻新品種，而且不需要大量的接種鑑定，節約了育種成本。
文檔編號A01H1/02GK102577925SQ201210035778
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者仲維功, 朱金燕, 楊傑, 王軍, 範方軍 申請人:江蘇省農業科學院