一種從南極磷蝦中純化製備2,6‑二叔丁基對甲酚的方法與流程

2023-06-03 04:52:27

本發明屬於食品和化學領域，具體涉及一種從南極磷蝦中純化製備2,6-二叔丁基對甲酚的方法。

背景技術：

南極磷蝦(Euphausia superba)是生活於南極生態系統中的一種重要的生物資源，屬於節肢動物門、甲殼綱、磷蝦目，磷蝦的壽命一般為5-7年，2齡以後即成熟，體長最大可達到60mm以上。南極磷蝦具有結群的習性，經常生活在200m以內的淺水層形成密集的群體，是鳥類和魚類等南極生物主要的食物來源。南極磷蝦是地球上數量最大繁衍最成功的單種生物資源之一，其生物蘊藏量約為6.5×108～10×108噸，最新估算量為3.79×108噸。南極磷蝦含有豐富的油脂，油脂中的抗氧化物質如蝦青素、蝦青素酯、不飽和脂肪酸、2，6-二叔丁基對甲酚等。

2，6-二叔丁基對甲酚(縮寫為BHT)是國內外廣泛使用的油溶性抗氧化劑，抗氧化能力較強，耐熱及穩定性好。主要可以用於油脂等食品添加中，防止其酸敗，維持食品的顏色和氣味等，還廣泛用於高分子材料、石油製品、和食品加工工業中。

目前2，6-二叔丁基對甲酚較常見的製備方法為化學合成方法，並未見在南極磷蝦中的提取純化的研究報導。因此，研究一種從南極磷蝦中提取純化的2，6-二叔丁基對甲酚的方法，這對南極磷蝦資源的開發利用以及2，6-二叔丁基對甲酚的製備具有十分重要的意義。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單、準確、可靠的南極磷蝦2，6-二叔丁基對甲酚的純化製備方法。

本發明採用下述技術方案：

一種從南極磷蝦中純化製備2,6-二叔丁基對甲酚的方法，包括以下工序：

製備粗提物的工序：南極磷蝦用甲醇進行提取，得到2,6-二叔丁基對甲酚粗提物；

第一次純化工序：該工序採用薄層層析刮板法對2,6-二叔丁基對甲酚粗提物進行純化，得到2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品；所述薄層層析中以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1為展開劑；

定性工序：該工序採用分析型高效液相色譜法對2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品進行定性分析，根據保留時間確定所述第一次純化工序的粗樣品中含有2,6-二叔丁基對甲酚；

第二次純化工序：該工序採用製備型高效液相色譜法對2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品進行分離純化，在目標保留時間內將含有2,6-二叔丁基對甲酚的洗脫液接出，蒸發除去溶劑得到純化後的2,6-二叔丁基對甲酚樣品。

本發明的製備粗提物的工序中，所述提取方法採用超聲波提取，超聲波提取條件為：室溫、300-400W、20或40kHz，提取時間為10-20分鐘；優選的，所述超聲波提取條件為：室溫、350W、40kHz、提取時間為15分鐘。

製備2,6-二叔丁基對甲酚粗體物的具體操作方法為：將南極磷蝦與甲醇進行超聲波提取，過濾提取液，得到濾液，將所述濾液蒸乾，然後用甲醇溶解，即得到2,6-二叔丁基對甲酚粗提物。

其中，所述南極磷蝦選用新鮮南極磷蝦，從提高2,6-二叔丁基對甲酚的觀點出發，所述南極磷蝦與甲醇的添加量比例為1g：(3～6)mL，採用此比例的南極磷蝦和甲醇提取為後續純化提供了良好的基礎。

本發明的第一次純化工序中：所述薄層層析刮板法的基本操作為本領域技術人員所公知的技術手段，基本操作步驟為：點樣、展開、顯色、刮板、洗脫。

對於薄層層析方法的分離純化的效果十分重要的因素是展開劑，在展開劑的選取過程中，嘗試了多種組合：氯仿：甲醇：乙酸、氯仿：乙酸乙酯、氯仿：乙酸乙酯：乙酸、乙酸乙酯：丙酮：石油醚等，但是2,6-二叔丁基對甲酚的Rf值偏高，且拖尾嚴重。因此選取極性較低的展開劑組合，通過嘗試各溶劑間組合和體積的配比，最終確定了石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1(V/V/V)為最適展開劑，此時南極磷蝦中的2,6-二叔丁基對甲酚得到了很好的分離純化，且Rf值合適。

本發明中的薄層層析刮板法，本發明選取高效薄層矽膠板H板(10×20cm)，展距為8～10cm(優選9cm)；染色採用氯化鐵水溶液進行染色，100～110℃烘烤5-10分鐘，根據顯色結果，確定2,6-二叔丁基對甲酚的Rf＝0.79，其中，所述氯化鐵水溶液的質量分數為4～6％；洗脫時採用甲醇進行溶解；採用甲醇溶解後，進行超聲波提取，超聲波條件為：超聲時間為5～8min，功率為300～400W。

優選的，製備2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品的具體操作方法為：

取2,6-二叔丁基對甲酚粗提物和標準液點於高效薄層矽膠板H板上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1為展開劑，展距9.0cm，展完後晾乾展板；在距離高效薄層矽膠板H板設定處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層矽膠板H板用氯化鐵水溶液進行染色，然後進行烘烤，根據顯色結果，確定割下的薄層矽膠板H板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，對照薄層矽膠板H板上未被染色部分，將處於同一Rf值處的色譜帶刮下，將矽膠粉末放入離心管中，用色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取5-8min，功率設置為300～400W。超聲完成後，將離心管放入離心機中進行離心，收集上清液，重複進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程若干次(優選10次)，將收集到的上清液蒸發除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，即為2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品。其中，所述標準液的製備方法如下：稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液。

分析型高效液相色譜法能夠全面反映樣品組成信息，並對各組分進行定量和定性，採用分析型高效液相色譜儀完成；而製備型液相色譜方法主要是對產品的單體進行提取純化和鑑別。本發明中的定性工序和第二次純化工序中，高效液相色譜法參數均如下：色譜柱為C18柱，流動相為甲醇：水＝8～10:1(v/v)；洗脫模式為等度洗脫，流速為0.8～1.2mL/min，進樣量為8～12μL。優選的參數如下，流動相為甲醇：水＝9:1；流速為1mL/min；洗脫時間為16-18min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。

本發明的定性工序中，所述分析型高效液相色譜法的條件為：色譜柱為C18柱，優選的型號是YMC-Pack ODS-A，內徑和長度250×4.6mm，粒徑：5μm，孔徑：12nm。

定性工序的具體操作方法為：按照設定好的參數和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經微孔濾膜(優選孔徑為0.45μm)過濾後進樣。取2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用微孔濾膜(優選孔徑為0.45μm)過濾後進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。

本發明的第二次純化工序中，所述製備型高效液相色譜法的條件為：色譜柱為C18柱，優選的型號是YMC-Pack ODS-A，內徑和長度：250×10mm，填料粒徑：5μm，孔徑：12nm。

第二次純化工序的具體操作方法為：

將2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，按照設定好的參數和條件，利用製備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與製備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重複操作，收集合併洗脫液後進行蒸發，得到純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。

採用以上方法製備得到的含有2,6-二叔丁基對甲酚的南極磷蝦樣品，該樣品中2,6-二叔丁基對甲酚的含量較高，可達96％以上。

上述技術方案中的一個技術方案具有如下有益效果：

(1)本發明首次發現了南極磷蝦中存在天然抗氧化劑2,6-二叔丁基對甲酚，打破了2,6-二叔丁基對甲酚只能人工合成的傳統觀點，為2,6-二叔丁基對甲酚的製備提供一種新的思路和途徑，對南極磷蝦資源的開發和利用也具有十分重要的意義。

(2)針對南極磷蝦這一特定的海洋動物，本發明提供了純化製備南極磷蝦2,6-二叔丁基對甲酚的良好方法，該方法簡單、準確、可靠、穩定，得到的樣品中2,6-二叔丁基對甲酚的純度可達96％以上。

(3)本發明針對南極磷蝦中的2,6-二叔丁基對甲酚，首先採用甲醇預處理南極磷蝦得到含有2,6-二叔丁基對甲酚的粗提物，然後選取薄層層析刮板法製備含有2,6-二叔丁基對甲酚的粗樣品，再通過分析型高效液相色譜法進行成分分析，根據保留時間確定粗樣品中含有2,6-二叔丁基對甲酚，但同時還發現部分雜質，最後採用製備型高效液相色譜法分離得到高純度的2,6-二叔丁基對甲酚。本發明在製備南極磷蝦中的2,6-二叔丁基對甲酚選用了合適的提取、分離和純化的方法，使得本發明能夠順利高效從南極磷蝦中製備得到高純度的2,6-二叔丁基對甲酚。

附圖說明

圖1是2,6-二叔丁基對甲酚標準品的高效液相色譜圖。

圖2是2,6-二叔丁基對甲酚標準品的高效液相色譜峰面積積分圖。

圖3是實施例1中的BHT粗樣品的高效液相色譜圖。

圖4是實施例1中的純化後樣品的高效液相色譜圖。

圖5是實施例1中的純化後樣品的高效液相色譜峰面積積分圖。

圖6是實施例1中的純化後的高效薄層矽膠板，其中，A、2,6二叔丁基對甲酚樣品，B、2,6-二叔丁基對甲酚標準品。

圖7是實施例2中的純化後的高效薄層矽膠板，其中，A、2,6二叔丁基對甲酚樣品，B、2,6-二叔丁基對甲酚標準品。

圖8是實施例3中的純化後的高效薄層矽膠板，其中，A、2,6二叔丁基對甲酚樣品，B、2,6-二叔丁基對甲酚標準品。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

實施例1

取新鮮的南極磷蝦10g(w)和甲醇(v)以1:3的比例在室溫、350w、40kHz的條件下超聲提取15分鐘，過濾提取液。將上述濾液置於旋蒸儀中蒸乾，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基對甲酚的粗提物。精密稱取1mg 2，6-二叔丁基對甲酚標準品溶於1.0mL甲醇，得濃度為1mg/ml的標準液。取待檢測的粗提物和標準液點於高效薄層矽膠板H板(10×20cm)上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4:1:0.5為展開劑，展距9.0cm，展完後晾乾展板；在距離薄層板1cm處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層板用5％氯化鐵水溶液進行染色，105℃烘烤5分鐘，根據顯色結果，確定割下的薄層板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，如圖6，對照薄層板上未被染色部分，將處於同一Rf值處的色譜帶刮下，一般為每塊板5-6mg，將矽膠粉末放入4mL離心管中，用2mL色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取5min，功率設置為350W。超聲完成後，將離心管放入離心機中，調控轉速為8000rpm，離心5min，收集上清液，重複進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程10次，將收集到的上清液利用旋轉蒸發儀蒸發除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，作為初步製備得到的粗樣品。

高效液相色譜法分離參數如下：流動相為甲醇：水＝9:1；洗脫模式為等度洗脫；流速為1mL/min；洗脫時間為16min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。按照設定好的參數和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經0.45μm微孔濾膜過濾後進樣。取經刮板得到的粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾後進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，檢測結果如圖1、圖2和圖3，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。以刮板法製得的2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，利用製備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與製備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重複操作，收集合併洗脫液後用旋轉蒸發儀進行旋轉蒸發，得到純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。取純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物用色譜級甲醇溶解，經0.45μm微孔濾膜過濾後進樣檢測，檢測結果如圖4和圖5，對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度為96.05％。

實施例2

取新鮮的南極磷蝦10g(w)和甲醇(v)以1:5的比例在室溫、300w、20kHz的條件下超聲提取10分鐘，過濾提取液。將上述濾液置於旋蒸儀中蒸乾，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基對甲酚的粗提物。精密稱取1mg 2，6-二叔丁基對甲酚標準品溶於1.0mL甲醇，得濃度為1mg/ml的標準液。取待檢測的粗提物和標準液點於高效薄層矽膠板H板(10×20cm)上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-2:1為展開劑，展距9.0cm，展完後晾乾展板；在距離薄層板1cm處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層板用5％氯化鐵水溶液進行染色，105℃烘烤8分鐘，根據顯色結果，確定割下的薄層板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，如圖7，對照薄層板上未被染色部分，將處於同一Rf值處的色譜帶刮下，一般為每塊板5-6mg，將矽膠粉末放入4mL離心管中，用2mL色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取6min，功率設置為350W。超聲完成後，將離心管放入離心機中，調控轉速為8000rpm，離心6min，收集上清液，重複進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程10次，將收集到的上清液利用旋轉蒸發儀蒸發除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，作為初步製備得到的粗樣品。

高效液相色譜法分離參數如下：流動相為甲醇：水＝9:1；洗脫模式為等度洗脫；流速為1mL/min；洗脫時間為16-18min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。按照設定好的參數和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經0.45μm微孔濾膜過濾後進樣。取經刮板得到的粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾後進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。以刮板法製得的2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，利用製備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與製備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重複操作，收集合併洗脫液後用旋轉蒸發儀進行旋轉蒸發，得到純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。取純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物用色譜級甲醇溶解，經0.45μm微孔濾膜過濾後進樣檢測，對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度為96.05％

實施例3

取新鮮的南極磷蝦10g(w)和甲醇(v)以1:6的比例在室溫、400w、40kHz的條件下超聲提取20分鐘，過濾提取液。將上述濾液置於旋蒸儀中蒸乾，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基對甲酚的粗提物。精密稱取1mg 2，6-二叔丁基對甲酚標準品溶於1.0mL甲醇，得濃度為1mg/ml的標準液。取待檢測的粗提物和標準液點於高效薄層矽膠板H板

(10×20cm)上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝5:1:1為展開劑，展距9.0cm，展完後晾乾展板；在距離薄層板1cm處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層板用5％氯化鐵水溶液進行染色，105℃烘烤5-10分鐘，根據顯色結果，確定割下的薄層板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，如圖8，對照薄層板上未被染色部分，將處於同一Rf值處的色譜帶刮下，一般為每塊板5-6mg，將矽膠粉末放入4mL離心管中，用2mL色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取8min，功率設置為350W。超聲完成後，將離心管放入離心機中，調控轉速為8000rpm，離心8min，收集上清液，重複進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程10次，將收集到的上清液利用旋轉蒸發儀蒸發除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，作為初步製備得到的粗樣品。

高效液相色譜法分離參數如下：流動相為甲醇：水＝9:1；洗脫模式為等度洗脫；流速為1mL/min；洗脫時間為16-18min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。按照設定好的參數和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經0.45μm微孔濾膜過濾後進樣。取經刮板得到的粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾後進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。以刮板法製得的2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，利用製備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與製備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重複操作，收集合併洗脫液後用旋轉蒸發儀進行旋轉蒸發，得到純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。取純化後的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物用色譜級甲醇溶解，經0.45μm微孔濾膜過濾後進樣檢測，對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積佔樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度為96.05％。