一種基於近場光學技術的單分子DNA無損檢測晶片的製作方法

2023-05-28 12:46:26

本發明屬於生物分子檢測技術領域，具體涉及一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片。

背景技術：

dna測序技術，作為最重要的生物醫學研究手段之一,對基因組學及其相關學科的發展起著至關重要的作用。而單分子無損測序技術是目前dna測序技術的最新發展方向，在高速測序、長序列產出和低成本方面具有巨大的潛力。目前存在的dna單分子測序技術大都基於納米孔方法，即通過鹼基與納米孔摩擦產生的生物電以確定鹼基順序。然而生物電識別方式的特異性不高，抗幹擾性差，造成單鹼基識別錯誤率高。除此之外，現有的單分子dna測序技術還存在以下幾個缺點：(1)讀長較小；(2)dna碎片拼接錯誤率高；(3)速度較慢。因此，亟需一種新型高效的單分子dna測序技術。

技術實現要素：

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高特異性、高讀長、高準確率、高速測序的基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片。

本發明的技術方案概述如下：

一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片，包括氮化矽基板6，在氮化矽基板上表面設置有凹槽，凹槽從左到右依次由矩形的dna分子樣品池1、漸窄坑道2、窄坑道3、漸寬坑道4和矩形的廢液池5連接組成，在窄坑道3之上搭載有氧化石墨烯膜7(跨橋結構)，在氧化石墨烯膜7的左右兩端分別設置有第一金納米粒子單層膜8和第二金納米粒子單層膜9(天窗結構)，電極a設置在矩形的dna分子樣品池1內，電極b設置在矩形的廢液池5內，電極a和電極b分別通過導線與電源相連接。

優選地，矩形的dna分子樣品池的寬度為100nm，窄坑道的寬度為10nm，廢液池的寬度為100nm。

第一金納米粒子單層膜和第二金納米粒子單層膜之間的縫隙10的尺寸為0.45-0.65nm。本發明的優點：

(1)本發明利用氧化石墨烯膜，可以有效藉助分子間的π-π作用而對dna分子的單鹼基進行精細捕獲，限制其熱力學及動力學的隨機性，確保針尖增強拉曼光譜系統以近100％捕獲效率採集到單個鹼基信息，極大提高檢測系統的響應速度和精度。

(2)本發明可以高效地控制dna的運動流向及精確輸入檢測區域。

(3)氧化石墨烯與單鹼基形成的局域場π-π作用，可有效地提高單鹼基拉曼散射截面，從而增強拉曼信號；在此基礎上，通過π-π電子作用可極大增強局域場內的電子云密度，能夠在等離子域空間內形成更強的ters效應。

(4)採用氧化石墨烯為光透導體，上面覆蓋金納米粒子單層膜，可在有效屏蔽針尖對單鹼基的電場影響的同時，不影響近場光譜的採集。

(5)由於目前針尖增強拉曼光譜系統普遍的解析度為20nm，本發明使用具有跨橋結構的石墨烯捕獲帶(即氧化石墨烯膜7橫跨窄坑道3搭載在氮化矽基板上，)以進一步提升針尖增強拉曼光譜系統的空間解析度；該捕獲帶採用金納米粒子單層膜覆蓋氧化石墨烯膜，以原子力顯微鏡操縱的方式留出0.45nm-0.65nm的天窗(第一金納米粒子單層膜和第二金納米粒子單層膜之間的縫隙)以匹配單鹼基的空間距離，進而將針尖增強拉曼光譜的解析度提升為0.55nm左右，從而可以識別單鹼基。

附圖說明

圖1為本發明一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片的主視示意圖。

圖2為本發明一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片的俯視示意圖。

具體實施方式

下面通過附圖對本發明作進一步的說明。

一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片(見圖1，圖2)，包括氮化矽基板6，在氮化矽基板上表面設置有凹槽，凹槽從左到右依次由矩形的dna分子樣品池1、漸窄坑道2、窄坑道3、漸寬坑道4和矩形的廢液池5連接組成，在窄坑道3之上搭載有氧化石墨烯膜7，在氧化石墨烯膜7的左右兩端分別設置有第一金納米粒子單層膜8和第二金納米粒子單層膜9，電極a設置在矩形的dna分子樣品池1內，電極b設置在矩形的廢液池5內，電極a和電極b分別通過導線與電源相連接。

使用聚焦離子束(fib)納米加工技術，將氮化矽(si3n4)基板，加工出寬度為100nm的矩形的dna分子樣品池1，漸窄坑道2，寬度為10nm的窄坑道3，漸寬坑道4和寬度為100nm的矩形廢液池5，電極a設置在dna分子樣品池1內，電極b設置在廢液池5內，電極a和電極b分別通過導線與電源相連接，在窄坑道上搭載氧化石墨烯膜7，使其在窄坑道上形成跨橋結構的捕獲帶，在氧化石墨烯膜7左右兩端分別設置有不透明第一金納米粒子單層膜8第二金納米粒子單層膜9，這兩個膜之間的縫隙的尺寸為0.55nm，也可以是0.45nm或0.65nm，以有效匹配dna鹼基空間距離，進而形成跨橋天窗式的複合結構以利於後續的針尖增強拉曼光譜檢測。

本發明的一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片使用針尖增強拉曼光譜系統進行檢測。

一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片的使用：

將濃度1mol/l,ph值為8.0的nacl水溶液輸入凹槽中鋪滿，然後將已分離為單鏈的dna分子放入矩形的dna分子樣品池1中，再將本發明的晶片放置在針尖增強拉曼光譜系統的樣品臺上，並將針尖增強拉曼光譜系統的探針放在第一金納米粒子單層膜8和第二金納米粒子單層膜9之間的氧化石墨烯膜7的上方；

給電極通電，通過電極給所述晶片以電場力，由於氧化石墨烯與單鏈dna分子的π-π堆積和電場力的共同作用，帶負電的dna分子會保持單鏈狀態，通過漸窄坑道2，進入窄坑道3。

當dna分子經過針尖增強拉曼光譜系統探針的位置時，系統物鏡將激發光束聚焦在探針針尖頂端，產生的局域增強場則會激發針尖下方氮化矽基板(6)上的dna樣品鹼基的拉曼信號。通過針尖增強拉曼光譜系統的物鏡收集局部域的拉曼信號，並將信號引入針尖增強拉曼光譜系統進行信號處理。針尖增強拉曼光譜系統會自動記錄此時單鹼基的拉曼信號。之後dna分子會在電場力的驅動下，進入廢液區，進而完成單個dna分子的無損檢測。

實驗：檢測dna中的四種鹼基

實驗材料：人工合成的核苷酸片段agctagct。

儀器設置：針尖增強拉曼光譜系統，雷射強度設定為100mw，雷射波長為532nm，收集時間為0.1毫秒。本發明的一種基於近場光學技術的單分子dna無損檢測晶片，第一金納米粒子單層膜和第二金納米粒子單層膜之間的縫隙(10)為0.55nm。

操作過程：將濃度為1mol/l、ph值為8.0的nacl水溶液輸入凹槽中鋪滿，將此人工合成的核苷酸片段agctagct注入矩形的dna分子樣品池1中，再將本發明的晶片放置在針尖增強拉曼光譜系統的樣品臺上，藉助原子力顯微鏡找到第一金納米粒子單層膜8和第二金納米粒子單層膜9之間的氧化石墨烯膜7的中心位置。給電極通電，通過電極給所述晶片以電場力，帶負電的dna分子會保持單鏈狀態，通過漸窄坑道2，進入窄坑道3。當電極開始通電之後，即開始進行針尖增強拉曼光譜信號採集，以順序獲得單個鹼基光譜信號，當所有核苷酸進入廢液池後，停止信號採集。

結果：表1是使用針尖增強拉曼光譜系統檢測此人工合成的片段四種不同鹼基後得到的鹼基種類所對應的拉曼光譜譜峰。可以看到，不同鹼基的拉曼特徵譜峰具有唯一性且不與其它鹼基特徵重疊，可作為單個鹼基識別的依據，具有極高的準確性。

表1四個鹼基對應的針尖增強拉曼譜峰位置