一種等溫反應檢測具序列特異性的dna和rna的方法

2023-06-03 04:20:36 1

專利名稱：：一種等溫反應檢測具序列特異性的dna和rna的方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學領域，更具體的說，是一種檢測具序列特異性的DNA和RNA的方法。再具體的說，其涉及應用限制性內刻酶及寡核苷酸的片斷檢測具序列特異性的DNA和RNA的方法。
背景技術：
：具序列特異性的DNA和RNA的檢測是基因診斷的基礎。基因診斷，是20世紀70年代末迅速發展起來的一項利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術，從DNA/RNA水平檢測、分析基因的存在和結構、變異和表達狀態，從而對疾病做出診斷的方法。傳統的基因診斷概念也早已發展到全面的RNA診斷和DNA診斷，統稱分子診斷。基因診斷的問世給整個診斷學帶來了一次革命，使人們對疾病的認識從傳統的臨床診斷、生化學診斷、血清學診斷的表型診斷步入基因診斷的新階段，應用分子生物學技術進行常見疾病的診斷已成為許多國家醫療機構的常規項目，也是衡量一個城市和地區整體醫療水平的重要指標。由於多數現有的基因診斷技術較複雜，需要專門儀器，非普通使用者能夠使用。因此，基因診斷的廣泛應用需要開發更加價廉且方便使用的產品。目前多數基因診斷技術是通過對目標序列的擴增來實現其靈敏性的。大多數DNA合成是通過使用DNA聚合酶的酶學方法完成的。核酸擴增根據是否需要溫度循環主要分為兩類一類是非等溫擴增，如聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)等；另一類是等溫擴增，如鏈替代擴增(SDA)、核酸依賴的擴增(NASBA)等。引物引導下的核酸擴增技術是使用最多的方法。此類擴增技術多使用DNA聚合酶的酶學方法完成。其中，最廣泛應用的酶學方法是聚合酶鏈反應(PCR)。PCR以線性DNA為模版進行複製反應。該反應需要DNA模版(templates)，位於模版兩端的引物(primers)，脫氧核糖核酸(dNTP)，耐熱DNA聚合酶(thermalstableDNApolymerase)及適宜的反應條件(離子濃度和酸度)。PCR反應通常在溫度循環器(thermolcycler)中進行，為PCR反應提供所需的高溫，低溫和中溫階段。每次三個階段構成一個循環。PCR反應每經過一個循環，目標基因的數目就擴增一倍。這樣，在經過N次循環後，一個目標基因分子就可能被擴增到2N個。PCR的優點就是可以檢測微量的核酸。核酸擴增技術的特點如下表除了以PCR為代表的序列特異性擴增技術以外，基因診斷也常採用下面幾種非擴增的特異性序列識別技術基因限制酶酶譜分析當待測DNA序列中發生突變時會導致某些限制性內切酶位點的改變，可以利用限制性內切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異。其特異的限制性酶切片段的狀態在電泳遷移率上也會隨之改變，藉此可做出分析診斷。限制性片段長度多態性分析(RFLPs)在人類基因組中，不少DNA多態性發生在限制性內切酶識別位點上，酶解該DNA片段就會產生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態性(RFLP)。RFLP按孟德爾方式遺傳，在某一特定家族中，如果某一致病基因與特異的多態性片段緊密連鎖，就可用這一多態性片段為一種「遺傳標誌」，來判斷家庭成員或胎兒是否為致病基因的攜帶者。但RFLP是對一特定酶切後DNA長度的分析，無法確定序列。同時，RFLP僅可用於對DNA進行分析，而不適於對RNA的分析。等位基因特異寡核苷酸探針雜交法這種方法可以用來檢測樣本中是否存在與探針序列互補的同源核酸序列。遺傳疾病的遺傳基礎是基因序列中發生一種或多種突變。根據已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成兩種寡核苷酸探針一是相應於突變基因鹼基序列的寡核苷酸；二是相應於正常基因鹼基序的寡核苷酸，用它們分別與受檢者DNA進行分子雜交。從而檢測受檢者基因是否發生突變，以及是否有新的突變類型。該方法的優點是適用於DNA和RNA，也可反映目標序列的量。但由於無擴增機制，因而靈敏性較低。螢光原位雜交技術(FISH)這是一個強有力的基因評估工具，能對內層、外層細胞基因中的特定染色體畸變進行顯微識別及定位。首先將細胞膜溶破，將細胞核固定在玻璃片上，再用探針進行FISH反應，然後配合螢光顯微鏡照相儀進行分析做出最後診斷。在臨床主要用於檢測染色體套數異常、染色體構造異常、受精卵內粒腺體之分布、核差別染色體評估胚胎的等級以及受精失敗後，卵中精蟲染色體形態的觀察，還可用來進行膀胱肌瘤、乳房腫瘤、腦瘤的前期診斷。FISH是一個相當複雜的技術，因而較難普及推廣應用。
發明內容針對PCR等技術的反應條件要求苛刻的缺點，本發明的目的是提供一種在等溫條件下檢測具序列特異性的DNA和RNA的方法，它在無需價格昂貴的溫度循環器及許多其它昂貴試劑的情況下，在等溫條件下快速檢測具序列特異性的DNA和RNA。本發明所建立的在等溫條件下的檢測基因的方法，命名為RIDA(RapidIsothermalDetectionandAmplification)。在生物體內有一類酶，它們能將外來的DNA切斷，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名內切酶(簡稱內切酶)。內切酶是基因工程中所用的重要切割工具。科學家已從原核生物中分離出了許多種內切酶，並且已經商品化，在基因工程中廣泛使用。根據內切酶切割的特點，可將它們分為兩大類一類是切割部位無特異性的；另一類是可特異性地識別核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上進行切割(限制性內切酶)。這種能被特異性識別的切割部位都具有迴文序列，也就是在切割部位，一條鏈正向讀的鹼基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。在基因工程中使用的多數是後一類酶。限制酶在特定切割部位進行切割時，按照切割的方式，又可以分為錯位切和平切兩種。錯位切一般是在兩條鏈的不同部位切割，中間相隔幾個核苷酸，切下後的兩端形成一種回文式的單鏈末端，這個末端能與具有互補鹼基的目標基因的DNA片段連結，故稱為黏性末端。這種酶在基因工程中應用最多。另一種是在兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個無黏性末端的平口。近幾年來發現，生物體內存在著切刻內切酶(nickingenzyme)。該種核酸酶識別DNA雙鏈或DNA-RNA雜合雙鏈上的特異性識別位點，但僅「切刻」一條單鏈。以切刻內切酶N.BstNBI為例。該酶的識別位點為3』…CTCAGNNNNN…5』在GAGTC3』後4個基切刻形成單鏈DNA的3』端。本發明通過在特異探針中設計限制性切刻酶的識別位點，在DNA探針與目標序列雜交後，DNA內刻酶將探針切刻為兩段，從而降低了其與目標序列結合的穩定性並與目標序列分離。目標序列因此能與另一完整探針再次雜交並被切刻酶切刻。如此循環。切刻下的小片段可應用凝膠電泳的方法，或螢光識別儀，或顏色變化，或傳感器器(DNA/RNAsensor)，或質譜(LC-MS)，或檢驗層析試條(lateralflow)，或微陣列系統(microarray)來檢測特定產物的存在。用RIDA方法檢測目標序列，其關鍵的之處在於限制性內切酶的應用。該方法可以在等溫情況下使待檢基因呈線性或指數增加，使反應在短時間內就能完成，因而具有快速、靈敏、特異、應用範圍廣等特點。可應用於包括動物、植物和微生物的基因檢測。本發明所提供的檢測具序列特異性的DNA和RNA的方法，包括以下兩種技術方案第一種技術方案的特點如下設計單鏈DNA「報告探針」，所說的「報告探針」與目標基因序列的核酸切刻內切酶識別序列及及其周圍序列部分互補，並可使切刻內切酶在報告探針切刻；按以下步驟進行目標基因檢測1.1、在待檢測樣品的DNA或RNA中加入「報告探針」及切刻內切酶，「報告探針」與含有切刻內切酶識別序列的目標基因序列雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點，該位點僅可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段，在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與目標基因脫離，成為5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；1.2、與被切刻的「報告探針」分離的目標基因，又與另一完整的「報告探針」雜交，重複1.1所述反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；1.3、通過檢測產生的3』部分「報告探針」和/或5』部分「報告探針」顯示是否有目標基因序列存在。第二種技術方案的特點如下設計以下探針，包括單鏈DNA「捕獲探針」，所說的「捕獲探針」不僅對待檢測的目標基因序列有鹼基互補特異性，而且與介質(生物素，微珠，玻片，濾紙，等等)連接；單鏈DNA「核驗探針」，所說的「核驗探針」一部分對待檢測的目標基因的另一段序列(有別於「捕獲探針」互補序列)有鹼基互補特異性，另一部分包含核酸切刻內切酶識別序列及兩邊的非特異性序列；單鏈DNA「報告探針」，所說的「報告探針」與「核驗探針」的核酸切刻內切酶識別序列及其周圍序列部分互補，並可使切刻內切酶在報告探針切刻；如圖2所示，按以下步驟進行目標基因檢測2.1、將固定於介質上的「捕獲探針」與待檢測樣品的DNA或RNA混合，使「捕獲探針」與目標基因雜交，未被「捕獲探針」捕獲的DNA或RNA經洗滌等方式與被捕獲的序列分離；2.2、加入「核驗探針」，如果被捕獲得到的是目標基因，「核驗探針」的一部分將與目標基因的另一部分序列雜交，形成「捕獲探針-目標基因-核驗探針複合體」，未與目標基因雜交的核驗探針通過洗滌與「捕獲探針-目標基因-核驗探針複合體」分離；2.3、加入「報告探針」和切刻內切酶，「報告探針」與「核驗探針」雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點，該位點僅可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段，在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與「核驗探針」脫落，成為5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；2.4、與被切刻的「報告探針」分離的「核驗探針」又與另一完整的「報告探針」雜交，重複2.3所述反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；2.5、通過檢測產生的3』部分「報告探針」和/或5』部分「報告探針」顯示是否有目標基因序列存在。在本發明技術方案中，還可通過再設計及應用一種單鏈DNA「複製探針」來進一步提高檢測的靈敏度，所說的「複製探針」的5』端與3』端包含與3』部分「報告探針」序列互補，且中間包含切刻內切酶識別序列和間隔序列；「複製探針」的應用方法是對於第一種技術方案，在步驟1.1同時加入所說的「複製探針」和DNA複製酶，以3』部分「報告探針」為引物，以「複製探針」為模版，在DNA聚合酶的催化下，合成雙鏈DNA，該雙鏈DNA包含有切刻內切酶識別位點並由切刻內切酶切刻產生更多的3』部分「報告探針」，從而提高靈敏度。對於第二種技術方案，在步驟2.3同時加入所說的「複製探針」和DNA聚合酶，以3』部分「報告探針」為引物，以「複製探針」為模版，在DNA聚合酶的催化下，合成雙鏈DNA，該雙鏈DNA包含有切刻內切酶識別位點並由切刻內切酶切刻產生更多的3』部分「報告探針」，從而提高靈敏度。可以通過設計具有螢光或生物素標記的「報告探針」，來達到快速檢測的目的。例如，「報告探針」的一端用螢光染料標記，另一端由螢光淬滅染料標記。由於在完整的「報告探針」中螢光標記與淬滅染料相距較近，螢光被淬滅染料淬滅，故無螢光發出。「報告探針」探針與互補序列結合後，「報告探針」被切刻酶切為兩段並從目標基因上分離，螢光染料和淬滅染料也因此分離。螢光染料發出螢光。螢光及其強弱可由螢光檢測器檢測。在本發明所述的各種技術方案中可以通過螢光識別儀、質譜、凝膠電泳、分子夾、序列分析、DNA/RNA傳感器、檢驗層析試條、微陣列系統或變色反應等方式檢測產生的3』部分「報告探針」和/或5』部分「報告探針」。本發明所述的方法，除了作為檢測具序列特異性的DNA和RNA的應用外，還可作為篩選具有新的切刻識別位點或切刻活性的切刻內切酶的應用。本發明提供了一個新型的等溫特異性序列檢測和信號放大的方法。其具有以下特點第一，擴增的目標序列即可以是DNA也可以是RNA，同時還可在微陣列等介質上完成反應。第二，反應過程十分簡單，比起RCA等其它等溫擴增過程來說，反應過程中不需要反覆的更換反應體系，只需將特定探針、切刻內切酶加入到含有目標序列的反應體系中溫育一段時間即可。第三，反應過程快速、特異，只需5-30分鐘。第四，反應檢測手段多樣化，即可通過電泳來檢測特異性條帶，也可通過螢光探針來實時檢測反應的進程。圖1為本發明第一種技術方案的檢測反應步驟流程示意圖；圖2為本發明第二種技術方案的檢測反應步驟流程示意圖；圖3為本發明使用「複製探針」的檢測反應步驟流程示意圖；圖4為本發明第一種技術方案中使用具有螢光標記的「報告探針」的檢測反應步驟流程示意圖；圖5為本發明第一種技術方案運用螢光標記「報告探針」並針對DNA的檢測結果；圖6為本發明第一種技術方案運用螢光標記「報告探針」並針對RNA的檢測結果；圖7為本發明第二種技術方案；運用「捕獲探針」，「核驗探針」及「報告探針」檢測人巨細胞病毒(HCMV)DNA的結果；圖8為運用「複製探針」對3』部分「報告探針」擴增並運用聚凝脂膠對擴增產物檢測結果；圖9為運用「複製探針」對3』部分「報告探針」擴增並運用質譜對擴增產物檢測結果。以下為對上述各圖的說明在圖1-4中，1表示目標單鏈DNA或RNA序列；2表示捕獲探針；3表示介質；4表示核驗探針；5表示報告探針；6表示複製探針；7表示切刻酶識別序列；8表示切刻內切酶識別位點；9表示5』部分報告探針；10表示3』部分報告探針；11表示螢光染料標記；12表示螢光淬滅染料標記。對圖1的A-D的圖示過程說明如下A-B含有切刻酶識別序列7的「報告探針」5與含有切刻內切酶識別序列的目標基因序列1雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點8；C該切刻內切酶識別位點8可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段；D在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與目標基因1脫離，成為5』部分「報告探針」9和3』部分「報告探針」10；目標基因1又與另一完整的「報告探針」雜交，重複A-C的反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」。對圖2的A-E的圖示過程說明如下A-C固定在介質3上的「捕獲探針」2與目標基因1雜交，「核驗探針」4的一部分與目標基因1的另一部分序列雜交，形成「捕獲探針-目標基因-核驗探針複合體」；D-E「報告探針」5與「核驗探針」4雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點8，該位點僅可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段，在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與「核驗探針」4脫離，成為5』部分「報告探針」9和3』部分「報告探針」10；與被切刻的「報告探針」分離的「核驗探針」4，又與另一完整的「報告探針」雜交，重複C-E所述反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」.對圖3的A-D的圖示過程說明如下A-B以圖1的D步驟及圖2的E步驟中產生的3』部分「報告探針」10為引物，以「複製探針」6為模版，在DNA聚合酶的催化下，合成雙鏈DNA；C該雙鏈DNA包含有切刻內切酶識別位點8並由切刻內切酶切刻產生更多的3』部分「報告探針」；D在此反應溫度下，新產生的3』部分「報告探針」將從「複製探針」6脫離並成為引物重複A-C的反應。對圖4的A-D的圖示過程說明如下A-B含有切刻酶識別序列7的「報告探針」5與含有切刻內切酶識別序列的目標基因序列1雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點8，其「報告探針」5的5』一端有螢光染料標記11，3』一端有螢光淬滅染料標記12；C該切刻內切酶識別位點8可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段；D在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與目標基因1脫離，成為有螢光染料標記11的5』部分「報告探針」和有螢光淬滅染料標記12的3』部分「報告探針」；目標基因1又與另一完整的「報告探針」雜交，重複A-C的反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」。具體實施例方式以下通過應用RIDA方法檢測HCV病毒對本發明的具體實施細節作進一步的說明。C型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎和肝硬化的主要病原體之一，感染率一般在0.5％～2.0％之間，我國為3.2％。感染者的肝病程度和治療效果存在較大差異。究其原因，由於HCV複製時所依賴的多聚酶缺乏校對功能，加上其本身為適應環境和逃避宿主的免疫監視作用而易發生突變，所以HCV的基因型的改變是導致這些差異的主要因素之一。HCV為單股正鏈RNA病毒，其全基因序列已基本被闡明，全長9416bp，由編碼區(9030bp)，5』-非編碼區(332bp)和3』-非編碼區(54bp)組成。結構基因分為C區、M區和E區，分別編碼核心(core)蛋白、內膜(menbrane)蛋白和囊膜(envelope)蛋白。非結構蛋白分別為NS1、NS2、NS3、NS4和NS5，而我們的檢測是針對其NS3的保守序列進行的，因而可以達到檢測的要求。我們先後針對HCV-RNA病毒基因的一段特異區域相對應的cDNA和RNA序列進行檢測。以下為檢測過程的實施例。實施例一本發明第一種技術方案針對DNA的檢測實施例一的目的在於演示RIDA對DNA目標基因檢測的可行性及其靈敏性。本方法檢測過程如圖1及圖3所示。「目標基因序列」(T-1)是和HCV的RNA病毒基因的一段特異區域相對應的DNA序列。根據該目標基因序列，設計一單鏈DNA「報告探針」(0-1)。在T-1的5′計一個N.BstNBI識別序列，並且5』末端用6-FAM(6-羧基-螢光素，報告染料)標記，在3』末端用TAMRA(四甲基-6-羧基羅丹明，淬滅劑染料)標記，在下述反應條件下，0-1和T-1結合，在N.BstNBI酶作用下，0-1被切刻開來，從而發出螢光，通過螢光定量PCR儀(MJRChromo4)實現對反應產物的實時動態檢測.以下為T-1和0-1反應結合的形式5′-GCTCGCTGCATAGCTGTCATCCCTCGGACTCACACGCT-3′目標基因(T-1)|||||||||||||||||||||3′CGACAGTAGGGAGCCTGAGT5′報告探針(O-1)↑N.BstNI切刻位點檢測步驟(1)、在25ul反應體系中分別加入不同摩爾濃度的T-1和2uMO-1，2.5μl10×NEB3號緩衝液(NewEnglandBiolabs)，5個單位N.BstNI酶(NewEnglandBiolabs)(2)、在螢光定量PCR儀(MJResearch，Chromo4)上，55℃反應15分鐘，讀板1次/1分鐘。結果如圖5所示。實施例二本發明第一種技術方案針對RNA的檢測實施例一的目的在於演示RIDA對RNA目標基因檢測的可行性及其特異性。為此，化學合成了4條RNA，其序列如下T-1RNA5′GCUCGCUGCAUAGCUGUCAUCCCUCGGACUCAACGCU3′T-1RNA-A5′GCUCGCUGCAUAGGUGUCAUCCCUCGGACUCAACGCU3′T-1RNA-B5′GCUCGCUGCAUAGCUGUCAUCGCUCGGACUCAACGCU3′T-1RNA-C5′GCUCGCUGCAUAGCUGUGAUCCCUCGGACUCAACGCU3′其中，T-1RNA-A、B、C僅於T-1RNA相差一個鹼基(下橫「_」所示)。T-1RNA與「報告探針」O-1互補，因而可用O-1檢測。檢測步驟(1)20ul反應體系的組成(2)、在螢光定量PCR儀(MJResearch，Chromo4)上，55℃反應20分鐘，讀板1次/1分鐘。結果如圖6。實施例三本發明第二種技術方案；運用「捕獲探針」，「核驗探針」及「報告探針」檢測人巨細胞病毒(HCMV)DNA。所檢測的目標序列選用HCMVUL89基因的編碼序列。其序列如下(Genebank號AF047525)1gttggtgttgtagcaactggcaaaaagcgccgtgctcttggcgccgcggtggtcgatgct61gatcacgttgtccttgttctcgaccacgtagtcgcgcgcgaaggtgtggcggcagcggaa121ctcgacctctttgagcacaaactgcgacacgtgcttttggtgcgccacgtagccgatgct181gatgccgatcatgtgcttaagcagaaacgagataatggggatgatgaaccaagtcttgcc241gtgacgtcgcggcaccaggaacacggtggctttctgcttaaagatgtcgatggaggtctg301cgagaggaagtcgatctggaaggcgtggatgaggtactgcagcacgcgattggccagcac反向捕獲探針目標序列正向捕獲探針目標序列361ggggatcttggtcacggctataaaaaagatgacgtgtatcaataaattcttttgaaacgg421ttcgagtcggatggcttttgcgtcgccctcgacggcggtactgaagccgccgtcgagcca481ctttttaaagtcggtcatgaagttgttgatctgctgaaactgcggatcgcggtagagctc541ggtcaacgcgtccagcttctggtaggaggcgcgctgctcctcggagcacgggcgaaacgt601cagttcatcgagcgcgctcttgaggcgctcgtgaaacagcagctcgcgctggctttcctc反向驗核探661gggcgagttgtagtcgcggtggcggccgcagaaggccatgagcggcaggaaggcctcgtt針目標序列正向驗核探針目標序列721gcacgagtgggccagcccgagttcggggtgcatcatctggtagcgcttgcggcacagcgc781cgccacattggtgaaggccgtggagatgcaggaggtggggtggctcttgcgcttctgcag841ctccgcgtagcgctcctggatcttggcggccgagtctccgcgcaacat為了能提高檢測的靈敏性，設計了針對正向序列和反向序列的捕獲及驗核探針。同時，正向探針也可以同時檢測UL89的RNA。正向捕獲探針5』Biotin-CAGTTTTTTGTGCTGGCCAATCGCGTGCTGCAG3』反向捕獲探針5』Biotin-CAGTTTTTTAAGTCGATCTGGAAGGCGTGGATG3』正向驗核探針5』GCTGTCATCCCTCGGACTCAAAGCATGGCCTTCTGCGGCCGCCACCG3』反向驗核探針5』GCTGTCATCCCTCGGACTCAAAGGCTTTCCTCGGGCGAGTTGTAGT3』如圖3所示，檢測以如下方法進行(1)UL89基因序列的克隆HCMVUL89基因序列由HCMV(Towne)基因組文庫中擴增並克隆於pcDNA3質粒載體中。(2)帶捕獲探針的微珠的處理1.取100μl鏈黴親和素包被的瓊脂糖微珠，加入500μlTE緩衝液，離心去上清，重複2遍2.加入20μl的捕獲探針，在終濃度為1MNacl，10mMTris.cl，1mMEDTA中雜交20分鐘，離心去上清，加入500μlTE緩衝液，離心去上清，重複2遍。3.取包被有捕獲探針的微珠40μl，加入100μl的Church緩衝液(pH7.2的磷酸氫鈉緩衝液，1mMEDTA，1％的小牛血清蛋白，7％的SDS)，在68℃預雜交30分鐘後，離心去上清，加入500μlTE，離心去上清，重複2遍(3)雜交取40μl預雜交的帶有捕獲探針的微珠，用40μlTE懸浮，分在4個離心管中，每管10μl雜交體系在50℃雜交90分鐘後，加入200μlTE，離心去上清，重複6遍，最後樣品懸浮在10μl的去離子水中(4)、RIDA反應體系反應於50℃下完成。實驗結果如圖7，該圖中曲線A代表進行RIDA反應的樣品3曲線B代表進行RIDA反應的樣品2曲線C代表進行RIDA反應的樣品1實施例四運用「複製探針」對3』部分「報告探針」擴增並運用聚凝脂膠及質譜對擴增產物檢測。在實施例三的RIDA反應體系中，加入「複製探針」，2單位BstDNA聚合酶及2.5mMdNTP，在50℃下反應30分鐘。「複製探針」序列5』GCTGTCATCCCGCTGACTCGCTGTCATCCC反應產物以1.5％聚凝脂膠檢測，結果如圖8所示1-4各反應體系中加入DNA聚合酶和切刻內切酶的情況如下1為無DNA聚合酶，無切刻內切酶；2為有DNA聚合酶，無切刻內切酶；3為無DNA聚合酶，有切刻內切酶；4為有DNA聚合酶，有切刻內切酶；5為DNAladder.箭頭所示為3』部分「報告探針」。反應產物用質譜檢測，結果如圖9所示A-D各反應體系中加入DNA聚合酶和切刻內切酶的情況如下A為無DNA聚合酶，無切刻內切酶；B為有DNA聚合酶，無切刻內切酶；C為無DNA聚合酶，有切刻內切酶；D為有DNA聚合酶，有切刻內切酶。箭頭所示為3』部分「報告探針」。權利要求1.一種等溫反應檢測目的基因方法，在恆溫條件下探針與目標基因結合，後通過切刻內切酶作用來檢測目的基因，其特徵在於設計單鏈DNA「報告探針」，所說的「報告探針」與目標基因序列的核酸切刻內切酶識別序列及及其周圍序列部分互補，並可使切刻內切酶在報告探針切刻；按以下步驟進行目的基因檢測1.1、在待檢測樣品的DNA或RNA中加入「報告探針」及切刻內切酶，「報告探針」與含有切刻內切酶識別序列的目標基因序列雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點，該位點僅可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段，在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與「核驗探針」脫落，成為5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；1.2、被切刻的「報告探針」分離的目的基因，又與另一完整的「報告探針」雜交，重複1.1所述反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；1.3、通過檢測產生的3』部分「報告探針」和/或5』部分「報告探針」顯示是否有目的基因序列存在。2.根據權利要求1所述的等溫反應檢測目的基因方法，其特徵在於還設計了單鏈DNA「複製探針」，所說的「複製探針」的5』端與3』端包含與3』部分「報告探針」序列互補，且中間包含切刻內切酶識別序列和間隔序列；在步驟1.1同時加入所說的「複製探針」和DNA複製酶，以3』部分「報告探針」為引物，以「複製探針」為模版，在DNA聚合酶的催化下，合成雙鏈DNA，該雙鏈DNA包含有切刻內切酶識別位點並由切刻內切酶切刻產生3』部分「報告探針」。3.一種等溫反應檢測目的基因方法，在恆溫條件下探針與目標基因結合，後通過切刻內切酶作用來檢測目的基因，其特徵在於設計以下探針，包括單鏈DNA捕獲探針，所說的捕獲探針不僅對待檢測的目的基因序列有鹼基互補特異性，而且與介質連接；單鏈DNA「核驗探針」，所說的「核驗探針」一部分對待檢測的目的基因的另一段序列有鹼基互補特異性，另一部分包含核酸切刻內切酶識別序列及兩邊的非特異性序列；單鏈DNA「報告探針」，所說的「報告探針」與核驗探針的核酸切刻內切酶識別序列及及其周圍序列部分互補，並可使切刻內切酶在報告探針切刻；按以下步驟進行目的基因檢測3.1、將固定於介質上的「捕獲探針」與待檢測樣品的DNA或RNA混合，使「捕獲探針」與目的基因雜交，未被「捕獲探針」捕獲的DNA或RNA經洗滌等方式與被捕獲的序列分離；3.2、加入「核驗探針」，如果被捕獲得到的是目的基因，「核驗探針」的一部分將與目的基因的另一部分序列雜交，形成「捕獲探針-目的基因-核驗探針複合體」，未與目的基因雜交的核驗探針通過洗滌與「捕獲探針-目的基因-核驗探針複合體」分離；3.3、加入「報告探針」和切刻內切酶，「報告探針」與「核驗探針」雜交後兩識別序列結合形成切刻內切酶識別位點，該位點僅可使切刻內切酶在「報告探針」鏈切刻，形成兩段較短的片段，在此反應溫度下，短片段形成的雙鏈不穩定，會與「核驗探針」脫落，成為5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；3.4、與被切刻的「報告探針」分離的目的基因，又與另一完整的「報告探針」雜交，重複1.4所述反應，產生新的5』部分「報告探針」和3』部分「報告探針」；3.5、通過檢測產生的3』部分「報告探針」和/或5』部分「報告探針」顯示是否有目的基因序列存在。4.根據權利要求3所述的等溫反應檢測目的基因方法，其特徵在於還設計了單鏈DNA「複製探針」，所說的「複製探針」的5』端與3』端包含與3』部分「報告探針」序列互補，且中間包含切刻內切酶識別序列和間隔序列；在步驟3.3同時加入所說的「複製探針」和DNA複製酶，以3』部分「報告探針」為引物，以「複製探針」為模版，在DNA聚合酶的催化下，合成雙鏈DNA，該雙鏈DNA包含有切刻內切酶識別位點並由切刻內切酶切刻產生3』部分「報告探針」。5.根據權利要求1至4任一項所述的方法，其特徵在於所設計的「報告探針」具有螢光或生物素標記。6.根據權利要求1至4任一項的所述的方法，其特徵是通過螢光識別儀、質譜、凝膠電泳、分子夾、序列分析、DNA/RNA傳感器、檢驗層析試條、微陣列系統或變色反應方式檢測產生的3』部分「報告探針」和/或5』部分「報告探針」。7.根據權利要求1至4任一項的所述的方法，其特徵是作為篩選具有新的切刻識別位點或切刻活性的切刻內切酶的應用。全文摘要一種等溫反應檢測具序列特異性的DNA和RNA的方法，通過在特異探針中設計DNA切刻內切酶的識別位點，在DNA探針與目標序列雜交後，DNA切刻內切酶將探針切刻為兩段，從而降低了其與目標序列結合的穩定性並與目標序列分離。目標序列因此能與另一完整探針再次雜交並被切刻內切酶切刻。如此循環。切刻下的小片段可應用凝膠電泳的方法、螢光識別儀、顏色變化、傳感器、質譜、檢驗層析試條或微陣列系統來檢測特定產物的存在。該方法可以在等溫情況下使待檢基因呈線性或指數增加，使反應在短時間內就能完成，因而具有快速、靈敏、特異、應用範圍廣等特點。可應用於包括動物、植物和微生物的基因檢測。文檔編號C12Q1/68GK1810989SQ20051003687公開日2006年8月2日申請日期2005年8月31日優先權日2005年8月31日發明者彭濤申請人:中國科學院廣州分院