應用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重螢光pcr檢測試劑及方法

2023-06-03 14:42:46

專利名稱：應用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重螢光pcr檢測試劑及方法
技術領域：
本發明涉及採用多重螢光PCR檢測豬鏈球菌2型致病性的試劑及檢測方法。更具體地說，本發明涉及同時應用針對豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-Released Protein，MRP)和胞外因子(extracellular factor，EF)兩種毒力因子編碼基因設計的螢光PCR引物對和探針進行豬鏈球菌2型致病性檢測的試劑及檢測方法。
背景技術：
豬鏈球菌病(Swine Streptococcosis)是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)侵害豬的上呼吸道、生殖道、消化道等組織而引起的一種疾病。病原包括豬鏈球菌(Streptococcus suis)、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus suis equi subsp.zooepidemicus)、馬鏈球菌馬亞種(Streptococcussuis equi subsp equi)等。
豬鏈球菌2型感染廣泛發生於各養豬發達國家。英國的Field(1954)從暴發敗血症、腦膜炎和多發性關節炎的乳豬中分離出一株α溶血豬鏈球菌，可是卻不能歸屬於當時所認識的19個蘭氏(Lance field)血清群。1956-1963年間，de Moor首次通過生化和血清學方法，對引起豬敗血性感染的新的a溶血性鏈球菌進行了鑑定，認為屬於革蘭氏R、S和T群。Elliot(1968年)按莢膜分類法把此菌命名為莢膜2型豬鏈球菌。之後，英國(Lamont，1980)、澳大利亞(Buddle，1981)、美國(Kochae，1982)、丹麥(Beate-Perch，1983)、日本(Azuma，1983)、加拿大(Toutt，1988)和歐洲和北美(Clifton-Hadley，1988)的許多國家均有豬鏈球菌2型感染豬只發病的報導。1968年丹麥首次報導了人體感染豬鏈球菌導致腦膜炎的病例。目前全球已有200餘例豬鏈球菌感染病例報告。
引起豬鏈球菌病的病原一般為豬鏈球菌2型。豬鏈球菌2型可以引起豬的腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血症、肺炎和突發性死亡，也可引起相關從業人員腦膜炎並致死，是重要的人獸共患病病原，對養豬業造成巨大的經濟損失，對公共衛生尤其是相關從業人員的生命構成威脅，所以引起世界範圍內的高度重視。1990年我國廣東省首次分離到豬鏈球菌2型(黃毓茂等，1991)。據報導，豬鏈球菌2型在健康豬扁桃體中的帶菌率高達76％(143/188)(Davies，1991)。因此，該病給養豬業所帶來的危害越來越嚴重。
根據莢膜多糖的不同，可將豬鏈球菌分為35個血清型，其中以2型流行最廣、致病性最強，可引起嚴重的人—豬鏈球菌感染。但豬鏈球菌2型不一定都具有致病性，據我國江蘇獸醫研究所調查表明，正常豬群中豬鏈球菌2型的帶菌率很高，平均為42.6％[4]。而澳大利亞和紐西蘭的研究表明75％的健康豬攜帶有豬鏈球菌2型菌，3％的健康豬血液培養陽性，但不發病。Davies(1991)報導健康豬的扁桃體帶菌率可高達76％(143/188))。故在疫情發生時，只確定病原是豬鏈球菌2型還遠不夠，還必須弄清其致病力，以利於有針對性地採取應對措施，防止疫情的蔓延。
鑑定豬鏈球菌2型毒力因子的經典方法需通過蛋白電泳及免疫轉印等手段，方法較為繁瑣，而且要求提供的參考血清難以獲得。因此建立敏感度高、特異性強、重複性好、簡易、經濟的檢測方法是發展的方向。分析蛋白圖譜時發現，從病豬體內分離的菌株有MRP(溶菌酶釋放蛋白)、EF(細胞外因子)等毒力因子，可以作為致病力的重要檢測指標。
在分子生物學研究方面，Vecht(1991)研究認為，根據菌株MRP和EF基因的有無，可將豬鏈球菌2型分為高毒力株(MRP+EF+)、低毒力株(MRP+EF-)和無毒株(MRP-EF-)，引起嚴重人-豬感染的鏈球菌2型均為高致病性的MRP+EF+基因型。Vecht(1992)又用試驗探討了豬鏈球菌2型與表型間的關係。MRP+EF+菌株引起無菌豬發熱，血液中多形核白細胞增高，特異臨床症狀為神經紊亂和跛行，組織學病變表現為腦膜炎、多發性漿膜炎及關節炎，MRP+EF-表型只引起非典型臨床症狀，食慾缺乏和發熱。MRP-EF-則無症狀出現。
在國內，歐瑜、陸承平通過免疫印跡試驗證實豬鏈球菌2型江蘇分離株HA9801存在MRP和EF因子，並檢測出豬鏈球菌2型有4種表型，其中表型MRP+EF+為強致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株，未發現MRP-EF+表型。
在豬鏈球菌2型毒力因子的PCR檢測方面，國內外組裝了多套PCR體系。何孔旺等(2002)根據豬鏈球菌2型毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)與細胞外蛋白因子(EF)基因(mrp與epf)序列，分別設計、合成一對引物，建立聚合酶鏈反應(PCR)方法。該方法擴增出2型菌株的mrp大小為885bp，epf為626bp，PCR檢測的敏感度可達100個細菌。用建立的PCR對從病豬體內分離的菌株進行檢測，檢測的15株2型分離株中有13株mrp與epf均為陽性，為典型的高毒力表現型菌株(mrp+epf+)，1株為mrp+epf-，1株為mrp-epf-。劉軍等(2005)以豬鏈球菌2型和9型的莢膜多糖抗原編碼基因簇中的cps 2J和cps 9H基因、豬鏈球菌2型的主要毒力因子編碼基因epf和mrp為靶基因設計了四對引物，建立了檢測豬鏈球菌的多重PCR反應體系。用該多重PCR反應體系對10株豬鏈球菌分離株進行了鑑定。結果發現10株豬鏈球菌分離株中有5株是9型菌株，另有5株是2型菌株，2型菌株有2種基因型3株cps2+mrp+epf+型，2株cps2+mrp-epf-型。
螢光PCR(FQ-PCR)技術融合了PCR和DNA探針雜交技術的優點，直接探測PCR過程中螢光信號的變化，使PCR的擴增及其分析過程均在同一封閉系統下完成，只需加樣時打開一次PCR反應管，具有特異性好、假陽性低、靈敏度高(是常規PCR的100倍以上)、操作簡單、交叉汙染和汙染環境的機會少(不需要EB染色)等優點，而且整個反應可在0.5-1小時內完成。多重螢光PCR是在同一個反應體系中加入多個引物對和探針，同時檢測多個目的基因的方法，該方法可以方便的進行一管多檢，從而達到省時省力的目的。在同時檢測多個因子(如豬鏈球菌2型的毒力因子)時，前景廣闊。
本研究同時選取豬鏈球菌2型的兩種毒力因子MRP和EF的編碼基因設計引物及探針，通過對反應的退火溫度和鎂離子濃度進行優化，建立了用於檢測豬鏈球菌2型致病性的多重螢光PCR檢測試劑及方法，

發明內容
本發明目的在於提供用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實時螢光PCR檢測試劑及方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現在分析已報導豬鏈球菌2型兩種毒力因子MRP和EF序列的基礎上，分別設計PCR引物和螢光探針。在常規PCR的基礎上添加了一條標記了兩個螢光染料基團的核苷酸探針，報告螢光染料標記在探針的5』端，淬滅螢光染料標記在探針的3』端，二者構成能量轉移結構。當探針完整時，報告螢光染料所發射的螢光可被淬滅螢光染料吸收，在螢光PCR反應的退火過程中，探針優先結合到DNA模板上，當引物延伸到探針結合位置時，在DNA聚合酶5』端到3』端的外切酶的作用下，探針被水解，從而導致報告螢光基團和淬滅螢光基團距離變遠，報告螢光信號得以釋放出來而被儀器檢測到，從而實現對豬鏈球菌2型兩種毒力因子基因的檢測，並根據「MRP+EF+為強致病株、MRP+EF-為弱致病株、MRP-EF-為非致病株」的標準判定其致病性。
一個方面，本發明提供了一種用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實時螢光PCR檢測試劑，該試劑包括分別特異性地針對毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)編碼基因的引物對及探針，因而可同時針對豬鏈球菌2型的兩種毒力因子MRP和EF進行檢測，其中所述的特異性地針對MRP編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為MRP引物(正向)5』-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACCMRP引物(反向)5』-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGGMRP探針5』-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC該探針的5』端標記有報告螢光染料JOE，3』端標記有淬滅螢光染料Eclipse；其中所述的特異性地針對EF編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為EF引物(正向)5』-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGCEF引物(反向)5』-GAACATCTTGGGCGATTGAACC
EP探針5』-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC該探針的5』端標記有報告螢光染料FAM，3』端標記有淬滅螢光染料TAMRA。
其中所述的MRP引物對及探針與EF引物對及探針可以預先混合在一起，也可以獨立存在於所述檢測試劑中，使用時現用現配。
本發明所述的檢測試劑進一步還可以含有其他PCR擴增用成分，例如，包括但不限於PCR緩衝液、MgCl2和dNTP。
在本發明的一個優選實施方案中，該試劑為表1所列成分的混合液表1.豬鏈球菌2型致病性檢測試劑

另一個方面，本發明提供了一種用於檢測豬鏈球菌2型致病性的多重實時螢光PCR檢測方法，該方法同時選取豬鏈球菌2型兩種毒力因子MRP和EF基因為目的基因，使用本發明所述的特異性地針對MRP和EF基因的引物對和探針實施檢測。
本發明人首先設計分別針對毒力因子MRP和EF基因的引物對和探針，採用軟體分析所設計引物對和探針的特異性，引物對和探針合成後分別進行稀釋並確定反應需要量，通過調整反應體系中的鎂離子濃度和對退火溫度進行優化，以培養菌液或者帶菌組織DNA為檢測樣本，確定螢光PCR檢測培養菌液或者帶菌組織中每個毒力因子最佳反應體系和反應條件，採用倍比稀釋的豬鏈球菌2型培養菌液及帶菌組織DNA作為模板進行敏感性試驗，採用其它的豬體致病菌為對照進行特異性試驗，以確保本方法的實際應用效果。在此基礎上，將MRP和EF的檢測試劑組裝在一起，建立了豬鏈球菌致病性的多重實時螢光PCR檢測方法，並確定其敏感性和特異性。具體試驗過程參見實施例1-5。
本發明所述方法可以直接對培養菌液進行檢測，也可以對組織中攜帶的豬鏈球菌2型實施檢測。在採用培養菌液作為檢測材料時，菌體分離及培養須在P3實驗室、按照CDC(中國疾病預防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養程序進行。即採用扁桃體拭子採取待檢豬的病料，實驗室內，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養24h後，挑取可疑菌落接種於匹克氏增菌液，37℃培養24h後，再接種血清肉湯，37℃搖床培養後，滅活備用。在對帶菌的組織，如豬扁桃體、肌肉等進行檢測時，須首先採用商品化的基因組提取試劑盒提取其基因組DNA作為螢光PCR檢測用模板。
在利用本發明所述方法對待檢樣本實施檢測時，可直接取一定量的本發明所述檢測試劑，按照確立的反應體系和條件進行檢測並判定結果。簡而言之，本發明所述的用於檢測豬鏈球菌2型致病性的多重實時螢光PCR檢測方法包括下述步驟1)使用本發明所述的特異性地針對MRP和EF的引物對及螢光素標記探針，與PCR擴增用的dNTP、PCR緩衝液及聚合酶混合，得到檢測預混液；2)向上述檢測預混液中加入待檢菌液或以待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴增反應體系置於螢光PCR儀上；4)根據探針標記的報告螢光類型，選擇對應的螢光通道，按照本發明確立的反應條件進行螢光PCR擴增，反應結束後讀取並記錄各檢測樣本的PCR擴增循環數(Ct)；5)根據各樣本的反應Ct值，按照豬鏈球菌2型致病性判定標準判定待檢樣本中豬鏈球菌2型的致病性。
在本發明中，所述的豬鏈球菌2型致病性判定標準為(1)反應曲線呈對數增長時，Ct＜30，判定為陽性；30＜Ct＜40，判定為可疑，加大模板量重複擴增，如果得到相同的試驗結果，則判為陽性，否則為陰性；(2)反應曲線為一條直線，則為陰性。對於陽性菌株，以有無MRP和EF基因作為標準來判定其致病性。MRP+EF+為強致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株。
在本發明的一個優選實施方案中，取由表1所列成分組成的試劑10.5μl，加入0.5μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)，加滅菌雙蒸水13.0μl，製備得到預混液，然後加入1μl滅活菌液或者待檢組織基因組DNA作為模板，即檢測體系體積為25μl。將各檢測體系放入實時(Real-time)PCR儀後，選擇FAM和JOE兩個螢光通道，設置如下條件進行反應95℃預變性3min；然後採用二步法進行反應94℃，5s；55℃，10s，45個循環。每個循環結束後採集螢光信號。反應結束後讀取各樣本擴增曲線的Ct值並根據「MRP+EF+為強致病株、MRP+EF-為弱致病株、MRP-EF-為非致病株」的標準判定待檢樣本的致病性。


圖1圖示的是多重螢光PCR技術檢測培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的敏感性試驗結果。其中曲線1-8代表PCR擴增時加入反應體系中的菌落數(CFU，菌落形成單位)分別為5000、1000、500、100、50、20、10、5。
圖2圖示的是多重螢光PCR技術檢測培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子EF基因的敏感性試驗結果。其中曲線1-8代表PCR擴增時加入反應體系中的菌落數(CFU，菌落形成單位)分別為5000、1000、500、100、50、20、10、5。
圖3圖示的是多重螢光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗結果。其中曲線1為陽性對照，曲線8為陰性對照，曲線2-7代表PCR擴增時摻入組織中的菌落數(CFU，菌落形成單位)分別為1×104、5×103、1×103、500、100、50。
圖4圖示的是多重螢光PCR檢測組織中鏈球菌2型毒力因子EF的敏感性試驗結果。其中，曲線-----為陽性對照；-●-●-●-代表PCR擴增時摻入組織中的菌落數(CFU)為1×104、-◆-◆-◆-代表菌落數為5×103、-▲-▲-▲-代表菌落數為1×103、-●-●-●-代表菌落數為5×102、----代表菌落數為100、-■-■-■-代表菌落數為50、-◆-◆-◆-為陰性對照。
圖5圖示的是多重螢光PCR檢測培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的特異性試驗結果。
圖6圖示的是多重螢光PCR技術檢測培養菌液中鏈球菌2型毒力因子EF的特異性試驗結果。
圖7圖示的是多重螢光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的特異性試驗結果。
圖8圖示的是多重螢光PCR檢測組織中鏈球菌2型毒力因子EF的特異性試驗結果。
圖9圖示的是用本發明所述多重螢光PCR檢測方法對所採集扁桃體樣本進行豬鏈球菌2型致病性檢測的結果，其中圖9A為MRP擴增結果，圖9B為EF擴增結果。
本發明的優點1.本發明的試劑及檢測方法充分利用了PCR技術的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和螢光檢測技術的快速敏感性，反應結束即時便可根據擴增曲線判定是否含有MRP和EF兩個基因，並根據「MRP+EF+為強致病株、MRP+EF-為弱致病株、MRP-EF-為非致病株」的標準判定其致病性。
2.將針對豬鏈球菌2型毒力因子兩種毒力因子MRP和EF設計的引物對和探針組裝到一個螢光PCR體系中進行多重螢光PCR檢測，且相互間沒有幹擾，進一步提高了檢測的敏感性和特異性。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。本領域技術人員應理解，這些實施例僅用於說明本發明而絕不對本發明的範圍構成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常採用常規條件例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的方法。
實施例實施例1引物及探針的設計和合成根據豬鏈球菌2型兩種毒力因子MRP(GenBank No.X64450)和EF(GenBankNo.A24023)編碼基因的公開序列、採用探針設計軟體Beacon Designer 2.1設計引物對及探針，引物序列為MRP(正向)5』-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACCMRP(反向)5』-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG，擴增產物長度為80bp；所述探針的序列為5』-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC該探針的5』端用報告螢光染料JOE標記，3』端用淬滅螢光染料Eclipse標記。
EF(正向)5』-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGCEF(反向)5』-GAACATCTTGGGCGATTGAACC，擴增產物長度為139bp；所述探針的序列為5』-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC該探針的5』端用報告螢光染料FAM標記，3』端用淬滅螢光染料TAMRA標記。
上述兩種探針均針對待擴增序列間的高GC含量區。
實施例2DNA的提取
2.1菌體分離及培養在中國人民解放軍軍事醫學科學院P3實驗室，按照CDC(中國疾病預防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養程序進行。採用扁桃體拭子採取待檢豬的病料，帶回實驗室後，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養24h後，挑取可疑菌落接種於匹克氏增菌液，37℃培養24h後，再接種血清肉湯，37℃搖床培養後，革蘭氏染色、顯微鏡檢查後，滅活備用。
2.2組織基因組DNA的提取無菌採取待檢豬及健康豬的扁桃體、肌肉等組織，實驗室內，採用QIAGEN基因組提取試劑盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改進後分別提取其基因組DNA，具體步驟如下A.在無菌環境下(最好是在實驗室生物安全櫃中或超淨工作檯上進行操作)，將採集的組織樣本(如淋巴結、扁桃體、肌肉等)除去包膜和其它結締組織，選取內部實質部分，置玻璃勻漿器內充分磨成糊狀後備用。
B.將研成糊狀的20mg的動物組織放入離心管中，加180μl的buffer ATL。
C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋渦混合器混勻，55℃孵育直至組織完全消化(為保證試驗結果，消化時間應保持在1小時以上，如時間允許，過夜消化)，在消化的過程中需每隔一段時間振蕩混合一次。
D.旋渦15s，在樣品中加入200μl的buffer AL，旋渦混勻，70℃孵育30min。
E.在樣品中加入200μl的無水乙醇，旋渦混勻。
F.將試劑盒中的DNeasy Mini Spin Column安置於2ml的收集管上，將上述操作E中的溶液轉移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
G將DNeasy Mini Spin Column安置於新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
H.將DNeasy Mini Spin Column安置於新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)離心3min使DNeasy膜完全乾燥，棄去濾液和收集管。
I.將DNeasy Mini Spin Column安置於新的1.5ml的收集管上，將100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室溫孵育1min，≥6000g(8000rpm)離心1min洗脫DNA。
實施例3實時(Real-time)PCR擴增方法的建立3.1PCR反應體系將引物對和探針採用滅菌雙蒸水進行溶解，MRP/EF上、下遊引物濃度為20mM，不同標記的MRP/EF探針濃度為10mM。然後按照如下比例配製反應預混液20mM MRP/EF上、下遊引物各0.5μl，探針各0.5μl，10×PCR緩衝液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl23.0μl，2.5mM dNTP 2μl，4℃保存備用。
使用前，取上述預混液10.5μl，加入5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，然後加入1μl待檢組織基因組DNA作為模板，加滅菌雙蒸水使體積至25μl。
3.2PCR反應條件將樣品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR儀後，設置如下條件進行反應95℃預變性3min；然後採用二步法進行反應94℃，5s；55℃，10s，45個循環。每個循環結束後採集數據。反應結束後根據擴增曲線判定結果。
實施例4豬鏈球菌2型感染的多重螢光PCR方法的敏感性確定4.1多重螢光PCR檢測培養菌液的敏感性試驗以豬鏈球菌2型四川株(由中國人民解放軍軍事醫學科學院提供)培養菌液作為待檢菌液，計數後，採用血清肉湯培養液按照如下梯度稀釋後，直接進行菌液PCR，螢光PCR擴增後，分析Ct值，以Ct＝40作為檢測低限，確定本方法可以檢測的最少菌數。
表2.用於豬鏈球菌2型檢測的螢光PCR方法的敏感性實驗的培養菌液濃度(CFU/μl)

4.2多重螢光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型感染的敏感性試驗按照試劑盒組織用量說明，分別稱取10mg扁桃體組織，在其中分別加入如下表所述的計數後的豬鏈球菌2型培養菌液，按照DNA提取試劑盒操作提取其中的基因組DNA，並取1μl作為模板進行多重螢光PCR，PCR同時設置陽性和陰性對照。擴增後，分析Ct值，以Ct＝40作為檢測低限，確定本方法可以檢測的組織中最低豬鏈球菌2型的數量。
表3.螢光PCR檢測豬鏈球菌2型感染的敏感性實驗的組織中對應菌數(CFU/μl)

試驗結果多重螢光PCR技術檢測培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的敏感性試驗的結果如圖1所示。自圖1中可以看出，第6管的Ct值為37.2，低於預設的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計算，即採用本研究所建立的實時PCR方法單獨檢測MRP基因的敏感性為20CFU。
多重螢光PCR技術檢測培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子EF的敏感性試驗的結果如圖2所示。自圖2中可以看出，第7管的Ct值為36.2，低於預設的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計算，即採用本研究所建立的多重螢光PCR方法檢測培養液中豬鏈球菌2型EF基因的敏感性為10CFU。
多重螢光PCR技術檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗的結果如圖3所示。自圖3中可以看出，第6管的Ct值為34.3，低於預設的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計算，即採用本研究所建立的多重螢光PCR方法檢測MRP基因的敏感性為100CFU。
多重螢光PCR技術檢測組織中豬鏈球菌2型毒力因子EF的敏感性試驗的結果如圖4所示。自圖4中可以看出，第7管的Ct值為34.0，低於預設的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計算，即採用本研究所建立的多重螢光PCR方法檢測組織中豬鏈球菌2型EF基因的敏感性為50CFU。
實施例5豬鏈球菌2型感染的多重螢光PCR檢測方法特異性確定5.1多重螢光PCR檢測培養菌液的特異性試驗以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌(這三種菌株購自中國獸藥監察所)和豬霍亂沙門氏菌、豬多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進行螢光PCR擴增，根據擴增產物的有無判定本方法是否是檢測豬鏈球菌2型感染的特異性方法。
5.2多重螢光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型感染的特異性試驗採用正常組織基因組DNA作為空白對照，以在扁桃體組織中定量加入馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株後提取的DNA作為陰性對照，以加入豬鏈球菌2型四川株的扁桃體組織作為陽性樣品，進行多重螢光PCR，以檢驗本研究所建立方法的特異性。
試驗結果以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重螢光PCR擴增。對培養菌液中MRP基因的擴增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴增(見圖5)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應用於培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的檢測。
以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重螢光PCR擴增。對EF基因的擴增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴增(見圖6)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應用於培養菌液中豬鏈球菌2型毒力因子EF的聯合檢測。
以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重螢光PCR擴增。對組織中MRP基因的擴增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴增(見圖7)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應用於組織中豬鏈球菌2型毒力因子MRP的檢測。
以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進行豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF的多重螢光PCR擴增。對EF基因的擴增曲線分析表明，只有陽性對照有明顯的擴增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴增(見圖8)，說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應用於組織中豬鏈球菌2型毒力因子EF的聯合檢測。
結果判定方法反應結束後，儀器自動給出每個樣品的Ct值。記錄Ct值，分析檢測結果。如果反應曲線呈對數增長，而且Ct＜30，則表明為陽性；如果30＜Ct＜40，判為可疑，可以加大模板量再重複擴增，根據結果得到重複，則判為陽性，否則為陰性；如果反應曲線為一條直線，則為陰性。對於陽性菌株，以有無MRP和EF基因作為標準來判定其致病性。MRP+EF+為強致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株。
實施例6北京市某屠宰場扁桃體樣品85份，按照實施例2.2中所述方法提取組織基因組DNA後用ddH2O溶解。在各檢測管內加入10.5μl表1所示的致病性檢測試劑、0.5μl聚合酶、13μlddH2O，加入1μl上述提取的待檢DNA，反應同時設置摻入豬鏈球菌2型(四川株)菌液的扁桃體提取的DNA 1μl作為模板進行的陽性對照和以ddH2O作為陰性對照。
將樣品管放入螢光PCR儀後，設置如下條件進行反應95℃預變性3min；然後採用二步法進行反應94℃ 5s；55℃ 10s，40個循環。每個循環結束後採集螢光信號，反應結束後儀器自動給出Ct值。分析Ct值發現，陽性樣本的MRP擴增曲線的Ct值為21.5(圖9A)，EF為21.9(圖9B)，陰性對照沒有擴增曲線，表明試驗成立；各樣本均沒有明顯擴增曲線，表明各樣本均沒有檢出豬鏈球菌2型毒力因子MRP和EF，即所採集的所有扁桃體均不攜帶有豬鏈球菌2型。
序列表110中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所120應用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重螢光PCR檢測試劑及方法130
1606170PatentIn version 3.1210121123212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(23)223
4001agaccgtcca aaagtacctt acc 232102
21122212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(22)223
4002catttgttcc tggtgtcgtt gg 22210321124212DNA213人工序列220
221探針222(1)..(24)223
4003tgacccaaca gagccagacg agcc 242104
21120212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(20)223
4004acagtgcaga agcagtaggc 20210521122212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(22)223
4005gaacatcttg ggcgattgaa cc 222106
21124212DNA213人工序列220
221探針222(1)..(24)223
4006acgcctttgt cctctgccga ttgc 2權利要求
1.一種用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實時螢光PCR檢測試劑，該試劑包括分別特異性地針對豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)編碼基因的引物對及探針，其中所述的引物對及探針混合或各自獨立地存在於該檢測試劑中。
2.權利要求1所述的多重實時螢光PCR檢測試劑，其中所述的特異性地針對MRP編碼基因的引物對及探針的核苷酸序列為MRP引物(正向)5』-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACCMRP引物(反向)5』-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGGMRP探針5』-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCCMRP探針的5』端標記有報告螢光染料JOE，3』端標記有淬滅螢光染料Eclipse；所述的特異性地針對EF編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為EF引物(正向)5』-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGCEF引物(反向)5』-GAACATCTTGGGCGATTGAACCEP探針5』-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGCEP探針的5』端標記有報告螢光染料FAM，3』端標記有淬滅螢光染料TAMRA。
3.權利要求1或2所述的多重實時螢光PCR檢測試劑，該試劑中進一步還包括PCR擴增用的PCR緩衝液、MgCl2和dNTP。
4.權利要求3所述的多重實時螢光PCR檢測試劑，該試劑為由下列成分組成的混合液10X PCR緩衝液 2.5μl20mM MRP引物(正向)0.5μl20mM MRP引物(反向)0.5μl10mM MRP探針 0.5μl20mM EF引物(正向) 0.5μl20mM EF引物(反向) 0.5μl10mM EF探針 0.5μl25mM MgCl23.0μl2.5mM dNTP2.0μl
5.一種用於豬鏈球菌2型致病性檢測的多重實時螢光PCR檢測方法，該方法包括下列步驟1)使用特異性地針對MRP和EF的引物對及螢光素標記探針，與PCR擴增用的dNTP、PCR緩衝液及聚合酶混合，得到檢測預混液；2)向步驟1)得到的檢測預混液中加入待檢菌液或從待檢組織提取的基因組DNA作為擴增模板；3)將步驟2)中建立的擴增反應體系置於螢光PCR儀上；4)根據探針標記的報告螢光類型，選擇對應的螢光通道，進行螢光PCR擴增，記錄各檢測樣本的PCR擴增循環數(Ct)；5)根據各樣本的反應Ct值，按照豬鏈球菌2型致病性判定標準判定待檢樣本中豬鏈球菌2型的致病性。
6.權利要求5所述的多重實時螢光PCR檢測方法，該方法使用權利要求2所述的MRP引物對及探針和EF引物對及探針。
7.權利要求5所述的多重實時螢光PCR檢測方法，其中螢光PCR擴增條件為95℃預變性3min；然後採用二步法進行反應94℃，5s；55℃，10s，45個循環。
8.權利要求5所述的多重實時螢光PCR檢測方法，其中所述的豬鏈球菌2型致病性判定標準為(1)反應曲線呈對數增長時，Ct＜30，判定為陽性；30＜Ct＜40，判定為可疑，加大模板量重複擴增，得到相同的試驗結果，則判為陽性，否則為陰性；(2)反應曲線為一條直線，則為陰性；對於陽性菌株，以有無MRP和EF基因作為標準來判定其致病性，MRP+EF+為強致病株，MRP+EF-為弱致病株，MRP-EF-為非致病株。
全文摘要
本發明涉及多重螢光PCR檢測豬鏈球菌2型致病性的試劑及方法。更具體地說，本發明提供了同時應用針對豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)兩種毒力因子編碼基因設計的螢光PCR引物和探針序列進行豬鏈球菌2型致病性檢測的試劑和方法。本發明採用針對MRP和EF兩個基因設計的引物和探針，通過對目的基因序列和標記螢光基團的選擇和反應體系、反應條件的優化，組裝了檢測豬鏈球菌2型致病性的試劑，建立了對豬鏈球菌2型菌株致病性進行檢測的多重螢光PCR方法，根據擴增曲線即可判定待檢菌的致病性。
文檔編號C12Q1/68GK1908191SQ200610090148
公開日2007年2月7日 申請日期2006年6月29日 優先權日2006年6月29日
發明者林祥梅, 吳紹強, 韓雪清, 劉建, 梅琳, 賈廣樂 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所