一種提高CIK細胞增殖率和殺傷力的細胞培養方法與流程

2023-06-03 22:24:11 2

本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種提高CIK細胞增殖率和殺傷力的細胞培養方法。
背景技術：
：腫瘤的過繼性細胞免疫治療是指向腫瘤患者轉輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞(特異性和非特異性的)直接殺傷腫瘤或激發機體的免疫應答殺腫瘤細胞，可作為手術、放療、化療的補充，以提高療效和改善患者的生存質量。因此，近年來一直是腫瘤生物治療最活躍的領域。細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokineinducedkillercells，CIK)是將人體外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子刺激後獲得的一群異質細胞群，它具有增殖能力強、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等特點。CIK細胞能選擇性殺傷腫瘤細胞，無嚴格的主要組織相容性複合體(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性，特別是對於術後清除微小轉移灶、防止癌的擴散和復發、提高患者自身抗腫瘤免疫能力有重要作用。對於無法手術或對化療耐受的中晚期腫瘤患者也可起到改善生活質量、延長生命的積極作用。提高CIK細胞的增殖率和殺傷力有助於提高過繼性細胞免疫治療的效果。技術實現要素：本發明的目的是提供一種誘導CIK細胞的方法，以提高CIK細胞的增殖率和殺傷力。上述目的是通過如下技術方案實現的：一種提高CIK細胞增殖率和殺傷力的細胞培養方法：收集外周血的單個核細胞後進行誘導培養，誘導培養時在培養液中添加誘導增殖肽，利用誘導增殖肽作用於培養中的單個核細胞；所述誘導增殖肽為一種外源性多肽，序列如SEQIDNO.1所示。優選地，所述培養液為含20％小牛血清的RPMI1640培養液。優選地，所述誘導增殖肽作用於單個核細胞的濃度為10-20μmol/mL。優選地，所述培養液中還添加有γ幹擾素、抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2。優選地，所述γ幹擾素在培養液中的濃度為800-1200U/mL，所述抗人CD3單克隆抗體在培養液中的濃度為20-100ng/mL，所述重組人IL-2在培養液中的濃度為500-1500U/mL。優選地，所述的提高CIK細胞增殖率和殺傷力的細胞培養方法具體包括如下步驟：步驟S1，取外周血，收集外周血的單個核細胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細胞；步驟S2，用完全培養液調整單個核細胞濃度為1×106/mL；所述完全培養液為含20％小牛血清的RPMI1640培養液，含有800-1200U/mL的γ幹擾素和10-20μmol/mL的誘導增殖肽；步驟S3，培養24小時後，加入20-100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500-1500U/mL重組人IL-2，繼續誘導培養；以後每隔2-3天用含20％小牛血清的RPMI1640培養液半量換液，培養液中含20-100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500-1500U/mL重組人IL-2；步驟S4，整個誘導培養過程為10-14天，即得高增殖率和殺傷率的CIK細胞。優選地，所述γ幹擾素的濃度為1000U/mL。優選地，所述抗人CD3單克隆抗體的濃度為60ng/mL。優選地，所述抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a中的一種或多種。優選地，所述重組人IL-2的濃度為1000U/mL。本發明的有益效果：本發明提供的方法可以顯著提高CIK細胞的增殖率和殺傷力，有助於提高過繼性細胞免疫治療的效果。附圖說明圖1為CIK細胞的增殖倍數；圖2為CIK細胞對K562靶細胞的殺傷率。具體實施方式下面結合附圖和實施例具體介紹本發明的技術方案。實施例1：CIK細胞的誘導製備包括如下步驟：步驟S1，採用血細胞分離機上的淋巴細胞採集程序，單採集人外周血單個核細胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細胞；步驟S2，用完全培養液調整單個核細胞濃度為1×106/mL；所述完全培養液為含20％小牛血清的RPMI1640培養液，含有1000U/mL的γ幹擾素和15μmol/mL的誘導增殖肽；步驟S3，培養24小時後，加入60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2，繼續誘導培養；以後每隔3天用含20％小牛血清的RPMI1640培養液半量換液，培養液中含60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，終濃度各為20ng/mL；步驟S4，整個誘導培養過程為12天，培養環境為5％CO2、37℃。培養結束後計數擴增倍數並進行細胞毒活性測定。實施例2：CIK細胞的誘導製備包括如下步驟：步驟S1，採用血細胞分離機上的淋巴細胞採集程序，單採集人外周血單個核細胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細胞；步驟S2，用完全培養液調整單個核細胞濃度為1×106/mL；所述完全培養液為含20％小牛血清的RPMI1640培養液，含有800U/mL的γ幹擾素和10μmol/mL的誘導增殖肽；步驟S3，培養24小時後，加入20ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500U/mL重組人IL-2，繼續誘導培養；以後每隔2天用含20％小牛血清的RPMI1640培養液半量換液，培養液中含20ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3；步驟S4，整個誘導培養過程為14天，培養環境為5％CO2、37℃。培養結束後計數擴增倍數並進行細胞毒活性測定。實施例3：CIK細胞的誘導製備包括如下步驟：步驟S1，採用血細胞分離機上的淋巴細胞採集程序，單採集人外周血單個核細胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細胞；步驟S2，用完全培養液調整單個核細胞濃度為1×106/mL；所述完全培養液為含20％小牛血清的RPMI1640培養液，含有1200U/mL的γ幹擾素和20μmol/mL的誘導增殖肽；步驟S3，培養24小時後，加入100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1500U/mL重組人IL-2，繼續誘導培養；以後每隔2天用含20％小牛血清的RPMI1640培養液半量換液，培養液中含100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1500U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，OKT3和UCHT1終濃度各為30ng/mL，HIT3a濃度各為40ng/mL；步驟S4，整個誘導培養過程為10天，培養環境為5％CO2、37℃。培養結束後計數擴增倍數並進行細胞毒活性測定。實施例4：實施例1的對比實施例，不添加誘導增殖肽包括如下步驟：步驟S1，採用血細胞分離機上的淋巴細胞採集程序，單採集人外周血單個核細胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細胞；步驟S2，用完全培養液調整單個核細胞濃度為1×106/mL；所述完全培養液為含20％小牛血清的RPMI1640培養液，含有1000U/mL的γ幹擾素；步驟S3，培養24小時後，加入60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2，繼續誘導培養；以後每隔3天用含20％小牛血清的RPMI1640培養液半量換液，培養液中含60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，終濃度各為20ng/mL；步驟S4，整個誘導培養過程為12天，培養環境為5％CO2、37℃。培養結束後計數擴增倍數並進行細胞毒活性測定。實施例5：CIK細胞增殖倍數測定分別測定實施例1-4方法中CIK細胞的增殖倍數，結果如表1和圖1所示。表1CIK細胞的增殖倍數實施例1實施例2實施例3實施例4增殖倍數36.32±7.4331.55±6.5439.87±8.799.46±1.77結果表明，本發明提供的誘導增殖肽可以顯著提高CIK細胞的增殖率。實施例6：CIK細胞的細胞毒活性測定靶細胞為K562細胞株，效靶比5:1，1.8×105細胞總數/孔(96孔培養板)，每測量點設4個平行孔，效應細胞、靶細胞混合培養4h，加四甲基偶氮唑鹽(MTT)孵育2h後去上清，加二甲基亞碸(DMSO)，酶標儀570nm處測吸光度(A)值，計算CIK細胞對靶細胞的殺傷率。實施例1-4製備的CIK細胞對靶細胞的殺傷率見表2和圖2。表2CIK細胞對K562靶細胞的殺傷率(％)實施例1實施例2實施例3實施例4增殖倍數56.16±9.4850.44±8.9164.95±10.1328.78±3.55結果表明，本發明提供的誘導增殖肽可以顯著提高CIK細胞對靶細胞的殺傷率。實施例7：誘導增殖肽的製備本發明誘導增殖肽通過Fmoc法固相合成製備。Fmoc法固相合成技術：合成反應按照從C端向N端進行，Rink介質上有自由氨基；每一步連接過程中，胺基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍於介質上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-胺基酸；每次胺基酸的連接反應之後，都用一個吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物來封閉未連接的自由氨基，封閉反應10分鐘；每次胺基酸的連接反應之後，下一個胺基酸連接之前，都要把介質上的Fmoc-基團去掉，去Fmoc-基團使用含20％哌啶的二甲基甲醯胺，需15分鐘；最後，所有胺基酸殘基順序連接後，用98％三氟乙酸從Rink介質上切割下來，切割在室溫下進行2小時。經質譜鑑定確定為SEQIDNO.1所示序列。多肽的合成已經非常成熟，也可委託生物外包公司合成。研究發現，如下結構所示的六肽、七肽和八肽可以強化本發明誘導增殖肽對CIK細胞的誘導效果，進一步提高CIK細胞對靶細胞的殺傷力。六肽、七肽和八肽製備方法同實施例7。六肽：Lys-Trp-Cys-Ala-Glu-Ile七肽：Gln-Asp-Met-His-Gln-Leu-Gly八肽：Lys-Gln-Leu-Cys-Tyr-Met-Phe-Asp在實施例1誘導製備方法基礎上，步驟S2完全培養基中再添加0.2μmol/mL的六肽或七肽或八肽，CIK細胞對靶細胞的殺傷率可以提高到(73.16±10.42)％、(76.35±11.46)％、(80.06±12.17)％。但是，若不添加誘導增殖肽，即便添加了六肽或七肽或八肽，CIK細胞對靶細胞的殺傷率也僅與實施例4基本一致，不超過30％。這表明，上述六肽、七肽和八肽可強化本發明誘導增殖肽對CIK細胞的誘導效果，但本身不具有提高CIK細胞殺傷力的作用。綜上，本發明提供的方法可以顯著提高CIK細胞的增殖率和殺傷力，有助於提高過繼性細胞免疫治療的效果。上述實施例的作用僅在於說明本發明的實質性內容，但並不以此限定本發明的保護範圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp