用於富集含稀有等位基因的物質的核酸分子的競爭性組合物的製作方法
2023-05-28 12:58:26
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序列表
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背景技術：
核酸用作疾病的重要分子標記物，並且對特定DBA和RNA序列的精確檢測形成許多研究和診斷產品的基礎。然而，許多(如果不是大多數)現有技術平臺仍在努力解決區分緊密相關的核酸序列，如相差單個核苷酸的那些。
單核苷酸差異的區分具有兩個主要應用：單核苷酸多態性(SNP)基因分型；和稀有等位基因檢測。在SNP基因分型中，靶標DNA樣品是100％的一種等位基因，或在2種等位基因之間50％的分布，並且因此，SNP基因分型一般是用市售方案解決的問題。
在稀有等位基因檢測中，靶標DNA樣品可具有不到1％的特定稀有等位基因(在本文中稱為「含稀有等位基因的物質」)。例如，含有癌症突變的無循環細胞核酸可以是癌症發生或復發的指示，並且對於檢測這種物質存在強烈興趣。專門的技術平臺已經市場化，其能夠檢測低至0.1％至0.001％頻率的稀有等位基因，但是這些一般需要無法市售可得的昂貴儀器。類似地，更廣泛基礎的儀器的生產商對於新分子技術感興趣，該技術可增強它們的平臺進行稀有等位基因和突變檢測的能力。然而，迄今為止，目前還沒有一種可與多種探針物質聯用的精確且廉價的檢測系統。
發明概述
本發明提供了用於探針系統的組合物和方法。在一個實施方式中，提供可用於檢測樣品中含稀有等位基因的核酸物質的核酸檢測組合物，所述樣品包含過量的含主要等位基因的核酸物質，其中含稀有等位基因的核酸物質和含主要等位基因的核酸物質的序列除了在共有的比對區中的一個或多個核苷酸以外是保守的。含主要等位基因的核酸中的共有比對區稱為非靶核酸序列(變體)並且含稀有等位基因的核酸物質上的共有區被稱為靶核酸序列(靶標)。在一種情況中，組合物包含2種探針複合物和2種分離的寡核苷酸。第一探針複合物對靶核酸序列有特異性並且在本文中被稱為「靶核酸探針」或「探針」，而第二探針複合物對變體核酸序列有特異性並且在本文中被稱為「變體核酸探針」或「庫(Sink)」。探針包含第一靶標探針寡核苷酸和第二靶標探針寡核苷酸。第一靶標探針寡核苷酸包含與靶核酸序列互補的靶標探針互補區以及一個或多個不與靶核酸序列互補的非互補區。第二靶標探針寡核苷酸包含與靶標探針互補區的第一靶標探針互補子序列互補的靶標探針保護區和一個或多個非保護區。考慮到第一和第二靶標探針寡核苷酸具有互補序列，探針包含靶標雙鏈探針部分和靶標單鏈探針部分，其中靶標雙鏈探針部分包含第一靶標探針互補子序列和靶標探針保護區，並且靶標單鏈探針部分包含靶標探針互補區的第二靶標探針互補子序列。
變體核酸探針也包含第一和第二變體探針寡核苷酸。第一變體探針寡核苷酸包含與變體核酸序列互補的變體探針互補區以及一個或多個不與變體核酸序列互補的變體非互補區。第二變體探針寡核苷酸包含與變體探針互補區的第一變體探針互補子序列互補的變體探針保護區和一個或多個變體非保護區。與探針相似，變體庫包含變體雙鏈探針部分和變體單鏈探針部分，其中變體雙鏈探針部分包含第一變體探針互補子序列和變體探針保護區，其中變體單鏈探針部分包含變體探針互補區的第二變體探針互補子序列。
靶標探針互補區和變體探針互補區共有由非保守序列分隔的至少2個保守序列。非保守序列可以是探針和庫互補區之間的1個核苷酸差異，從而導致各探針分別對靶核酸序列和變體核酸序列的特異性。非保守序列可在一個共有位置上包含單個核苷酸，如在靶核酸序列中的單核苷酸多態性(SNP)的情況中。在靶核酸序列和變體核酸序列在多個共同的位置上相差單個核苷酸的情況中，靶標互補區和變體互補區可共有超過2個保守序列。還應理解靶標互補區和變體互補區不應完全針對靶核酸序列和變體核酸序列上的相同序列區或框架。例如，靶標互補區可針對靶核酸上的序列，其從變體核酸序列5′開始的幾個核苷酸開始，該變體互補區是靶向性的。因此，在靶標互補區和變體互補區中可能存在其他非保守序列，其不位於保守序列之間，而位於靶標和變體互補區的3′或5′端。
在某些實施方式中，第一靶標探針寡核苷酸包含可檢測標籤或與之偶聯的捕獲部分，並且第二靶標探針寡核苷酸包含猝滅劑，其足夠防止可檢測標籤的檢測或捕獲部分的捕獲。
在某些其他實施方式中，組合物還可包含第三靶標探針寡核苷酸，其與第一靶標探針寡核苷酸的靶標探針非互補區雜交，其中第三靶標探針寡核苷酸包含可檢測標籤或與之偶聯的捕獲部分。另外，組合物還可包含第四靶標探針寡核苷酸，其與第二靶標探針寡核苷酸的靶標探針非保護區雜交，其中第四靶標探針寡核苷酸包含猝滅劑，其足夠防止可檢測標籤的檢測或捕獲部分的捕獲。
組合物還包含靶標輔助寡核苷酸和變體輔助寡核苷酸。這些寡核苷酸各自在長度和序列上分別與第二靶標探針寡核苷酸和第二變體探針寡核苷酸相同。因此，第二靶標和變體探針寡核苷酸相對於第一靶標和變體探針寡核苷酸過量存在於組合物中，從而產生與探針和庫複合物分開的第二靶標和變體探針寡核苷酸的濃度，這種過量提供了靶標和變體輔助寡核苷酸。在其他實施方式中，靶標和變體輔助寡核苷酸可在長度和/或序列上與第二靶標和變體探針寡核苷酸稍有不同。
如下文中更詳細所述，靶核酸探針和變體核酸探針可包含不同形態。在一種情況中，靶核酸探針可包含X-探針形態而變體核酸探針也可包含X-探針形態或超特異性的粘性末端形態，與上述實施方式中所述的相似。參考靶核酸探針描述了X-探針形態的說明，但是應理解相同的設計也可應用於變體探針。在X-探針形態中，靶標探針、變體探針、或兩者還可包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中第三寡核苷酸包含第一靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列和第四寡核苷酸特異性子序列，其中第一靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列與第一靶標(或變體)探針寡核苷酸的靶標(或變體)探針非互補區互補，其中第四寡核苷酸包含第二靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列和第三寡核苷酸特異性子序列，其中第二靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列與第二靶標(或變體)探針寡核苷酸的靶標(或變體)探針非保護區互補，其中第二靶標(或變體)探針寡核苷酸的靶標(或變體)探針非保護區不與靶標(或變體)探針保護區重疊，其中第四寡核苷酸特異性子序列與第三寡核苷酸特異性子序列互補，並且其中靶標(或變體)輔助寡核苷酸還包含所述第四寡核苷酸。
在X-探針形態中，第三寡核苷酸的第四寡核苷酸特異性子序列可包含可檢測標籤或與之偶聯的捕獲部分，並且第四寡核苷酸的第三寡核苷酸特異性子序列包含猝滅劑，其足夠防止可檢測標籤的檢測或捕獲部分的捕獲。
在一個實施方式中，靶核酸探針具有靶標反應標準自由能(ΔG°rxn1)，其中變體核酸探針具有變體反應標準自由能(ΔG°rxn2)，並且其中ΔG°rxn1大於ΔG°rxn2+1kcal/mol之和。
在另一個實施方式中，靶核酸探針具有定義為ΔG°rxn1+Rτln([Pt]/[PtCt])的用濃度調整的靶標反應標準自由能，其中變體核酸探針具有定義為ΔG°rxn2+Rτln([Pv]/[PvCv])的變體反應標準自由能，其中R為理想氣體常數，τ是開爾文溫度，Pt是輔助寡核苷酸的初始濃度，PtCt是靶核酸探針的初始濃度，Pv是變體輔助寡核苷酸的初始濃度，PVCV是變體核酸探針的濃度，其中靶核酸探針的用濃度調整的反應標準自由能大於變體核酸探針的用濃度調整的反應標準自由能+1kcal/mol之和。
在另一個實施方式中，靶核酸探針具有靶標反應標準自由能(ΔG°rxn1)，其中變體核酸探針具有變體反應標準自由能(ΔG°rxn2)，並且其中ΔG°rxn1大於ΔG°rxn2，並且ΔG°rxn2大於-7kcal/mol。
在某些實施方式中，變體核酸探針的濃度相對於靶核酸探針的濃度為大於1∶1至約小於100000∶1。在其他實施方式中，變體核酸探針的濃度相對於靶核酸探針的濃度為大於10∶1至小於10000∶1。在其他實施方式中，變體核酸探針的濃度相對於靶核酸探針的濃度為大於100∶1至小於1000∶1。在另一個實施方式中，變體核酸探針的濃度相對於靶核酸探針的濃度為約900∶1。
在某些實施方式中，靶標輔助寡核苷酸的濃度相對於靶核酸探針的濃度為大於1∶1000至小於100000∶1。在其他實施方式中，靶標輔助寡核苷酸的濃度相對於靶核酸探針的濃度為大於1∶100至小於10000∶1。在其他實施方式中，靶標輔助寡核苷酸的濃度相對於靶核酸探針的濃度為大於1∶10至小於1000∶1。
在某些實施方式中，變體輔助寡核苷酸的濃度相對於變體核酸探針的濃度為大於1∶1000至小於100000∶1。在其他實施方式中，變體輔助寡核苷酸的濃度相對於變體核酸探針的濃度為大於1∶100至小於10000∶1。在其他實施方式中，變體輔助寡核苷酸的濃度相對於變體核酸探針的濃度為大於1∶10至小於1000∶1。
在上述或其他適用的實施方式中，靶核酸探針(探針)和變體核酸探針(庫)包含單或雙嵌段，其中嵌段是包含2個或更多通過沃森-克裡克雜交反應形成的寡核苷酸的鏈或複合物。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，分離確定的變體核酸探針和變體核酸序列(變體)之間雜交的平衡產率大於分離確定的靶核酸探針和靶核酸序列(靶標)之間雜交的平衡產率。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針是超特異性探針，微調的超特異性探針，X-探針，Yin-Yang探針，或包含雙嵌段、靶標結合嵌段和輔助嵌段或保護子並在靶標雜交的同時釋放輔助嵌段的任何其他核酸探針。在這種情況中，探針可包括過量的輔助嵌段物質，其與作為組合物部分的輔助嵌段物質(也稱為「靶標輔助寡核苷酸」)分開或額外添加。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針和靶標之間的反應標準自由能ΔG°rxn1在操作溫度和緩衝條件下滿足不等式ΔG°rxn1＞-6kcal/mol且ΔG°rxn1＜+6kcal/mol。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶標輔助寡核苷酸的初始濃度[A]和靶核酸探針的初始濃度[P]滿足不等式[A]/[P]＞0.001且[A]/[P]＜1000。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針和靶標之間的反應標準自由能(ΔG°rxn1)，靶標輔助寡核苷酸的初始濃度[A]，和靶核酸探針的初始濃度[探針]在操作溫度和緩衝條件下滿足不等式ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探針])＞-4kcal/mol且ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探針])＜+3kcal/mol，其中R是理想氣體常數並且τ是開爾文溫度。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針是分子信標，髮夾探針、三莖探針，或任何其他核酸探針分子，其包含單嵌段、靶標結合嵌段，並且不在靶標雜交的同時釋放輔助核酸物質。在該實施方式中，靶核酸探針和靶標之間的反應標準自由能ΔG°rxn1以及靶核酸探針的濃度[探針]在操作溫度和緩衝條件下滿足不等式ΔG°rxn1-Rτln([探針])＞-4kcal/mol且ΔG°rxn1-Rτln([探針])＜+3kcal/mol，其中R是理想氣體常數並且τ是開爾文溫度。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針(庫)是超特異性探針，微調的超特異性探針，X-探針，Yin-Yang探針，或包含雙嵌段、靶標結合嵌段和輔助嵌段並在變體雜交的同時釋放輔助嵌段的任何其他核酸探針。在這種情況中，該組合物可包括過量的輔助嵌段物質，其與作為探針分子部分的輔助嵌段物質(也稱為「變體輔助寡核苷酸」)分開或額外添加。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針和變體之間的反應標準自由能ΔG°rxn2在操作溫度和緩衝條件下滿足不等式ΔG°rxn2＞-11kcal/mol且ΔG°rxn2＜+4kcal/mol。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體輔助寡核苷酸的初始濃度[B]和變體核酸探針的初始濃度[S]滿足不等式[B]/[S]＞0.001且[B]/[S]＜1000。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針和變體之間的反應標準自由能(ΔG°rxn2)，變體輔助寡核苷酸的初始濃度[B]，和變體核酸探針的初始濃度[庫]在操作溫度和緩衝條件下滿足不等式ΔG°rxn2+Rτln([B]/[庫])＞-7kcal/mol且ΔG°rxn2+Rτln([B]/[庫])＜+1kcal/mol，其中R是理想氣體常數並且τ是開爾文溫度。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針是分子信標，髮夾探針、三莖探針，或任何其他核酸探針分子，其包含單嵌段、靶標結合嵌段，並且不在變體雜交的同時釋放輔助(保護)核酸物質。在該實施方式中，變體核酸探針和變體之間的反應標準自由能ΔG°rxn2以及變體核酸探針的濃度[庫]在操作溫度和緩衝條件下滿足不等式ΔG°rxn2-Rτln([庫])＞-7kcal/mol且ΔG°rxn2-Rτln([庫])＜+1kcal/mol，其中R是理想氣體常數並且τ是開爾文溫度。
在一個實施方式中，靶核酸探針以反應標準自由能(ΔG°rxn1)與靶標發生反應，變體核酸探針以反應標準自由能(ΔG°rxn2)與變體發生反應，靶標輔助寡核苷酸的初始濃度[A]，和變體輔助寡核苷酸的初始濃度[B]滿足以下的一個或多個：(ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探針])-(ΔG°rxn2-Rτln([B]/[庫])為+8kcal/mol至0kcal/mol；(ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探針])-ΔG°rxn2+Rτln([庫]))為-8kcal/mol至-1kcal/mol；(ΔG°rxn1-Rτln[探針])-(ΔG°rxn2-Rτln([B]/[庫])為+8kcal/mol至0kcal/mol；或者(ΔG°rxn1-Rτln[探針])-(ΔG°rxn2+Rτln([庫])為+8kcal/mol至0kcal/mol，各自在操作溫度和緩衝條件下評價。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，用至少一個用於檢測、定位或雜交強化的化學部分，如螢光團、半抗原、生物素、疊氮化物、琥珀醯亞胺、或小溝結合劑來官能化第一靶標探針寡核苷酸。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，通過與寡核苷酸的一種或多種雜交相互作用來接合第一靶標探針寡核苷酸，所述寡核苷酸用至少一個用於檢測、定位或雜交強化的化學部分如螢光團、半抗原、生物素、疊氮化物、琥珀醯亞胺、或小溝結合劑官能化。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，用至少一個用於定位或雜交強化的化學部分如半抗原、生物素、疊氮化物、琥珀醯亞胺、小溝結合劑或插入螢光團來官能化第一變體探針寡核苷酸。
還提供可一種在反應中使用任意上述組合物來分離、鑑定、定量或檢測核酸異質混合物中的靶標的方法。在一個實施方式中，該方法包括提供或獲得核酸(樣品)異質混合物，其包含含主要等位基因的物質(變體)和含稀有等位基因的物質(靶標)，使得比對的變體和靶標的子序列相差至少1個核苷酸(多態性核苷酸)。與本文所述的任意組合物實施方式一致的靶核酸探針與樣品混合，其中靶核酸與靶標的雜交比與變體的雜交更有利，並且產生反應產物，其中靶標中的多態性核苷酸是與探針上的相應核苷酸配對的沃森-克裡克鹼基。該方法還包括將變體核酸探針與樣品混合，其與變體的雜交比與靶標的雜交更有利，並且產生產物，其中變體中的多態性核苷酸是與變體核酸探針上的相應核苷酸配對的沃森-克裡克鹼基。在該方法中，混合的變體核酸探針的摩爾量或濃度相對靶核酸探針的濃度過量。另外，該方法還包括以本文所述的相對濃度混合靶標輔助寡核苷酸和變體輔助寡核苷酸，如本文所述的那些。靶核酸探針和變體核酸探針，以及任意輔助寡核苷酸可以單一組合物添加到樣品中。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體樣品濃度除以靶標的樣品濃度的比率為X，其中X是至少20。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，在與競爭性組合物(探針和庫)反應之後，與探針結合的變體的量除以與探針結合的靶標的量不超過(X/10)、(X/30)、(X/100)、(X/300)、或(X/1000)。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物(探針和庫)與樣品之間的反應在充分混合的溶液中等溫且均勻地發生。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物和樣品之間的反應在充分混合的溶液中發生，其具有隨時間變化的溫度概況。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，隨時間變化的溫度概況至不低於70℃的溫度的加熱步驟，之後是不超過65℃的溫度的冷卻步驟。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物和樣品之間的反應在充分混合的溶液中發生，其具有隨時間變化的反應緩衝概況，如通過洗滌步驟。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物和樣品之間的反應在表面上發生，如用於成像的載片或納米顆粒。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，與探針分子雜交的變體和靶分子誘導局部可檢測的螢光、化學發光、或適於成像的金屬沉澱。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，與探針分子雜交的變體和靶分子誘導酶促反應、條件性螢光、或表面定位，以能夠檢測或定量靶標。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，與探針分子雜交的變體和靶分子誘導表面定位或其他分離，以能夠從初始樣品中的變體和其他物質中純化或富集靶標。
在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，出於分子診斷或疾病病原體或生物標記速的表徵，例如針對感染性疾病，或針對遺傳疾病的目的，使用靶標成像、檢測、定量、富集或純化。
附圖的簡要說明
圖1：競爭性組合物發明概述。本發明的核酸探針組合物(也稱為競爭性組合物)2是包含對靶物質T有特異性的靶核酸探針(探針)和對變體物質V有特異性的變體核酸探針(庫)。再次，探針結合靶標比結合變體更有利，並且庫結合變體比結合靶標更有利。使用本發明的核酸組合物來分離、鑑定或檢測核酸樣品1的異質混合物中的靶標。樣品中變體與靶標的初始濃度比率為X。在反應3完成之後，與探針結合的靶標的量(T′探針)和與探針結合的變體的量(V′探針)之比Y將相對於樣品中靶標與探針的初始比率富集。
圖2：競爭性組合物組分的可能形態。競爭性組合物包含靶核酸探針(在下文中一般稱為「探針」)和變體核酸探針(在本文中一般稱為「庫」)。各自可採用先前文獻報導的或待報導的多種不同核酸分子形態之一。該圖顯示探針可採用的形態的部分列表。庫可採用的形態是相似的。重要的是，探針和庫的形態可以不同。探針和庫都可包含單嵌段或雙嵌段，其中嵌段是包含2個或更多個通過沃森-克裡克雜交反應形成的寡核苷酸的鏈或複合物。左圖顯示了靶標與包含靶標結合嵌段(TB-嵌段)的單嵌段探針4之間的反應。右圖顯示了靶標與包含靶標結合嵌段(TB-嵌段)和輔助嵌段(A-嵌段)的雙嵌段探針10之間的反應。放大圖顯示了單嵌段(5-9)和雙嵌段探針(11-15)的示例性結構。鏈之間的黑點表示各嵌段內的鹼基對，而垂直黑線表示嵌段之間以及靶標結合嵌段與結合靶標(T′探針)之間的鹼基對。探針的加粗黑色部分表示核苷酸，取決於在靶標和變體物質之間不同的多態性核苷酸。在各鏈的一端處的半箭頭表示3′端。
圖3：樣品與示例性競爭性組合物16之間的初級反應。在此，各寡核苷酸被分成由數字表示的區。各區包含連續核苷酸鹼基，並且作用是雜交和解離中的功能性單元。4個初級反應是(1)靶標T結合至探針，(2)變體V結合至庫，(3)變體V結合至探針，和(4)靶標T結合至庫。這些反應各自具有表徵其有利性的相應反應標準自由能ΔG°rxn。前兩個反應是將靶標與探針以及變體與庫適當配對的需要反應，而後兩個反應是不需要的。
圖4A：顯示了在第一反應標準自由能值下探針與庫的反應平衡性質。顯示了對探針(假設過量探針)的平衡結合產率對於反應ΔG°rxn的分析依賴性，以及ΔG°rxn1＝-0.5kcal/mol和ΔG°rxn3＝+2.5kcal/mol的產率，對應於3.0kcal/mol的ΔΔG°1。對於這些值，在靶標與探針以及變體與探針之間的結合產率上存在幾乎50倍的差異。
圖4B：顯示了在與圖4A不同的第二反應標準自由能值下探針與庫的反應平衡性質。對庫的平衡結合產率對於反應ΔG°rxn的分析依賴性遵循S型曲線。因為庫的目的是為了消耗變體濃度而對靶標濃度沒有過多影響，對於探針需要不同組的ΔG°rxn。在此，ΔG°rxn2＝-3kcal/mol且ΔG°rxn4＝+1kcal/mol導致變體98％消耗(剩餘2％)和靶標29％消耗(剩餘71％)。這組值將改善富集因數超過30倍(71％/2％)。
圖5：使用X-探針作為探針和粘性探針作為庫的競爭性組合物16的實施方式，其中探針顯示出在與靶標T或變體V雜交之後的條件螢光。實現了條件螢光，因為螢光團(顯示為星)初始緊密靠近猝滅劑(顯示為大點)；在反應時候，猝滅劑遠離並且螢光增加。有三種原因產生觀察的螢光：由於與探針結合的靶標的螢光(fA)，由於與探針結合的變體的螢光(fC)，和由於不完全猝滅的未結合探針的螢光(fB)。
圖6：用於螢光檢測EGFR野生型序列(V)(SEQ ID NO：44)的背景中稀有EGFR L858R(c.2573T＞G)突變(T)(SEQ ID NO：43)的示例性競爭性組合物41(以出現的順序分別是SEQ ID NO：2、45、1、46、47和48)。多態性核苷酸加粗顯示。顯示了單獨變體(1500nM)和含小量靶標(0.5nM)的變體(1500nM)的差異螢光響應。後面的情況對應於變體對靶標X＝3000-倍過量，並且比較fA和fC值表明結合探針的靶標與結合探針的變體相比有2781倍的結合親和性差異(由β計量)。實驗在37℃下在5x PBS緩衝液中使用給定序列的合成寡核苷酸進行。
圖7：用於螢光檢測TP53野生型序列(V)(SEQ ID NO：248)的背景中稀有TP53 R248Q(c.743G＞A)突變(T)(SEQ ID NO：247)的示例性競爭性組合物42(以出現的順序分別是SEQ ID NO：2、249、1、250、251和252)。實驗在37℃下在5x PBS緩衝液中使用給定序列的合成寡核苷酸進行。
圖8：用於螢光檢測NRAS野生型序列(V)(SEQ ID NO：146)的背景中稀有NRAS G12D(c.35G＞A)突變(T)(SEQ ID NO：145)的示例性競爭性組合物43(以出現的順序分別是SEQ ID NO：2、147、1、148、143和144)。實驗在37℃下在5x PBS緩衝液中使用給定序列的合成寡核苷酸進行。
圖9A提供了用於競爭性組合物以測試44種不同的癌症相關單核苷酸多態性的探針和庫的形態。使用的探針序列和靶標/變體序列示於表1-3。
圖9B提供了使用圖9A的競爭性組合物的44種不同癌症相關靶標/變體對的實驗結果的結合親和性倍數變化β的總結。在此，樣品變體/靶標比率為1000∶1。結合親和性倍數變化在200和2420之間變化，中值大約為1000。
圖9C提供了與含有探針和庫的競爭性組合物相比，僅使用沒有庫的競爭性組合物的探針組分對來自相同的44種靶標/變體對的實驗結果的倍數變化β的比較。在此，樣品變體/靶標比率為X＝100，比競爭性組合物低10倍。中值倍數變化β為大約30，這與之前報導的最好設計相一致。因此，競爭性組合物具有大約30-1000的額外因數的改善富集，使得稀有等位基因檢測降低至0.1％加載。這首次報導了在該靈敏度下對稀有等位基因的可靠無酶和均勻檢測。
圖9D提供了在1小時反應時間時的最優ΔG°rxn組合的示例性分布。該圖顯示了由常微分方程給出的圖9A-9C中所述的44種突變的最優ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值，在37℃下ΔΔG°值的範圍是+1.8kcal/mol至+5.9kcal/mol。具有這些值的ΔG°rxn的探針和庫在1小時處顯示出最大特異性。如所示的那樣，最優ΔG°rxn對於不同的ΔΔG°值有顯著偏移。對於我們已經測試的44種SNV/WT對，最優ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值可分別在從-1.6到-0.6kcal/mol和從-6.4到-2.8kcal/mol中變化。
圖10A提供了對人基因組DNA樣品的PCR擴增子的競爭性組合物試驗的實驗工作流程圖。2種從Coriell細胞庫提取的在SMAD7基因座處含有單核苷酸多態性的DNA樣品(NA18537和NA18546)以100∶0、99∶1、90∶10、10∶90、1∶99、和0∶100混合至2ng/μL的總濃度(50μL)，並且通過不對稱非等位基因特異性PCR 49擴增以生成單鏈擴增子50。針對各等位基因設計的競爭性組合物51與檢測52指定PCR產物混合。
圖10B提供了對用於圖10A所示實驗的各SNP的比較性組合物的螢光響應。在各實驗中，0.5nM探針和10nM庫與40μL PCR產物反應。在PCR之前，基因組DNA混合物中的SMAD7-C(顯示為黑色)和SMAD7-T(顯示為灰色)的等位基因頻率顯示在括號中。
圖11：由作為探針的條件性螢光X-探針和作為庫的粘性探針組成的示例性競爭性組合物中存在的附帶物質列表。溶液中的其他物質是由於探針46和庫47的配製，故意導致某些物質過量。本文所示的所有物質被考慮並模擬建模。
圖12A提供了對競爭性組合物與低比例(0.01％)靶標反應的模擬。這些模擬是基於實施例條件螢光系統內容中所述的常微分方程式模型進行的。顯示了取決於ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的變化值，在1小時反應、4小時反應、和48小時反應之後由該低量的靶標引起的結合親和性倍數變化β。更長的反應時間使產生高β的ΔG°rxn值的範圍更寬。
圖12B提供了圖12A中所示的基於1小時反應後的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的β值的三維展示。
圖12C顯示了基於圖12A的模擬，在不同反應時間段後可實現的最大β值。
圖13：含不同探針和庫組分形態的競爭性組合物53，其中生物素官能化的(Bio)髮夾探針用於所述探針並且Yin-Yang探針用於庫。用基於熱動力學適當設計的探針，將通過鏈黴親和素包被的表面54捕獲的靶標T與變體V的分數將在原始樣品上高度富集。由於髮夾探針的單鏈性質，在對最優ΔG°rxn1的評價中存在額外的Rτln([探針])項。鏈之間的黑點表示各嵌段內的鹼基對，而垂直黑線表示嵌段之間以及靶標結合嵌段與結合靶標或變體之間的鹼基對。
圖14：具有未官能化的探針和庫組件的競爭性組合物55。相反，通過與探針的其他區(區56)互補的通用序列的官能化核酸分子57實現富集能力。探針與官能化寡核苷酸之間的間接連接不需要通過僅一個雜交相互作用：例如，探針可與未官能化的鏈部分雜交，其本身與第二官能化的鏈部分雜交。與官能化的基團共定位的產物將同時或依次被捕獲58、成像59、或通過任何其他方法測試，而其餘的分子通常將被洗去60。
圖15：用於等位基因特異性酶促擴增富集的競爭性組合物。靶標和變體物質是基於EGFR L858R(c.2573T＞G)突變61和相應野生型序列62的反義鏈。顯示的ΔG°rxn的值在60℃下在0.18M Na+中計算，與一般PCR退火步驟的環境相一致。探針63是沒有在3′端被非延伸性基團封閉並且能夠用作引物的唯一物質。因此，在結合探針中靶標對變體的富集用於增加由PCR擴增的靶標的比例。圖15以出現的順序分別公開了SEQ ID NO：277-282。
技術實現要素：
在本發明中，提供了新試劑混合物組合物(本文中稱為「競爭性組合物」)。競爭性組合物與含有以下至少2種密切相關的核酸物質的異質樣品混合物反應：含主要等位基因的物質(變體)和含稀有等位基因的物質(靶標)，前者一般對於後者過量(圖1)。變體和靶標分子含有高度相似的子序列，長度為例如5-200個核苷酸，其相差至少1個核苷酸，稱為多態性核苷酸。
競爭性組合物包含靶核酸探針(探針)和變體核酸探針(庫)，後者濃度相對前者過量，庫與變體的反應比與靶標的反應更有利(由於庫對主要等位基因核苷酸的互補性)並且探針與靶標的反應比與變體的反應更有利(由於探針對稀有等位基因核苷酸的互補性)。
數學上，初始樣品中變體對靶標的濃度比率([變體]/[靶標])在此表示為X，並且在反應後結合至探針的變體對靶標的濃度比率表示為Y。通過使用基於本文所述的指南設計的競爭性組合物，Y將遠小於X；我們在44種不同癌症相關突變上的實驗數據顯示約1000的平均富集比率(X/Y)。
本發明的競爭性組合物的富集比率顯著高於僅使用單一探針的現有技術。除了顯示與現有技術相比有利的實驗結果以外，本發明還包括驗證的理論分析和模擬，其解釋了為何本文所述的競爭性組合物在策略上提供優勢。
競爭性組合物的組分
競爭性組合物的組分包含靶核酸探針(探針)、變體核酸探針(庫)、和靶標輔助寡核苷酸以及靶標輔助寡核苷酸。探針和庫都可包含單嵌段或雙嵌段，其中嵌段是包含2個或更多個通過沃森-克裡克雜交反應形成的寡核苷酸的鏈或複合物。單嵌段探針或庫包含靶標結合嵌段，而除了靶標結合嵌段以外，雙嵌段探針或庫還包含輔助嵌段。在靶標或變體雜交的同時，輔助嵌段從靶標結合模塊釋放。這些組分各自是核酸分子並且可採用任意數量的不同形態(圖2)。探針和庫的示例性單嵌段實施方式包括(但不限於)分子信標、髮夾探針和三莖探針。探針和庫的示例性雙嵌段實施方式包括(但不限於)Yin-Yang探針、粘性探針和X-探針。
這些設計各自一般在與其目標靶標的反應有利性上具有一定程度的可調節性(即，靶標針對探針，變體針對庫)。例如，可通過針對Yin-Yang探針、粘性探針X-探針和髮夾探針的單鏈粘性區的長度；粘性探針和X-探針的非同源區的長度調節雜交的標準自由能(ΔG°rxn)。對於單鏈組分(例如，分子信標、髮夾探針、三莖探針)，可通過組分濃度來調節反應有利性。
出於顯示本發明的一個實施方式的目的，將表述包含針對探針的X-探針和針對庫的粘性探針的具體示例性競爭性組合物。應理解，該具體實施方式是為了提供競爭性組合物的示例，並且不意味著將競爭性組合物限制到該實施方式。
如圖3所示，例如，在一個實施方式中，目標核酸探針(探針)是X-探針並且非靶核酸探針(庫)是粘性探針。在此，X-探針(探針)包含以下的4個寡核苷酸或鏈：包含子序列19、18、21和27的第一靶標寡核苷酸；包含子序列17、20和25的第二靶標寡核苷酸；包含子序列23和26的第三寡核苷酸；以及包含子序列22和24的第四寡核苷酸。第三靶標寡核苷酸還可表徵為包含靶序列區，其針對子序列18和19(並且在一些情況中針對20)。還應注意到，並非各寡核苷酸的所有子序列都是合適功能所需的。例如，可去除子序列20-23，或者僅去除子序列20和21，或者另外，可去除子序列22和23。由圖3中的數字表示的各子序列表示功能上作為雜交或解離單元的寡核苷酸的部分。如果各子序列的核苷酸可同時互相形成幾個沃森-克裡克鹼基對，則一個子序列被稱為與另一個子序列互補。在該具體實施例中，設計第一和第二靶標寡核苷酸，使得子序列17部分或完全與子序列18互補，從而形成探針的第一雙鏈區；任選子序列20部分或完全與區21互補，從而形成探針的第二雙鏈區(或簡單延伸第一雙鏈區)；子序列26部分或完全與區27互補，從而形成探針的第三雙鏈區；任選子序列22部分或完全與區23互補，從而形成探針的第四雙鏈區；並且子序列24部分或完全與區25互補，從而形成探針的第五雙鏈區。另外，第一靶標核苷酸包括包含子序列19的單鏈區，該子序列與靶核酸序列互補(如子序列18)。雖然圖3中未顯示，子序列22和23(或在不用子序列22和23設計的探針的情況中任選的子序列26和24)提供了用於可檢測標籤及其猝滅劑偶聯的位點。
當如圖3所示，X-探針在合適溫度和緩衝條件下被導入含有靶標T的樣品中時，第一靶標寡核苷酸的子序列18和19分別與靶標T的子序列33和34雜交。在這種雜交之後，含有第三寡核苷酸的子序列26將仍然與第一靶標寡核苷酸的子序列27雜交(「靶標複合物」)，而第二靶標寡核苷酸和第四寡核苷酸(「保護複合物」)將從靶標複合物上解離。在螢光團F偶聯至子序列23處的第二寡核苷酸末端並且猝滅劑Q偶聯至子序列22處的第四寡核苷酸的情況中，在結合至靶標之後從靶標複合物解離保護複合物將去除猝滅劑Q並且使螢光團F在第三寡核苷酸仍然與第一靶標寡核苷酸的子序列27雜交時發出螢光。
繼續圖3，在一個實施方式中，庫包含粘性或超特異性探針。庫包括包含子序列32、29和30的第一非靶標寡核苷酸和包含子序列28和31的第二非靶標寡核苷酸。如圖3所理解，庫形成從子序列28和29的雜交產生的第一雙鏈區和從子序列31和32的雜交產生的第二雙鏈區。這留下了具有子序列30的單鏈區的第一非靶標寡核苷酸。在接觸包含靶標T和非靶標核酸變體V的樣品之後，子序列29和30將分別雜交至變體V的子序列36和37，從而導致從探針複合物釋放第二非靶標寡核苷酸。如上所述，庫可分別在子序列32和31的末端處包含在第一非靶標寡核苷酸上的標籤和在第二非靶標核苷酸上的猝滅劑。在這種情況中，標籤將在第一非靶標寡核苷酸結合至變體V而含有猝滅劑的第二非靶標寡核苷酸被替換之後變得可檢測到。
雖然圖3中未顯示，組合物可包含靶標輔助寡核苷酸和非靶標輔助寡核苷酸。在某些實施方式中，靶標輔助寡核苷酸包含與探針複合物分離且游離的與第四寡核苷酸雜交的第二靶標寡核苷酸。因此，靶標輔助寡核苷酸或複合物在第一靶標寡核苷酸和第三寡核苷酸中過量，從而產生與第三寡核苷酸複合的游離第一靶標寡核苷酸的初始濃度。類似地，在這種實施方式中，非靶標輔助寡核苷酸包含與庫探針複合物分離且游離的第二非靶標寡核苷酸。換句話說，第二非靶標寡核苷酸將相對第一非靶標寡核苷酸過量。
在另一個實施方式中，競爭性組合物的靶核酸探針將包含粘性探針代替X-探針，並且非靶標核酸探針或庫探針將包含粘性探針或X-探針。在另一個實施方式中，靶核酸探針可包含粘性探針或X探針並且非靶核酸探針或庫探針可包含單一寡核苷酸。在另一個實施方式中，靶核酸探針可包含單一寡核苷酸並且庫探針可包含粘性探針或X-探針。
如下文更詳細說明，基於其序列，靶核酸探針(探針)具有定義為ΔG°rxn1的與靶核酸序列T的靶標反應標準自由能，而探針與變體或非靶核酸鏈V的反應將具有反應標準自由能ΔG°rxn3，其由於錯配鹼基而弱於ΔG°rxn1(正得更多或負得更少)。此外，庫將以相反的方式作用，其中其與靶標的反應標準自由能(ΔG°rxn4)由於靶標T中的錯配鹼基而弱於其與變體的反應標準自由能(ΔG°rxn2)。此外，在某些實施方式中，ΔG°rxn1將弱於ΔG°rxn2(正得更多或負得更少)。更具體地，在某些實施方式中，ΔG°rxn1和ΔG°rxn2之間的關係可定義為，例如，ΔG°rxn1大於ΔG°rxn2+1kcal/mol之和，或者ΔG°rxn1大於ΔG°rxn2，其中ΔG°rxn2大於-7kcal/mol。本文所用的與探針對靶標T或庫對變體V的標準反應自由能結合的術語「大於」表示正得更多或負得更少(例如，-4kcal/mol「大於」-7kcal/mol)。因此，在許多情況中，本發明的組合物包含靶核酸探針，所述靶核酸探針與靶核酸T的相互作用比非靶核酸探針(庫)與非靶核酸變體V的相互作用更不利。在將使用本文所述的競爭性組合物的大多數樣品中，非靶核酸物質或變體V存在於主要等位基因上並且因此將相對稀有等位基因上存在的靶核酸物質T而過量。
在任意上述實施方式中，探針的任一鏈還可包含合成核酸類似物，如LNA、PNA、2′O-甲基取代的RNA、L-DNA、和鏡像寡核苷酸(speigelmer)。另外，探針的任一鏈還可包含合成或天然類似物，如次黃嘌呤、甲基化的核苷酸、異-胞嘧啶和異-鳥嘌呤、鏡像寡核苷酸、和xDNA。
術語「多核苷酸」、「核酸」、「寡核苷酸」、「核酸物質」和「核酸分子」可互換使用。它們是指任何長度的核苷酸聚合形式，不論是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它們的類似物。多核苷酸可以具有任意的三維結構，且可以執行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的編碼或非編碼區域、由連鎖分析定義的基因座、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包括修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，對核苷酸結構的修飾可在聚合物的組裝之前或之後賦予。多核苷酸可進一步被修飾，如通過與標記組分結合。
提供了用於製備X-探針的方法。在一個實施方式中，第三寡核苷酸(A)、第四寡核苷酸(B)、第二靶標(或非靶標)寡核苷酸(P)、和第一靶標(或非靶標)寡核苷酸(C)在水性溶液中混合在一起。在一個實施方式中，第一靶標(或非靶標)寡核苷酸C的濃度相對第三寡核苷酸A過量，第二靶標(或非靶標)寡核苷酸(P)的濃度相對第一靶標(或非靶標)寡核苷酸(C)過量，並且第四寡核苷酸(B)的濃度相對保護鏈過量，使得形成包含複合物BPCA、複合物BPC、複合物BP、和鏈B的探針混合物。在另一個實施方式中，P的濃度相對B過量，C的濃度相對P過量，並且A的濃度相對C過量，使得形成的探針混合物包含複合物BPCA、複合物PCA、複合物CA、和鏈A。
在任意上述實施方式中，探針組分在混合後熱退火。在一個實施方式中，熱退火包括將混合物加熱至不低於65℃的溫度，並且冷卻至不高於45℃的溫度。在另一個實施方式中，熱退火包括將混合物加熱至不低於80℃的溫度，並且冷卻至不高於60℃的溫度。在另一個實施方式中，熱退火包括將混合物加熱至不低於95℃的溫度，並且冷卻至不高於75℃的溫度。
在另一個實施方式中，探針組分通過添加鹽或高鹽溶液而等溫退火。在另一個實施方式中，探針組分通過去除或稀釋甲醯胺或其他變性劑而等溫退火。
本發明的探針可用於多種試驗，包括但不限於以下：通過螢光的特異性DNA或RNA檢測或定量；通過螢光的特異性DNA或RNA成像；通過顯色方法(例如，半抗原化探針，和後續基於抗體補充辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP))的特異性DNA或RNA檢測、定量或成像。
競爭性組合物反應
圖3顯示了分解為多個區域或子序列的靶標T、變體V、探針和庫，由數字表示。各區是多個用作雜交和解離單元的連續核苷酸鹼基。區可部分或完全沃森-克裡克互補至其他區(例如，區17到區18)，並且不同的區可具有互相相同的序列(例如，區34和37)。
本文中假定變體和靶標物質互相僅相差單個多態性核苷酸，如粗黑線段或黑色圓圈所示。在該實施例中，多態性核苷酸在33和36區中。在此，假定區18和29在序列上僅在與多態性核苷酸互補的核苷酸處不同，並且區19和30在序列上相同。實際上，並不需要這樣：例如，多態性核苷酸的互補物可在探針的區2和庫的區30中，即，探針結合靶標/變體的位置不需要與庫結合變體/靶標的位置相同。圖3中變體和靶標上的區35和38是任選的並且可能對於短變體和靶標而言不存在。然而，如果它們存在，則區35和38具體地對於探針的區21和23以及庫的區32而言不是互補的。在2對物質之間出現4個不同初級反應：(1)靶標與探針，(2)變體與庫，(3)變體與探針，和(4)靶標與庫。從富集結合至探針的靶標的分數來看，需要前兩個反應：反應(1)是靶標與探針的適當結合，並且反應(2)降低了可結合至探針的變體的量。相反，不需要另2個反應：反應(3)是變體與探針的不適當結合，並且反應(4)降低了可與探針結合的靶標的量。4個反應的標準自由能分別定義為ΔG°rxn1、ΔG°rxn2、ΔG°rxn3、ΔG°rxn4。
假設，需要ΔG°rxn1和ΔG°rxn2儘可能負(有利)，同時ΔG°rxn3和ΔG°rxn4應儘可能正(不利)。然而，這些值需要耦合：
ΔΔG°1＝ΔG°rxn3-ΔG°rxn1
ΔΔG°2＝ΔG°rxn4-ΔG°rxn2
ΔΔG°1和ΔΔG°2的值進而受到單鹼基錯配的相對熱動力學的影響(一般，ΔΔG°1≠ΔΔG°2)。基於實驗數據和分析，已經確定ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的最優值一定程度上取決於ΔΔG°值。
將不同ΔG°rxn項與其對競爭性組合物性能的影響之間的耦合概念化的一種方式是考慮探針和庫與靶標和變體的各單獨反應的平衡。在這種簡化的標準中，可基於ΔG°rxn的值分析計算各反應產率(定義為在平衡時與探針或庫雜交的靶標或變體的比例)(圖4A和4B)。當變體相對靶標存在大幅過量時，從富集的角度來看需要探針具有較高的特異性而庫具有較高的靈敏度。
設計原理
ΔΔG°1和ΔΔG°2的值分別受到在變體-探針複合物(V′探針)和靶標-庫複合物(T′庫)之間生成的單鹼基錯配泡的影響。這兩項的較大值提供了更大的潛在富集，但是這種潛力只能通過適當設計具有優化的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值的探針和庫來開發。
返回圖3以及圖4A和4B，需要考慮特異性和靈敏度之間的重要權衡。例如，僅富集因數(X/Y)最大化，代替特異性，源自分別為+∞和-∞的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的值；不幸的是，這種競爭性組合物設計將不會產生與探針結合的靶標或變體。這種結果明顯是稀有等位基因檢測、定量、成像和純化方面的應用所不希望的，因為這種競爭性組合物對靶標的靈敏度為零。
為了探索實際設置中的這些權衡，條件性螢光X-探針被認為是用於靶標檢測的模型應用。結合親和性倍數變化β＝(fA·X)/(fB+fC)代表了由於小量靶標引起的可檢測螢光差異。考慮到競爭性組合物中的大量物質和反應參數，分析解決方案和優化不可能產生有助於直觀理解的簡單解決方案。因此，進行對競爭性組合物的常微分方程(ODE)模擬以檢驗由於各種因數的結合親和性倍數變化特徵。這種模擬遵循化學反應的速率方程並且在數字上將反應過程集成在一起。
為了精確性，也考慮探針和庫組分中的建模的偶見(incidental)物質(圖11)。其他研究表明，這些對系統的總體性能的影響非常小。建模的化學反應是：
其中R表示靶標，D表示變體，k+和k-分別表示正向和反向速率常數。圖11中顯示了其他物質的名稱和結構。所有正向反應速率常數k+的值假定為3x105M-1s-1；這是基於之前的研究和我們自己的校準實驗估計的(數據未顯示)。反向反應速率常數k-的值基於反應的ΔG°和k+計算：
對於k1-，使用ΔG°rxn1；對於k2-，使用ΔG°rxn2；對於k3-，使用ΔG°rxn3≡ΔG°rxn1+ΔΔG°1；對於k4-，使用ΔG°rxn4≡ΔG°rxn2+ΔΔG°2；對於k5-，使用ΔG°rxn5≡ΔG°rxn1+ΔG°NH；對於k6-，使用ΔG°rxn6≡ΔG°rxn1+ΔΔG°1+ΔG°NH。ΔG°NH項表示探針的不完整QPC缺失的非同源區，並且具有-8.46kcal/mol的值。對於本文的所有模擬，ΔΔG°1＝+3kcal/mol且ΔΔG°2＝+4kcal/mol。上述反應的ODE模擬有以下速率方程組成：
圖12顯示了競爭性組合物系統的匯總模擬結果。對於這些模擬，物質的初始濃度為[靶標]＝0.15nM，[變體]＝1500nM，[FQPC]＝2.5nM，[QPC]＝1.25nM，[QP]＝3.75nM，[PSCS]＝2250nM，並且[Ps]＝450nM。fB的背景螢光等於來自0.04nM的未猝滅螢光團標記的鏈的螢光，並且與實驗中觀察到的值相一致(圖6-9)。
有產生高結合親和性倍數變化的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的最優值範圍(圖12AB)。當允許較長反應時間時，所需ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值的範圍將稍變寬：例如，在1小時反應後，當ΔG°rxn1為0至-1.5kcal/mol並且ΔG°rxn2為-2.5至-4.5kcal/mol時信號增加是高的。在48小時後，對於ΔG°rxn1，範圍變寬至0至-4.5kcal/mol並且對於ΔG°rxn2，範圍變寬至-2.5至-7kcal/mol。
此外，圖12C顯示可實現的最大信號增加隨反應時間而增加，雖然改善在約4小時後出現邊際效應。在許多應用中，需要快速試驗和反應；因此，在短和長反應時間之間存在權衡。預期一般將是30分鐘至4小時。
在上述模擬中，假定ΔΔG°1和ΔΔG°2是+3和+4kcal/mol。通過我們的模擬和研究過程，已經確定最優ΔG°rxn1和ΔG°rxn2範圍對參數如探針濃度[FQPC]、庫濃度[PsCs]、反應時間、和背景螢光信號水平fB相對不靈敏。然而，它們對化學計量比([QP]/[FQPC])、([Ps]/[PsCs])、和ΔΔG°是靈敏的，這與雙鏈探針的現有技術相一致。
因此，以下範圍的ΔG°rxn值對於該競爭性組合物的實施方式(X-探針作為探針，超特異性探針作為庫)而言是合理的：
-4kcal/mol≤ΔG°rxn1+Rτln([QP]/[FQPC]])≤+3kcal/mol (1)
-7kcal/mol≤ΔG°rxn2+Rτln([PS]/[PSCS])≤+1kcal/mol
其中R是理想氣體常數並且τ是開爾文溫度，並且顯示的濃度是添加樣品之前的初始濃度。可以看出一般在庫對變體的結合比探針對靶標的結合更有利時(ΔG°rxn1＜ΔG°rxn2)觀察到高性能。採用導致輔助物質釋放的其他探針和庫形態的競爭性組合物遵循ΔG°rxn值的相同範圍指南。相反，使用不釋放輔助物質(例如，分子信標、髮夾探針和三莖探針)的探針形態滿足下式：
-4kcal/mol≤ΔG°rxn1-Rτln([探針])≤+3kcal/mol (2)
類似地，使用不釋放輔助物質的庫形態滿足下式：
-7kcal/mol≤ΔG°rxn2-Rτln([庫])≤+1kcal/mol (3)
可基於其序列使用軟體如NUPACK或mFold計算給定探針和庫設計的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的值；這種計算在描述組分探針本身的文獻中有更詳細說明並且被認為是熱力學指導的核酸探針設計領域中普通技術人員可及的。並不推薦同時使用具有不同形態的靶向相同靶標物質的多種探針；不推薦使用具有不同形態的靶向相同變體物質的多種庫。
例如，圖3的靶核酸T和靶核酸探針(探針)之間相互作用的標準反應自由能可表示成：
ΔG°rxn1＝ΔG°34-19-ΔG°22-23-ΔG°20-21-ΔG°ML+(ΔG°33-18-ΔG°17-18)-ΔG°標籤
其中ΔG°34-19是子序列34和子序列19之間雜交的標準自由能，ΔG°22-23是子序列22和子序列23之間雜交的標準自由能，ΔG°20-21是子序列20和子序列21之間雜交的標準自由能，ΔG°ML是在4個寡核苷酸的相交處提供的多環中的雜交標準自由能，ΔG°33-18是子序列33和子序列18之間雜交的標準自由能，ΔG°17-18是子序列17和子序列18之間雜交的標準自由能，並且ΔG°標籤是第三寡核苷酸上的標籤在緊密靠近第四寡核苷酸上的標籤時的熱動力學貢獻(未顯示)對比它們遠離時的熱動力學貢獻之間的標準自由能差。
另外，圖3的非靶核酸V和非靶核酸探針(庫)之間相互作用的標準反應自由能可表示成：
ΔG°rxn2＝ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)
其中ΔG°τ-TC是子序列37和子序列30之間雜交的標準自由能，ΔG°nh-PC是子序列31和子序列32之間雜交的標準自由能，ΔG°v-TC是子序列36和子序列29之間雜交的標準自由能，ΔG°h-PC是子序列28和子序列29之間雜交的標準自由能。
最後，雖然信號增加是用於檢測靶標的條件螢光競爭性組合物的特異性量度，採用競爭性組合物的富集能力的其他應用(如基於原位雜交的成像和基於酶的擴增)可能也面臨特異性和靈敏度之間的權衡，使得對ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的指南可能是一般而言合適的。
競爭性組合物的其他應用
競爭性組合我的另一個示例實施方式包括探針物質與官能化寡聚體(稱為通用官能化鏈)通過對其他結構域的一個或多個雜交相互作用的間接連接(圖14)。與探針反應的靶標和變體分子共定位與通用官能化鏈，其促進了靶標通過表面或納米顆粒捕獲的富集，或者能夠通過直接或下遊螢光，金屬沉澱或化學發光進行檢測/成像。在一些實施方式中，不與探針結合的靶標和變體分子是暗的或在下遊反應之前被洗去。
競爭性組合我的另一個示例實施方式包括使用探針作為酶促擴增的引物(圖15)。靶標可以是含有稀有突變或等位基因的生物序列，並且變體可代表野生型序列。在該實施例中，用防止酶促延伸的化學部分官能化庫的3′端，如雙脫氧核苷酸，3-碳間隔子基團，或小溝結合劑。
設計過程
許多潛在設計過程可用於生成在競爭性組合物中採用的序列。下面提供了一個實施例。
1)從靶核酸選擇靶標和變體作為子序列。靶標和變體必需含有感興趣的多態性核苷酸，否則是相同的。考慮，如靶標和變體二級結構，可用於提供關於靶標和變體序列選擇的信息。
(2)確定操作條件，包括溫度、緩衝液鹽度、擁擠/變性劑、反應時間和讀取機制。
(3)選擇探針和庫的形態。考慮，如組分的成分和複雜性，可用於指導/提供形態選擇信息。
(4)基於靶標和變體序列在所需操作條件下計算或估計ΔG°rxn1和ΔG°rxn2。某些操作條件的DNA-DNA和RNA-RNA錯配泡的熱動力學值是文獻中存在的；對以其他核酸或條件，僅可粗略估計ΔΔG°值。
(5)通過常微分方程模擬來確定ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的最優值，如本文中所述的那樣。將基於ΔΔG°值、預定背景信號、靶標和變體濃度、以及探針和庫濃度來計算許多不同ΔG°rxn值的結合親和性倍數變化(或其他相關量度)。
(6)基於選擇的形態和選擇的ΔG°rxn1值，根據需要用對序列的迭代精細調節來設計靶標-特異性探針。其他考慮，如寡核苷酸長度、採用的官能化等可用於進一步指導並且提供探針序列選擇的信息。
(7)基於選擇的形態和選擇的ΔG°rxn2值，根據需要用對序列的迭代精細調節來設計變體-特異性庫。其他考慮，如寡核苷酸長度、採用的官能化等可用於進一步指導並且提供庫序列選擇的信息。
實施例
條件性螢光競爭性組合物的實驗結果
為了實驗驗證競爭性組合物在結合至探針中在變體上富集靶標的能力，在探針的條件螢光版本上設計並進行實驗(圖5)。探針天然是暗的，直至其與靶標或變體雜交。通過用小量(加載)的靶標觀察對變體樣品的螢光響應，並與沒有靶標的情況下相同量的變體的螢光響應，可推導出由競爭性組合物提供富集。
現在參考圖5，4個主要產物通過圖3所述的反應形成；這些之中，2個涉及探針的參數產生高螢光。由與探針結合的靶標生成的螢光表示為fA，由與探針結合的變體生成的螢光表示為fC，並且由於不完全猝滅、光子檢測器暗電流、比色皿的自螢光和水拉曼光譜的總背景螢光表示為fB。
圖6-8顯示了基於3種不同的癌症相關突變序列的探針、庫、靶標和變體的序列設計，來自COSMIC資料庫。在各自這些中，變體是野生型基因序列，並且靶標是單核苷酸變體；各種情況中，變體濃度是靶標濃度的3000倍(X＝3000)，但0.033％加載的靶標產生與變體相似的額外螢光信號。這表明與探針結合的分子，靶標富集倍數超過1000。
採用的不同量度是「結合親和性倍數變化β」，其定義為(fA·X)/(fB+fC)-結合親和性倍數變化很可能是最可重複且文件的計量，因為背景螢光水平fB可能由於來自不同比色皿的自螢光，或者樣品架的位置差異或其他改變而變化。富集因子(X/Y)的下限可計算為結合親和性倍數變化。
針對X＝1000的競爭性組合物，對44種不同癌症相關突變進行圖6-8的類似實驗，使用圖9A所示的探針和庫形態。下表1-3表示用於這些實驗中的序列，其中：P-第一靶標探針寡核苷酸；C-第二靶標探針寡核苷酸；F-帶標籤的第三靶標探針寡核苷酸；Q-帶猝滅劑的第四靶標探針寡核苷酸；Ps-第一變體探針寡核苷酸；Cs-第二變體探針寡核苷酸；T-靶核酸序列；V-變體核酸物質。應注意到第三和第四靶標探針寡核苷酸是各探針所共同的(各實驗的探針包括P-C-F-Q複合物，僅P-C序列變化)。F和P官能化鏈通過IDT進行合成後HPLC純化；雖有其他鏈安排標準脫鹽且不純化。在官能化序列中，3Rox N/表示由NHS酯化學官能化的3′ROX(羧基-X-若丹明)螢光團的IDT登錄號，並且/5IAbRQ/表示5′Iowa黑紅猝滅劑基團的IDT登錄號。
表1：圖9A-9D的實驗中使用的探針、庫、靶標和變體的序列。
表2：與表1的探針序列聯用的第三寡核苷酸(F)和第四寡核苷酸(Q)所用序列。
表3：SMAD7基因座處的序列非等位基因特異性引物。
結果總結於圖9B。為清楚起見，非線性顯示高於400的β值。可以看到，所有實驗提示超過200的富集因素，中值為1000左右。圖9C顯示了競爭性組合物實驗與僅提供探針而沒有庫的相同的44種不同靶標/變體對在X＝100處的實驗的比較。僅探針實驗的性能是高度變化的，並且中值富集明顯較低，中值為約30，與現有技術的報導相一致。因此，競爭性組合物以同源無酶的方式顯著改善靶標的富集，促進了在稀有等位基因檢測中的應用。
競爭性組合物相比良好的單獨靶標特異性探針改善的主要原因在於競爭性組合物同時捕獲ΔΔG°1和ΔΔG°2的富集能力，而單獨靶標特異性探針僅捕獲ΔΔG°1。
圖10顯示了對人基因組DNA樣品的PCR擴增子進行的競爭性組合物試驗。兩種從Coriell細胞庫提取的在SMAD7基因座處含有單核苷酸多態性的DNA樣品(NA18537和NA18546)以各種比率混合至2ng/μL的總濃度(50μL)，並且通過不對稱非等位基因特異性PCR擴增以生成單鏈擴增子。針對各等位基因而設計的競爭性組合物與指定PCR產物混合用於檢測。可以看到，競爭性組合物能可靠地檢測低至1％的PCR後預期靶標。
因此，本發明非常適於實現上述的以及其中所固有的目的和優點。本領域技術人員可作出許多包括在本發明的所示的精神(部分地由所附權利要求示出)內的改變。
序列表
威廉馬歇萊思大學（WILLIAM MARSH RICE UNIVERSITY）
用於富集含稀有等位基因的物質的核酸分子的競爭性組合物
14-21011-WO (260947.00237)
61/981,588
2014-04-18
282
PatentIn version 3.5
1
28
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
1
gttaaatcgt ggatagtaga cttcgcac 28
2
28
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人工序列說明：合成寡核苷酸
2
gtgcgaacag gtacatttgc tcgtcctt 28
3
19
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3
ccatgctcac agcctcatc 19
4
21
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4
tgtttcctga ggagtctgag g 21
5
41
DNA
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人工序列說明：合成寡核苷酸
5
aaggacgagc aaatgtacct gcactcatcc aaaagaggaa a 41
6
49
DNA
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人工序列說明：合成寡核苷酸
6
gggtcctgtt tcctcttttg gatgagtggt ctactatcca cgatttaac 49
7
22
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7
cgactctcat ccaaaagagg aa 22
8
31
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人工序列說明：合成寡核苷酸
8
gggtcctatt tcctcttttg gatgagagtc g 31
9
40
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人工序列說明：合成寡核苷酸
9
aaggacgagc aaatgtacct gcactcatcc aaaagaggaa 40
10
49
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11
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acacactcat ccaaaagagg aaa 23
12
31
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gggtcctgtt tcctcttttg gatgagtgtg t 31
13
30
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14
30
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15
41
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16
50
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17
26
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18
34
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19
30
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40
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23
21
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23
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24
29
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tcactgtagc tagaccaaaa tcacctgcg 29
25
30
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26
30
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ttcaaaaaga tcaaagtgct gggctccggt 30
27
43
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28
49
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29
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30
29
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30
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34
49
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ggttgtccac gatggccatc acgtagtggt ctactatcca cgatttaac 49
35
23
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agttctacgt gatggccagc gtg 23
36
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36
ggttgtccac gctggccatc acgtagaact 30
37
30
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38
30
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39
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40
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27
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tgttaatagc agctcatcac gcagctc 27
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43
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44
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45
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46
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47
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人工序列說明：合成寡核苷酸
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tgttaatagt caagatcaca gattttgg 28
48
34
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人工序列說明：合成寡核苷酸
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gccagcccaa aatctgtgat cttgactatt aaca 34
49
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tggccaaaca gctgggtgcg gaagagaaag 30
50
30
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tggccaaact gctgggtgcg gaagagaaag 30
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gttaatacca gtggccatca aagtg 25
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人工序列說明：合成寡核苷酸
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40
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
105
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
106
48
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
106
gccaacagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
107
17
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
107
ccgctgtggt agttgga 17
108
24
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
108
caccagctcc aactaccaca gcgc 24
109
24
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
109
cttgtggtag ttggagctgg ttgc 24
110
24
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
110
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
111
40
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
111
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
112
48
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
112
gcaaccagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
113
18
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
113
caggctgtgg tagttgga 18
114
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
114
caccagctcc aactaccaca gcctg 25
115
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
115
cttgtggtag ttggagctgg tgacgtaggc 30
116
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
116
cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc 30
117
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
117
aaggacgagc aaatgtacct gcatgtggta gttggagctg g 41
118
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
118
ctacgtcacc agctccaact accacatggt ctactatcca cgatttaac 49
119
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
119
ttaatatgtg gtagttggag ctggt 25
120
32
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
120
ctacgccacc agctccaact accacatatt aa 32
121
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
121
cttgtggtag ttggagctgg tgtcgtaggc 30
122
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
122
cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc 30
123
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
123
aaggacgagc aaatgtacct gcatgtggta gttggagctg g 41
124
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
124
ctacgacacc agctccaact accacatggt ctactatcca cgatttaac 49
125
22
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
125
aggtgtggta gttggagctg gt 22
126
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
126
ctacgccacc agctccaact accacacct 29
127
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
127
gcaggtcacg aggagtacag tgcaatgagg 30
128
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
128
gcaggtcaag aggagtacag tgcaatgagg 30
129
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
129
aaggacgagc aaatgtacct gcaaggtcac gaggagtaca g 41
130
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
130
tcattgcact gtactcctcg tgaccttggt ctactatcca cgatttaac 49
131
26
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
131
tgttaataag gtcaagagga gtacag 26
132
34
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
132
tcattgcact gtactcctct tgaccttatt aaca 34
133
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
133
acccagaatc agaaggtggg agaactgaag 30
134
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
134
acccagaagc agaaggtggg agaactgaag 30
135
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
135
aaggacgagc aaatgtacct gcaccagaat cagaaggtgg g 41
136
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
136
ttcagttctc ccaccttctg attctggtgg tctactatcc acgatttaac 50
137
21
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
137
aggccagaag cagaaggtgg g 21
138
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
138
tcagttctcc caccttctgc ttctggcct 29
139
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
139
gtggttggag catgtggtgt tgggaaaagc 30
140
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
140
gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30
141
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
141
aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcatgtggtg tt 42
142
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
142
cttttcccaa caccacatgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50
143
21
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
143
aggggttgga gcaggtggtg t 21
144
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
144
ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29
145
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
145
gtggttggag cagatggtgt tgggaaaagc 30
146
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
146
gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30
147
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
147
aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcagatggtg tt 42
148
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
148
cttttcccaa caccatctgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50
149
21
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
149
aggggttgga gcaggtggtg t 21
150
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
150
ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29
151
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
151
tacaaactgg tggtggttgg agcaagtggt 30
152
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
152
tacaaactgg tggtggttgg agcaggtggt 30
153
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
153
aaggacgagc aaatgtacct gctcaaactg gtggtggttg ga 42
154
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
154
cacttgctcc aaccaccacc agtttgaggt ctactatcca cgatttaac 49
155
23
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
155
cgatcaaact ggtggtggtt gga 23
156
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
156
cacctgctcc aaccaccacc agtttgatcg 30
157
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
157
gtggttggag caggtgatgt tgggaaaagc 30
158
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
158
gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30
159
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
159
aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcaggtgatg tt 42
160
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
160
cttttcccaa catcacctgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50
161
21
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
161
aggggttgga gcaggtggtg t 21
162
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
162
ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29
163
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
163
atactggata cagctggaca tgaagagtac 30
164
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
164
atactggata cagctggaca agaagagtac 30
165
40
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
165
aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggac 40
166
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
166
actcttcatg tccagctgta tccagttggt ctactatcca cgatttaac 49
167
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
167
tgttaataac tggatacagc tggac 25
168
34
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
168
actcttcttg tccagctgta tccagttatt aaca 34
169
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
169
atactggata cagctggaaa agaagagtac 30
170
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
170
atactggata cagctggaca agaagagtac 30
171
40
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
171
aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggaa 40
172
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
172
actcttcttt tccagctgta tccagttggt ctactatcca cgatttaac 49
173
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
173
tgttaataac tggatacagc tggac 25
174
34
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
174
actcttcttg tccagctgta tccagttatt aaca 34
175
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
175
ggacatactg gatacagctg gactagaaga 30
176
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
176
ggacatactg gatacagctg gacaagaaga 30
177
40
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
177
aaggacgagc aaatgtacct gcaacatact ggatacagct 40
178
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
178
ttctagtcca gctgtatcca gtatgttggt ctactatcca cgatttaac 49
179
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
179
gttaataaca tactggatac agctg 25
180
33
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
180
ttcttgtcca gctgtatcca gtatgttatt aac 33
181
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
181
atactggata cagctggacg agaagagtac 30
182
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
182
atactggata cagctggaca agaagagtac 30
183
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
183
aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggac g 41
184
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
184
tactcttctc gtccagctgt atccagttgg tctactatcc acgatttaac 50
185
26
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
185
gtgttaataa ctggatacag ctggac 26
186
35
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
186
actcttcttg tccagctgta tccagttatt aacac 35
187
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
187
ctctctaaaa tcactgagca ggagaaagat 30
188
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
188
ctctctgaaa tcactgagca ggagaaagat 30
189
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
189
aaggacgagc aaatgtacct gcactctaaa atcactgagc a 41
190
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
190
tctttctcct gctcagtgat tttagagtgg tctactatcc acgatttaac 50
191
21
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
191
aggctctgaa atcactgagc a 21
192
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
192
ctttctcctg ctcagtgatt tcagagcct 29
193
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
193
agatcctctc tctgaaatca ctaagcagga 30
194
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
194
agatcctctc tctgaaatca ctgagcagga 30
195
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
195
aaggacgagc aaatgtacct gcaatcctct ctctgaaatc ac 42
196
50
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
196
cctgcttagt gatttcagag agaggattgg tctactatcc acgatttaac 50
197
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
197
ttaataatcc tctctctgaa atcac 25
198
32
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
198
ctgctcagtg atttcagaga gaggattatt aa 32
199
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
199
tgatgcactt catggtggct ggacaacaaa 30
200
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
200
tgatgcacat catggtggct ggacaacaaa 30
201
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
201
aaggacgagc aaatgtacct gcaatgcact tcatggtggc t 41
202
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
202
tgttgtccag ccaccatgaa gtgcattggt ctactatcca cgatttaac 49
203
26
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
203
tgttaataat gcacatcatg gtggct 26
204
34
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
204
tgttgtccag ccaccatgat gtgcattatt aaca 34
205
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
205
tgatgcacgt catggtggct ggacaacaaa 30
206
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
206
tgatgcacat catggtggct ggacaacaaa 30
207
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
207
aaggacgagc aaatgtacct gcaatgcacg tcatggtggc t 41
208
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
208
tgttgtccag ccaccatgac gtgcattggt ctactatcca cgatttaac 49
209
27
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
209
gtgttaataa tgcacatcat ggtggct 27
210
35
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
210
tgttgtccag ccaccatgat gtgcattatt aacac 35
211
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
211
atcgactcca ccgaggtcat ctactagccg 30
212
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
212
atcgactcca ccgaggtcat ctaccagccg 30
213
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
213
aaggacgagc aaatgtacct gcacgactcc accgaggtca t 41
214
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
214
gctggtagat gacctcggtg gagtcgtggt ctactatcca cgatttaac 49
215
23
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
215
caccacgact ccaccgaggt cat 23
216
31
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
216
gctggtagat gacctcggtg gagtcgtggt g 31
217
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
217
atcccgggcg actgtggccc cctgctctct 30
218
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
218
atcccgggcg actgtggccc cccgctctct 30
219
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
219
aaggacgagc aaatgtacct gcacccgggc gactgtggcc cc 42
220
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
220
agagcagggg gccacagtcg cccgggtggt ctactatcca cgatttaac 49
221
27
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
221
tgttaatacc cgggcgactg tggcccc 27
222
34
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
222
agagcggggg gccacagtcg cccgggtatt aaca 34
223
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
223
aggacctctt ggacatcgag gatgacatca 30
224
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
224
aggacctctt cgacatcgag gatgacatca 30
225
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
225
aaggacgagc aaatgtacct gcagacctct tggacatcga g 41
226
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
226
atgtcatcct cgatgtccaa gaggtctggt ctactatcca cgatttaac 49
227
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
227
gttaatagac ctcttcgaca tcgag 25
228
33
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
228
atgtcatcct cgatgtcgaa gaggtctatt aac 33
229
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
229
gttgtgaggc actgccccca ccatgagcgc 30
230
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
230
gttgtgaggc gctgccccca ccatgagcgc 30
231
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
231
aaggacgagc aaatgtacct gcatgtgagg cactgccccc ac 42
232
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
232
gctcatggtg ggggcagtgc ctcacatggt ctactatcca cgatttaac 49
233
23
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
233
gtcgaggcgc tgcccccacc atg 23
234
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
234
agcgctcatg gtgggggcag cgcctcgac 29
235
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
235
actttttgac atagtgtggt ggtgccctat 30
236
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
236
acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 30
237
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
237
aaggacgagc aaatgtacct gcatttttga catagtgtgg tg 42
238
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
238
agggcaccac cacactatgt caaaaatggt ctactatcca cgatttaac 49
239
26
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
239
aagacaattt tcgacatagt gtggtg 26
240
33
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
240
agggcaccac cacactatgt cgaaaattgt ctt 33
241
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
241
cgacatagtg tggtggtgcc ctgtgagccg 30
242
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
242
cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg 30
243
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
243
aaggacgagc aaatgtacct gcaacatagt gtggtggtgc cc 42
244
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
244
gctcacaggg caccaccaca ctatgttggt ctactatcca cgatttaac 49
245
26
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
245
tgttaataac atagtgtggt ggtgcc 26
246
34
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
246
gctcataggg caccaccaca ctatgttatt aaca 34
247
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
247
ttcctgcatg ggcggcatga accagaggcc 30
248
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
248
ttcctgcatg ggcggcatga accggaggcc 30
249
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
249
aaggacgagc aaatgtacct gcacctgcat gggcggcatg a 41
250
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
250
cctctggttc atgccgccca tgcaggtggt ctactatcca cgatttaac 49
251
22
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
251
gccctgcatg ggcggcatga ac 22
252
28
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
252
cctccggttc atgccgccca tgcagggc 28
253
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
253
atgaactgga ggcccatcct caccatcatc 30
254
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
254
atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc 30
255
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
255
aaggacgagc aaatgtacct gcagaactgg aggcccatcc t 41
256
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
256
tgatggtgag gatgggcctc cagttctggt ctactatcca cgatttaac 49
257
26
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
257
tgttaataga accggaggcc catcct 26
258
34
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
258
tgatggtgag gatgggcctc cggttctatt aaca 34
259
30
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
259
acggaacagc tttgaggtgt gtgtttgtgc 30
260
30
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
260
acggaacagc tttgaggtgc gtgtttgtgc 30
261
41
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
261
aaggacgagc aaatgtacct gcaggaacag ctttgaggtg t 41
262
49
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
262
acaaacacac acctcaaagc tgttcctggt ctactatcca cgatttaac 49
263
26
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
263
tgttaatagg aacagctttg aggtgc 26
264
34
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
264
acaaacacgc acctcaaagc tgttcctatt aaca 34
265
30
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
265
aggtgcatgt ttgtgcctgt cctgggagag 30
266
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
266
aggtgcgtgt ttgtgcctgt cctgggagag 30
267
41
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
267
aaggacgagc aaatgtacct gcagtgcatg tttgtgcctg t 41
268
49
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
268
ctcccaggac aggcacaaac atgcactggt ctactatcca cgatttaac 49
269
23
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
269
agttgtgcgt gtttgtgcct gtc 23
270
30
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
270
ctcccaggac aggcacaaac acgcacaact 30
271
30
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人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
271
gggagagact ggcgcacaga ggaagagaat 30
272
30
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
272
gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat 30
273
41
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
273
aaggacgagc aaatgtacct gcagagagac tggcgcacag a 41
274
49
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
274
tctcttcctc tgtgcgccag tctctctggt ctactatcca cgatttaac 49
275
25
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
275
gttaatagag agaccggcgc acaga 25
276
33
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
276
tctcttcctc tgtgcgccgg tctctctatt aac 33
277
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
277
gcagtttggc ccgcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cg 42
278
38
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
278
cggtgtcagg catgtcaaga tcacagattt tgggcggg 38
279
29
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
279
aatctgtgat cttgacatgc ctgacaccg 29
280
36
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
280
aagatcacag attttgggct ggccaaactg catctt 36
281
21
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
281
aagatgcagt ttggccagcc c 21
282
42
DNA
人工序列
人工序列說明：合成寡核苷酸
282
gcagtttggc cagcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cg 42