一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法
2023-06-03 19:42:41 1
專利名稱：一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法
技術領域：
本發明涉及獲得蘭科植物種子萌發有效共生真菌的方法，具體來說涉及一種在兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)原生地誘導種子萌發,獲得原球莖,再從原球莖中分離、培養和篩選出對種子萌發有效共生真菌的方法。
背景技術：
蘭科植物的種子非常細小，僅有發育不完全的胚，在自然條件下種子萌發需要依靠特定的共生真菌來獲取營養物質。目前蘭科植物種子的萌發，多採用人工培養基在無菌條件下進行非共生萌發，萌發率雖高，但在進行瀕危種類野外回歸時，幼苗移植到自然環境中存活率較低，並且由於無法與自然界中的真菌建立共生關係從而導致後續生長嚴重受限。通過種子和其有效萌發真菌在自然條件下的共生萌發能很好的解決這ー問題。有效真菌的獲得目前多採用從蘭科植物野生植株的根中分離。但由於蘭科植物根中存在著大量作用未知的內生真菌，這使得種子萌發有效真菌的篩選和分離變得複雜而繁瑣。同時，不同蘭科植物根中的真菌與種子萌發階段的有效共生真菌是否相同目前仍不確定。因此，獲得種子萌發的有效共生真菌是開展珍稀瀕危蘭科植物回歸的關鍵環節。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，為實現兜唇石斛的野外回歸創造條件。本發明的目的通過以下技術方案予以實現。除非另有說明，本發明所採用的百分數均為重量百分數。本發明的技術方案主要是基於以下認識。我們將兜唇石斛的種子放入特製的種子袋中，並將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長的原生地，誘導種子萌發產生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌後在無菌條件下用人エ培養基培養，誘導原球莖中的內生真菌生長，待長出菌絲時，進行真菌的純化，獲得純菌落，並進行真菌的分子鑑定和保存。將獲得的真菌和兜唇石斛的種子進行共生萌發培養，設置對照實驗，以檢驗所獲得的真菌對兜唇石斛的種子萌發的有效性，結果表明所獲得的真菌是兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌，從而實現了本發明的目的。一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，包括以下步驟(I)在兜唇石斛花期進行人工異交授粉，果實成熟但果莢尚未裂開時收穫果實，將種子乾燥後置於無菌的密閉玻璃容器中在-20°C條件下保存，待用；(2)用滅菌的鑷子將100 200粒兜唇石斛的種子播種在尼龍網布上，將播好種子的尼龍網布對摺，用熱封機將三邊封起來，製作完成種子袋，在種子袋邊緣縫上標籤，便於監測和回收； (3)選擇有兜唇石斛成年植株自然生長的不同地點，將種子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹幹上，在種子袋上面覆蓋ー層苔蘚保溼；
種子袋放置時應 儘量靠近成年植株根部，並使種子袋呈水平狀態，避免種子在重力作用下聚集成團。(4)每個月定期從各放置點回收2 3個種子袋，檢查種子袋內種子的萌發情況，當發現有原球莖時，回收所有的種子袋；(5)將回收的原球莖依次用自來水衝洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗後切成兩半，切口面貼於馬鈴薯葡萄糖培養基PDA上進行培養；(6)原球莖切口處長出菌絲時，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養基上，轉移3 5次後，得到純菌落；(7)將兜唇石斛的種子放入無菌水中製成均勻的懸浮液，在配製好的燕麥瓊脂培養基(OMA)的培養皿表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養物的瓊脂塊，同時設置不接菌的對照處理組，每個處理10個重複，用封口膜密封后置於人工氣候箱中培養;(8)每周觀察I次不同處理的種子，記錄種子萌發數量及萌發時間，對種子萌發和原球莖發育情況進行分級，記錄每一階段內種子或原球莖的數量，通過和不接菌處理組的對比，篩選出兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌。上述步驟中，所述的種子袋採用網孔為45 μ m的尼龍網布。這樣的網孔大小既可以保持種子不掉出，又可以使水和真菌的菌絲自由穿過，熱封機封口時應避免損傷種子。步驟(3)中所述的種子袋放置點為同時有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗處。步驟(4)回收後的種子袋用自來水輕輕衝洗掉附著物及泥土，將清洗後的種子袋放在兩層面巾紙中間，輕輕按壓使面巾紙吸乾種子袋多餘的水分，用剪刀小心的剪開封口，打開種子袋放在解剖鏡下觀察種子萌發情況。步驟(5)所述的次氯酸鈉溶液有效氯離子濃度為1%，消毒3 5分鐘，無菌水衝洗3 4次；本步驟同時設置對照處理，用同一來源的原球莖表面滅菌後不切開直接置於PDA培養基中，若對照組培養基內未長出真菌，說明從實驗組原球莖切口周圍長出的真菌為原球莖的內生共生真菌。培養皿用封口膜封好後放入人工氣候箱內，25 ± 2 °C黑暗培養。步驟(7)所述的150微升的懸浮液約含150粒兜唇石斛種子，所述的培養條件為光照強度為 2000Lx-3000Lx，溫度 25°C ±2°C，光周期 12h/12hL/D。步驟(8)所述的種子萌發和原球莖發育情況參照Stewart & Zettler (2002)的方法對種子萌發和原球莖發育情況進行分級，分為5個階段階段O描述為種胚透明，種皮完好，種子未萌發，階段I描述為種胚吸水膨脹；階段2描述為種胚繼續膨大，突破種皮，視為萌發；階段3描述為出現原生分生組織；階段4描述為長出第一片葉片；階段5描述為第一片葉片繼續生長，變長。Stewart SL,Zettler Lff(2002)Symbiotic germination of three semi-aquaticrein orchids (Habenaria repens, H. quinqueseta, H. macroceratitis) from Florida.(佛羅裡達三種半水生玉鳳花屬植物(Habenaria repens, H. quinqueseta, H. macroceratitis)的種子共生萌發)Aquatic Botany (水生植物學)，72，25-35。對所獲得的兜唇石斛種子萌發有效共生真菌進行分子鑑定和比對，其為膠膜菌屬(Tulasenlla)真菌,且與美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登錄號為⑶166410. I的真菌Tulasenlla calospora最為相似,最大相似度達到99%，對其編號為FDaI7，採用試管斜面法保存於中國科學院西雙版納熱帶植物園。所述的分子鑑定中，採用CTAB法提取真菌DNA，PCR擴增所用引物為ITSl和ITS4 ;PCR擴增產物為上海生エ生物工程有限公司進行測序。本發明相對於現有技術具有以下優點雖然國內外都有專利和文獻報導有關蘭科植物種子萌發有效共生真菌的分離方法，但這些方法多採用從蘭科植物野生植株的根中分離真菌。由於蘭科植物根中存在著大量作用未知的內生真菌，這使得種子萌發有效共生真菌的篩選和分離工作異常複雜和繁瑣。同時，不同蘭科植物根中的真菌與種子萌發階段的 有效共生真菌是否相同並不確定，要獲得種子萌發有效共生真菌非常困難。對兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的分離尚無報導。本發明的方法直接從兜唇石斛種子原地共生萌發的原球莖中分離真菌，操作簡單，獲得的真菌種類單一，不需要大量繁瑣的篩選過程，分離到的ー種膠膜菌屬真菌通過和種子的共生萌發實驗，證明是兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌，從而為利用兜唇石斛種子和真菌共生萌發來培育種苗開闢了一條新的途徑。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進ー步地詳細說明，但實施例並不是對本發明技術方案的限制。所有基於本發明教導所作的變換，均應屬於本發明的保護範圍。實施例I :兜唇石斛開花時選取健壯的植株進行人工異交授粉，授粉後約180天果實成熟，採收已成熟但果莢尚未裂開的果實，表面用75%的酒精消毒並用無菌水清洗後用無菌刀片切開果實，將種子置於盛有矽膠的乾燥器內乾燥24小時後，於無菌的密閉玻璃小瓶內保存於-20°C中。用滅菌的鑷子將100-200粒兜唇石斛的種子均勻播種在6cmX9cm，網孔為45 y m的尼龍網布上，將播好種子的尼龍網布對摺，用熱封機將三邊封起來，製作完成一個種子袋，在種子袋邊緣縫上塑料標籤，便於監測和回收。選取中國科學院西雙版納熱帶植物園內4個種子袋放置點和西雙版納國家級自然保護區綠石林森林公園3個種子袋放置點，共計7個種子袋放置點。這些選取的放置點都有兜唇石斛自然生長的成年植株，且植株生長狀況良好，能正常開花結實。每個放置點各放置30個種子袋，共計210個種子袋，種子袋進行編號。將種子袋放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹幹上，用尼龍線固定，在種子袋上面覆蓋ー層苔蘚，以起到保溼的作用。放置時種子袋儘量靠近成年植株根部，使種子袋呈水平狀態，避免種子在重力作用下聚集成團。種子袋放置兩個月後，每個月從不同放置點各回收2-3個種子袋，回收後的種子袋用自來水輕輕衝洗掉附著物及泥土，將清洗後的種子袋放在兩層面巾紙中間，輕輕按壓使面巾紙吸乾種子袋多餘的水分，用剪刀小心的剪開封ロ，打開種子袋放在解剖鏡下觀察種子萌發情況。當發現有原球莖時，於2011年8月20日回收所有剰餘的種子袋。從4個放置點共獲得55粒原球莖，其餘3個放置點種子袋內沒有原球莖或種子袋破損。將原球莖用自來水衝洗後，在超淨工作檯中放入盛有有效氯離子濃度為1%的次氯酸鈉溶液的燒杯中，輕輕搖動燒杯3-5分鐘後，用無菌鈍頭鑷子取出，再用無菌水衝洗3-4次。用無菌刀片將每個原球莖切成兩半，切口面貼於準備好的馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)上進行培養。同時將2個表面消毒的原球莖不切開直接置於PDA培養基中，作為對照。培養皿用封口膜封好後放入人工氣候箱內，25±2°C黑暗培養。培養7天後，未切開的原球莖周圍未長出菌絲，而切開的原球莖周圍長出白色菌絲，由此可以確定為兜唇石斛原球莖的內生真菌。原球莖切口處長出菌絲時，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養基上，轉移3-5次後，得純菌落。將保存的兜唇石斛種子從-20°C中取出，置於室溫下過夜使種子回復室溫。用有效氯離子濃度為I %的次氯酸鈉溶液對種子進行滅菌並用無菌水漂洗3-4次後，將種子放入無菌水中製成均勻的懸浮液。在配製好的燕麥瓊脂培養基(OMA)的培養皿表面放置兩張
I.5cmX4cm大小無菌濾紙,分別吸取150微升種子懸浮液(約150粒)均勻的散布在兩張濾紙條上。在培養基中心接種約O. 5cm3 (IcmX lcmXO. 5cm)含有不同來源的單一共生真菌純培養物的瓊脂塊，同時設置不接菌的對照處理組，每個處理10個重複，用封口膜密封后置於人工氣候箱中培養培養條件為光照強度為2000Lx-3000Lx，溫度25°C ±2°C，光周期12h/12h L/Dο培養5周後，只有接種FDaI7菌株處理的種子萌發達到階段2及後續階段，達到階段2及後續階段的種子比率為48. 79%,而接種FCb4菌株、FDaI2菌株及未接菌對照組只有吸水膨脹達到階段I的種子，未形成原球莖，說明FDaI7為兜唇石斛種子萌發的有效共生真
菌。 對所獲得的FDaI 7菌株進行分子鑑定和比對，其為膠膜菌屬(Tulasenlla)真菌，且與美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登錄號為⑶166410. I的真菌Tulasenlla calospora最為相似,最大相似度達到99%。對此菌株採用試管斜面法保存於中國科學院西雙版納熱帶植物園。
權利要求
1.一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，包括以下步驟 (1)在兜唇石斛花期進行人工異交授粉，果實成熟但果莢尚未裂開時收穫果實，將種子乾燥後置於無菌的密閉玻璃容器中在-20°C條件下保存，待用； (2)用滅菌的鑷子將100 200粒兜唇石斛的種子播種在尼龍網布上，將播好種子的尼龍網布對摺，用熱封機將三邊封起來，製作完成種子袋，在種子袋邊緣縫上標籤，便於監測和回收； (3)選擇有兜唇石斛成年植株自然生長的不同地點，將種子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的樹幹上，在種子袋上面覆蓋一層苔蘚保溼； (4)每個月定期從各放置點回收2 3個種子袋，檢查種子袋內種子的萌發情況，當發現有原球莖時，回收所有的種子袋； (5)將回收的原球莖依次用自來水衝洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗後切成兩半，切口面貼於馬鈴薯葡萄糖培養基PDA上進行培養； (6)原球莖切口處長出菌絲時，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養基上，轉移3 5次後，得到純菌落； (7)將兜唇石斛的種子放入無菌水中製成均勻的懸浮液，在配製好的燕麥瓊脂培養基的培養皿表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養物的瓊脂塊，同時設置不接菌的對照處理組，每個處理10個重複，用封口膜密封后置於人工氣候箱中培養； (8)每周觀察I次不同處理的種子，記錄種子萌發數量及萌發時間，對種子萌發和原球莖發育情況進行分級，記錄每一階段內種子或原球莖的數量，通過和不接菌處理組的對比，篩選出兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌。
2.根據權利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，其特徵在於所述的所述的種子袋採用網孔為45 μ m的尼龍網布。
3.根據權利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，其特徵在於步驟(3)中，種子袋放置時應儘量靠近成年植株根部，並使種子袋呈水平狀態。
4.根據權利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，其特徵在於步驟(3)中所述的種子袋放置點為同時有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗處。
5.根據權利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，其特徵在於步驟(5)所述的次氯酸鈉溶液有效氯離子濃度為I %，消毒3 5分鐘，無菌水衝洗3 4次。
6.根據權利要求I所述的獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法，其特徵在於步驟(7)所述的培養條件為光照強度為2000Lx-3000Lx，溫度25°C ±2°C，光周期12h/12hL/D。
全文摘要
本發明公開了一種獲得兜唇石斛種子萌發有效共生真菌的方法。將兜唇石斛母株通過人工異交授粉後得到成熟的種子，把種子放入特製的種子袋中，將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長的原生地，在自然條件下誘導種子萌發產生原球莖；將獲得的原球莖表面滅菌後在無菌條件下用人工培養基培養，誘導原球莖中的內生真菌生長，待長出菌絲時，進行真菌的純化，獲得純菌落；將獲得的真菌和兜唇石斛的種子進行共生萌發培養，設置對照實驗，以檢驗所獲得的真菌對兜唇石斛的種子萌發的有效性，篩選出兜唇石斛種子萌發的有效共生真菌，並進行真菌的分子鑑定和保存。本發明為利用兜唇石斛種子和真菌共生萌發來培育種苗開闢了一條新的途徑。
文檔編號A01C1/04GK102612966SQ20121009750
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者林華, 盛春玲, 範旭麗, 高江雲 申請人:中國科學院西雙版納熱帶植物園