一種甲型h1亞型流感病毒抗體阻斷elisa試劑盒及應用的製作方法

2023-05-28 05:30:11 2

一種甲型h1亞型流感病毒抗體阻斷elisa試劑盒及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種甲型H1亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒，該試劑盒由以下物質組成：a）一種甲型H1亞型流感病毒A-Influ/JML-F9;b）一種特異性強的抗甲型H1亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體；c）抗甲型H1亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體製備成抗體阻斷ELISA核心試劑盒；d）盒體內的樣品稀釋液、10倍洗滌液、底物液A、底物液B、反應終止液，陽性對照樣品和陰性對照樣品。還公開了一種甲型H1亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒在甲型H1亞型流感病毒抗體檢測中的應用。具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短，操作簡單易行，不需由專業人員操作。試劑盒穩定性好、保存期長，解決了甲型H1亞型流感病毒抗體檢測的問題。
【專利說明】—種甲型H1亞型流感病毒抗體阻斷ELISA試劑盒及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物病毒學與免疫學檢測【技術領域】。具體地說，本發明涉及一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒，還涉及一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒在豬群中甲型Hl亞型流感病毒抗體檢測的用途。
【背景技術】
[0002]2009年3月，墨西哥部分地區出現大量的流感樣病例及嚴重呼吸道感染病症，4月15日和4月17日，美國⑶C在兩例病例背景相互獨立的臨床樣品中檢測到了同一種新型的HA亞型流感病毒，即甲型HlNl病毒，隨後證實該病毒即為導致3月份流感樣病例的病原。在隨後的不到6周時間內，疫情在美國、墨西哥、加拿大以外的國家和地區爆發。2009年6月世界衛生組織宣布對甲型(HlNl)流感的警戒級別升至6級，意味著甲型(HlNl)流感的世界性大流行已形成。最近一次流感的世界性大流行起源於墨西哥，一開始被稱為豬流感(Swine flu),隨後根據病毒的分析,改稱為豬源性流感病毒感染(swine origin influenzavirus infection,簡稱S-OIV infection),最後為了與人的季節性流感A (HlNl)區別，改稱新流感A (HlNl)，在我國則稱為甲型HlNl流感。甲型HlNl流感對人及動物的健康造成巨大的影響，而且對經濟造成了巨大的損失。
[0003]1975年,Kohler G和Milstein C在Nature雜誌上發表了細胞融合法建立雜交瘤技術，創建了具有劃時代意義的雜交瘤單克隆抗體技術。經克隆後產生結構和各種特性完全相同的高純度抗體，稱為單克隆抗體(Monoclonal Antibody, McAb),簡稱單抗。單克隆抗體技術的發現和使用，對現代生命科學研究的發展起到了巨大的推動作用，已經成為生物【技術領域】的一個重要方面。迄今，該技術的應用已經廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、治療、預防等方面。
[0004]1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚丙乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,簡稱ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反應板作為固相免疫吸附載體，使ELISA方法得以推廣應用，使得用於抗原定位的酶標記抗體技術發展成為液體標本中微量物質的測定方法，並逐漸成為抗原抗體檢測中最為常用的一種方法。它將酶標記物同抗原抗體複合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合，既保持了酶催化反應的敏感性，又保持了抗原抗體反應的特異性，因而極大的提高了靈敏度。同時它又是一種非均相免疫分析方法，即在反應的每一步都有洗滌過程，從而除去了未反應物和幹擾物質。由於ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測迅速和非放射性以及可以批量測定等諸多優點，使得ELISA方法得到了越來越廣泛的應用。(焦奎等.酶聯免疫分析技術及應用[M].北京:化學工業出版社，2004，84?141 ;李文敏.酶聯免疫吸附反應的技術進展及應用[J].湖北職業技術學院學報，2003，4 (6):65?69)。尤其是阻斷ELISA，在亞型特異性鑑定中具有很大優勢。阻斷ELISA(b-ELISA)基本原理是將病原抗原固定在酶標板中，加待檢血清樣品孵育，隨後加入針對包埋抗原的酶標單克隆抗體，若待檢血清中含有針對包被病原的特異性抗體，則酶標抗體不與或少量的同包埋抗原結合，反之，酶標單抗將與包埋抗原發生結合反應，顯色後，血清中特異性抗體越多OD值越低，反之OD值越高。b-ELISA中，由於包被的抗原純度很高，且單克隆抗體具有很高的抗原識別特異性，因此能解決了間接法中抗原抗體之間的非特異性反應以及交叉反應。由於b-ELISA具有鑑別診斷的優勢，故常被用於不同血清型毒株間的鑑別診斷。
[0005]酶標記抗體技術是ELISA檢測方法的關鍵技術，本發明中所用的酶標記抗體是本實驗室自行生產抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素單克隆抗體，經過辣根過氧化物酶(簡稱HRP)標記，具有很高的酶活性，產量高及成本低。

【發明內容】

[0006]本發明的主要目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短，解決了甲型Hl亞型流感病毒抗體檢測的問題。
[0007]本發明的另一個目的是在於提供了一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒在甲型Hl亞型流感病毒抗體檢測中的應用。操作簡單易行，不需由專業人員操作。本發明的試劑盒穩定性好、保存期長，在4°C條件下放置半年不會影響其敏感性。
[0008]本發明是這樣實現的:
[0009]一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒，該試劑盒由以下物質組成:
[0010]a) —株甲型Hl亞型流感病毒A-1nflu/JML-F9，該毒株於2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO:V201105。(專利受理號:201110036167.X，在中國典型培養物保藏中心購買)；
[0011]b) —種特異性強的抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株於2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO:V201106 (專利受理號:201110036167.X，在中國典型培養物保藏中心購買)；
[0012]c)抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體製備成抗體阻斷ELISA核心試劑盒；
[0013]d)盒體內的樣品稀釋液(請見具體實施例4)、10倍洗滌液(請見具體實施例4)、底物液A (請見具體實施例4)、底物液B (請見具體實施例4)、反應終止液(請見具體實施例4)，陽性對照樣品(甲型Hl亞型流感豬陽性血清)和陰性對照樣品(甲型Hl亞型流感豬陰性血清)組成。
[0014]一種抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體的製備方法，其步驟為:
[0015]A、腹水的製備，取5-6周齡雌性的BABL/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐劑0.5mL/只，5天後腹腔注射IX IO6個雜交瘤細胞/只，9天後收取腹水，血凝抑制(HI)法檢測腹水效價，-70 V保存。
[0016]B、一種抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體的純化。
[0017]C、一種抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體的標記。[0018]D、上述抗體經過純化和標記後可用於製備檢測甲型Hl亞型流感病毒的抗體阻斷ELISA試劑盒。
[0019]一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒在甲型Hl亞型流感病毒抗體檢測中的應用，其檢測步驟是:
[0020](I)包被:以純化抗原最佳包被濃度包被酶標板為100 μ I/孔，37°C孵育Ih後置4°C過夜。
[0021](2)洗板:棄包被液，PBST洗滌液，200 μ I/孔，洗滌3次，每次3min。
[0022](3)封閉:拍幹酶標板，加入封閉液，200 μ I/孔，37°C孵育2h，封閉非特異性結合位點。
[0023](4)洗板:棄封閉液，同步驟(2)。
[0024](5)加待檢樣品:拍幹酶標板,加入待檢樣品，100 μ I/孔，設陰性對照，37°C孵育30mino
[0025](6)洗板:棄待檢樣品液，同步驟(2)。
[0026](7)加酶標抗體:拍幹酶標板後加入HRP標記的抗單克隆抗體，體積比為1:800倍稀釋，100 μ I/ 孔，37°C放置 30min。
[0027](8)洗板:棄酶標抗體，同步驟(2)。
[0028](9)顯色:每孔加入新配的底物A液、底物B液各50 μ 1，室溫避光顯色lOmin。
[0029]( 10)終止反應:每孔加入50 μ I反應終止液終止反應；
[0030](11)測定OD63tl值:酶標儀測定波長為630nm時OD值。
[0031](12)根據PI計算公式算出每孔阻斷率判斷陰陽性，PI (% )=(陰性對照OD值-樣品OD值)/ (陰性對照OD值-陽性對照OD值)X 100%ο
[0032]與現有技術相比本發明具有如下顯著優點:
[0033]1、本發明的試劑盒能直接對甲型Hl亞型流感病毒抗體進行檢測，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短的特點。
[0034]2、本發明的試劑盒適用於對甲型Hl亞型豬流感病毒抗體進行檢測，對經典Hl亞型豬流感病毒抗體不反應，具有特異性。
[0035]3、本發明的試劑盒適用於對甲型Hl亞型流感病毒抗體進行檢測，而對其它病毒，如:將豬瘟、乙腦、豬流感(H1、H3亞型)、口蹄疫、細小、圓環、豬藍耳病不反應，具有很好的特異性。
[0036]4、本發明將所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡單易行，不需由專業人員操作。本發明的試劑盒穩定性好、保存期長，在4°C條件下放置半年不會影響其敏感性。
[0037]5、本發明一次能同時處理多個樣本，非常適合甲型Hl亞型豬流感病毒抗體的臨床大規模檢測。並能夠滿足試驗要求，也可作為科研使用。
[0038]6、目前市場上還沒有檢測甲型Hl亞型豬流感病毒抗體的試劑盒。也無區分甲型Hl亞型豬流感病毒抗體和經典Hl亞型流感病毒抗體的鑑別診斷試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒技術路線示意圖。
[0040]圖2為一種甲型Hl亞型豬流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒的檢測敏感性示意圖。
[0041]圖3為一種甲型Hl亞型豬流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒的檢測特異性示意圖。
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒，該試劑盒由以下物質組成:
[0044]a) —株甲型Hl亞型流感病毒A-1nf lu/JML-F9，該毒株於2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO:V201105。(已申請了專利，專利受理號:201110036167.X，在中國典型培養物保藏中心購買，請見遺傳資源表)
[0045]b) 一種特異性強的抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株於2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO:V201106 (已申請專利，專利受理號:201110036167.X，在中國典型培養物保藏中心購買，請見遺傳資源表)；
[0046]c)抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體製備成抗體阻斷ELISA核心試劑盒；
[0047]d)盒體內的樣品稀釋液、10倍洗滌液、底物液A、底物液B、反應終止液，陽性對照樣品(甲型Hl亞型豬流感陽性血清)和陰性對照樣品(甲型Hl亞型豬流感陰性血清)組成。
[0048]一種甲型Hl亞型流感病毒(保藏編號為CCTCC NO:V201105)的擴增、滅活及純化，
其步驟是:
[0049]1、將保藏編號為CCTCC NO:V201105的甲型Hl亞型流感病毒A-1nflu/JML-F9進行擴增；
[0050](I)嚴格篩選9?10日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅裡亞維通實驗動物技術有限公司，請見遺傳資源表)。
[0051]每批送過來的雞胚要經過嚴格篩選。外檢共4項:白殼、大小、破損及髒胚，內檢共9項:去除沙殼、偏氣室、遊氣室、倒置胚、無精蛋、終止胚、弱胚、汙染胚、裂縫胚。
[0052](2)接種病毒(A-1nflu/JML-F9)於雞胚尿囊腔
[0053]選用9?10日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅裡亞維通實驗動物技術有限公司)，畫出氣室和胚位，在氣室接近胚位處塗抹碘酊和酒精進行消毒，用鋼錐穿一小孔，隨後將ImL注射器針頭沿此小孔插入(避開血管)，接種甲型Hl亞型流感病毒(A-1nflu/JML-F9)。最後用石蠟封口，並置37°C下孵育72h。每天檢查雞胚生長情況，每12h翻卵並檢卵一次。24h內死亡的雞胚，認為是非特異死亡並棄去，72h收取雞胚，4 °C下放置過夜。
[0054](3)含甲型Hl亞型流感病毒(A-1nf lu/JML-F9)尿囊液的收穫
[0055]用75%濃度的酒精消毒雞胚氣室端，用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，在絨毛尿囊膜無大血管處穿破。用無菌移液管吸取雞胚尿囊液置於相應的收集管中。將雞胚收穫液3000r/min離心5min去除血液和細胞。然後進行紅細胞凝集實驗，確定雞胚尿囊液血凝效價。
[0056]2、甲型Hl亞型流感病毒A-1nf lu/JML-F9的滅活
[0057]將含病毒A-1nf lu/JML-F9尿囊液凍融3次後，按終濃度0.8%的甲醛緩慢加入甲醛溶液，充分混合均勻，37°C滅活24小時，每隔6小時振搖I次。每個病毒滅活容器應立即取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗。滅活容器的甲型Hl亞型流感病毒的尿囊液經檢定合格。8000r/min,離心lOmin。棄去沉澱,上清備用。
[0058]3、甲型Hl亞型流感病毒A-1nf lu/JML-F9濃縮及純化
[0059](1)將甲型Hl亞型流感病毒A-1nflu/JML-F9進行濃縮，方法是:將甲型Hl亞型流感病毒雞胚尿囊液於27000r/min，離心2小時，棄去上清，沉澱用磷酸鹽緩衝液(PBS)重懸，充分混勻備用。
[0060](2 )甲型Hl亞型流感病毒A-1nf lu/JML-F9純化
[0061]在超速離心管中依次加入60%、45(%、30(%、20(%濃度蔗糖溶液形成密度梯度。將重懸好的病毒A-1nflu/JML_F9樣品平鋪於最上層，於32000r/min,離心lh。離心後取出45%、30%之間層面樣品，用PBS重懸30%、45%之間層面樣品取出樣品，320001'/11^11，離心lh，取沉澱(即得所述的病毒A-1nflu/JML-F9)進行蛋白質含量測定。以此作為包被抗原。
[0062]一種抗甲型Hl亞型流感血凝素蛋白單克隆抗體的製備方法，其步驟是:
[0063]1、腹水的製備，選用5-6周齡雌性的BABL/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心，請見遺傳資源表)腹腔注射弗氏完全佐劑0.5mL/只，5天後腹腔注射I X IO6個雜交瘤細胞/只，9天後收取腹水，血凝抑制法(HI)檢測腹水效價，-70°C保存。
[0064]2、腹水抗體的純化:辛酸-硫酸銨法
[0065]具體步驟如下:
[0066](1)將上述步驟3製備的腹水1500r/min離心IOmin,用0.45 μ m濾膜過濾,濾液邊攪拌邊加入用4倍體積60mmol/L醋酸緩衝液A(pH=4.5)；
[0067](2)邊攪拌邊逐滴加入正辛酸至終濃度為33μ Ι/mL，室溫條件下攪拌30min，8000r/min離心30min,棄沉澱收集上清；
[0068](3)將步驟(2)的上清液經濾紙過濾一次，濾液pH調製7.4 ；
[0069](4)向步驟(3)所得的濾液邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液％ (硫酸銨體積/總體積<45%)，待濾液程白色渾濁液時，繼續攪拌30min，然後於4°C靜置5h。再於4°C條件12000r/min 下離心 30min ；
[0070](5)棄上清,沉澱用 1Ommol pH=9.0Tris-HCl 重懸；在 100倍體積的 IOmmol pH=9.0的Tris-HCl中，於4°C條件下磁力攪拌透析36h,期間3次(12h/次)更換新鮮Tris-HCl液。透析結束，取上清，用SDS-PAGE電泳的方法鑑定抗體的純度，用紫外分光光度計測定抗體濃度，分裝、凍存。
[0071]上述純化抗體試驗中所用試劑按照以下配方配製:
[0072]A:醋酸緩衝液(60mmol/L):C2H3Na022.463g，用 ddH20 定容至 500mL (ρΗ=4.5)。
[0073]B: (NH4)2SO4 (飽和):每 IOOmL ddH20 中加(NH4)2S0490g，加熱至 80°C溶解，趁熱濾紙過濾，降至室溫既有結晶析出，所得帶有結晶濾液即為飽和硫酸銨溶液。用25%氨水調pH值至7.2，備用。[0074]3、辣根過氧化物酶(HRP)標記單克隆抗體(保藏編號為CCTCC NO:C201106)
[0075](I)取5.0mg的辣根過氧化物酶(HRP ) 5.0mg溶於5mLddH20，溶液呈棕紅色；隨後滴加Na104A(60mmol/L)0.5mL，使溶液呈草綠色，4°C條件放置30min ;滴加乙二醇(160mmol/L) B0.5mL，終止氧化反應，室溫下避光條件放置30min，溶液呈棕黃色；
[0076](2)取本發明製備的單克隆抗體(保藏編號為CCTCCNO:C201106)5mL (lmg/mL)與上述步驟(I)所處理好的液體混合，IOmmol pH=9.5碳酸鹽緩衝液c』 4°C條件下磁力攪拌透析過夜。
[0077](3)向完成透析液體中加新鮮配製的濃度為5mg/mL的NaBH4110.2mL,於4°C下放置2h ;然後等體積加入飽和硫酸銨E,於4°C下靜置30min, 7000r/min離心IOmin,棄去上清。PB溶液(20mmol/LpH=7.4，配製方法如後所述)F3mL重懸，在1000倍體積的PB (20mmol/LpH=7.4)中，4°C條件下磁力攪拌透析，透析36h，期間3次(12h/次)換液。
[0078](4)標記抗體完成透析後，加PB(20mmol/LpH=7.4)、甘油(終濃度30%)定容至5mL，於-20°C保存。
[0079]標記抗體試驗中所用試劑按以下配方配製:
[0080]AiNaIO4 (60mmol/L) =NaIO4L 283g，用 ddH20 定容至 IOOmL;
[0081]B:乙二醇(160mmol/L):乙二醇 13.4μ 1，用 ddH20 稀釋至 1.5mL;
[0082]C:碳酸鹽緩衝液 IOmmol pH=9.5:Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g,用 ddH20 定容至IOOOmL (pH=9.5)；
[0083]D: NaBH4 (5mg/mL) =NaBH40.05g,用 ddH20 定容至 10mL，現配現用；
[0084]E: (NH4)2SO4 (飽和):每 IOOmL ddH20 中加(NH4)2S0490g，加熱至 80°C溶解，趁熱濾紙過濾，降至室溫既有結晶析出，所得帶有結晶濾液即為飽和硫酸銨溶液。用25%氨水調pH值至7.2，備用。
[0085]F:PB (20mmol/L pH=7.4) Na2HPO4.12H20 3.58g, NaH2PO4 1.56g，用 ddH20 定容至IOOOmL (pH=7.4)。
[0086]實施例2
[0087]一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA試劑盒在甲型Hl亞型流感病毒抗體檢測中的應用，其步驟是:
[0088]1、核心試劑配製:
[0089]包被液(25mmol/L碳酸鹽緩衝液)=Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g,用 ddH20 定容至IOOOmL(pH9.6)。
[0090]10 倍洗滌液:NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL,用 ddH20 定容至 IOOOmL (ρΗ=7.4)。
[0091]封閉液:5g脫脂乳溶於IOOmL洗滌液。
[0092]底物液:分為底物液A和底物液B。具體組成如下:
[0093]底物液A:0.006% (體積比)濃度的H2O2緩衝液。
[0094]底物液B:取 Na2HPO4.12H2014.2g，檸檬酸 10.5g,用 ddH20 定容至 500m 配成 0.1mL磷酸鹽檸檬酸緩衝液(pH=5.0)，然後按終濃度為20mg/L添加聯苯二胺(TMB)(使用時將底物液A和底物液B等體積混合，混合後5分鐘內使用，現配現用)。
[0095]反應終止液:0.025% (體積比)氫氟酸(HF) ；HF (40%) 625 μ L，用ddH20定容至1OOmL。
[0096]2、ELISA檢測方法步驟:
[0097](I)包被抗原(保藏編號為CCTCC NO:V201105)最佳包被濃度和辣根過氧化物酶標記抗體最佳稀釋濃度比採用方陣滴定法(李海燕等.禽流感病毒重組核蛋白ELISA診斷技術的研究，2000，22(3):182~185)來確定。包被抗原為滅活甲型Hl亞型流感病毒(A-1nf Iu/JML-F9)尿囊液。試驗結果顯示包被抗原(保藏編號為CCTCC N0:V201105)最佳包被濃度為4.438 μ g/mL，辣根過氧化物酶標記抗體最佳稀釋濃度比為1:800。
[0098](2)酶標反應板的製備:純化抗原(保藏編號為CCTCC NO:V201105)用包被液按照體積比為1:400的比例稀釋，100 μ I/孔加入到酶標板中，37°C放置Ih後置4°C冷庫過夜；甩幹包被液，用洗滌液洗滌I次，每次5min，甩乾洗滌液；加封閉液200 μ I/孔到酶標板中，於37°C封閉2h，甩幹封閉液。於4°C冷藏過夜，自然乾燥。
[0099]3、結果判定值的確定:
[0100]通過對158份已知背景的甲型Hl亞型流感病毒樣品(76份陽性血清樣本、82份陰性血清樣本)進行檢測，得到結果，求其C.0.值為83%，根據批內差，得出本方法灰區為76%-89%，結合其他分析結果，將灰區設定為83%-89%，即待測樣品的阻斷值PI≥89%則判定為陽性，值< 83%則判定為陰性，值在83%-89%之間需要重複檢測。
[0101]4、陰陽性對照樣品的製備:
[0102](I)陽性血清的製備:選用4周齡健康仔豬，免疫前採血用血凝抑制試驗方法檢測陰性後，隔離觀察7日。將甲型Hl亞型流感病毒(血凝價大於27)懸液甲醛滅活後，加入等量的佐劑乳化作為免疫原。通過頸部肌肉注射途徑進行3次免疫，每次劑量分別為2mL、2mL、4mL，免疫間隔時間為21日。末次免疫後7~10日採血並分離血清，進行HI試驗檢測抗體效價。當免疫豬抗體HI效價達到1:320以上時，採取頸部動脈採血方式，無菌採集血液，離心分離血清備用(2~8°C保存，有效期為12個月)。取備用血清經56°C滅活30分鐘後用樣品稀釋液適當稀釋，調整到ELISA方法檢測OD63tlnm值為0.8~1.6之間。按血清量的
0.01 % (體積比)加入硫柳萊,0.45 μ m濾膜過濾除菌。無菌分裝,每管lmL。
[0103](2)陰性血清的製備:選用4周齡健康仔豬，經血凝抑制試驗檢測為甲型Hl亞型流感病毒抗體陰性，隔離觀察7日後，採取頸部動脈採血方式，無菌採集血液，離心並分離血清備用(2l°C保存，有效期為12個月)。取備用血清經56°C滅活30分鐘後用樣品稀釋液適當稀釋，調整到ELISA方法檢測OD63tol值低於0.2。按血清量的0.01% (體積比)加入硫柳萊，0.45 μ m濾膜過濾除菌。無菌分裝,每管lmL。
[0104]5、甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測方法的使用步驟:
[0105](I)包被:以純化抗原最佳包被濃度包被酶標板為100 μ I/孔，37°C孵育Ih後置4°C過夜。
[0106](2)洗板:棄包被液，PBST洗滌液，200 μ I/孔，洗滌3次，每次3min。
[0107](3)封閉:拍幹酶標板，加入封閉液，200 μ I/孔，37°C孵育2h，封閉非特異性結合位點。
[0108](4)洗板:棄封閉液，同步驟(2)。
[0109](5)加待檢樣品:拍幹酶標板,加入待檢樣品，100 μ I/孔，設陰性對照，37°C孵育30mino[0110](6)洗板:棄待檢樣品液，同步驟(2)。
[0111](7)加酶標抗體:拍幹酶標板後加入HRP標記的抗單克隆抗體，體積比為1:800倍稀釋，100 μ I/ 孔，37°C放置 30min。
[0112](8)洗板:棄酶標抗體，同步驟(2)。
[0113](9)顯色:每孔加入新配的底物A液、底物B液各50 μ 1，室溫避光顯色lOmin。
[0114](10)終止反應:每孔加入50 μ I反應終止液終止反應；
[0115](11)測定OD63tl值:酶標儀測定波長為630nm時OD值。
[0116](12)根據PI計算公式算出每孔阻斷率判斷陰陽性，PI (% )=(陰性對照OD值-樣品OD值)/ (陰性對照OD值-陽性對照OD值)X 100%ο
[0117]實施例3
[0118]甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測方法的敏感性試驗和特異性試驗
[0119]1、甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測方法的敏感性試驗
[0120]通過本發明敏感性試驗，已知陽性血清HI效價為1:2560，原濃度十倍稀釋後，連續兩倍比稀釋，結果如下圖，本方法敏感性可達到HI效價為21 (殷震等.動物病毒學(第2版)[M].北京:科學出版社，1997)。結果見附圖2。
[0121]2、甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測方法的特異性試驗
[0122](1)經典豬流感Hl亞型(⑶株)、經典豬流感Hl亞型(TJ株)、豬流感H3亞型、豬瘟、乙腦、口蹄疫、偽狂犬、細小、圓環、藍耳等陽性血清PI值分別為=40.04%,57.78%,82.61%、
8.91%,56.33%、16.73%,8.99%、11.57%,0.52%,51.49% ;均低於臨界值 89%,說明本方法特異性良好。結果見附圖3。
[0123]實施例4
[0124]甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒的組裝
[0125]1、甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒包括:
[0126]I)包被甲型Hl亞型流感病毒(保藏編號為CCTCC NO:V201105)的96孔酶標板
[0127](8 孔 X 12 條 X2 塊)
[0128]2)陰、陽性對照(具體配方詳見:2、相關試劑的配製)
[0129]各 I 管(0.5mL/管)
[0130]3)辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體
[0131]I 瓶(25mL/瓶)
[0132]4) 10倍洗滌液I瓶(50mL/瓶)
[0133]5)底物液A、底物液B各I瓶(12mL/瓶)
[0134]6)反應終止液I瓶(12mL/瓶)
[0135]7)樣品稀釋液I瓶(50mL/瓶)
[0136]2、相關試劑的配製
[0137]包被液(25mmol/L碳酸鹽緩衝液)=Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g，用 ddH20 定容至1000mL(pH9.6)。
[0138]10 倍洗滌液:NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL,用 ddH20 定容至 1000mL (ρΗ=7.4)。
[0139]封閉液:5g脫脂乳溶於IOOmL洗滌液。[0140]底物液:底物液A:0.006%H202緩衝液；底物液B:取Na2HPO4.12H2014.2g，檸檬酸
10.5g,用ddH20定容至500mL，配成0.1mL磷酸鹽檸檬酸緩衝液(pH=5.0)，然後加上聯苯二胺(TMB)。使用時將底物液A和底物液B等體積混合，混合後5分鐘內使用，現配現用。
[0141]反應終止液:0.025% 氫氟酸(HF) ;HF (40%) 625 μ L，用 ddH20 定容至 100mL。
[0142]樣品稀釋液的配製:PBS+TritonX-100+3%BSA
[0143]陽性對照樣品的配製:將製備的陽性血清用樣品稀釋液1:1稀釋後作為陽性對照樣品分裝成0.5mL/管，置4°C下保存。
[0144]陰性對照樣品的配製:將製備的陰性血清用樣品稀釋液1:1稀釋後作為陰性對照樣品分裝成0.5mL/管，置4°C下保存。
[0145]實施例5
[0146]甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒的操作步驟
[0147]I)取酶標板(根據樣品多少可拆開分次使用)，將10倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋後，洗板一次(200 μ I/孔)後拍幹；
[0148]2)加入待檢樣品，100 μ I/孔，設陰性對照，37°C孵育30min ；
[0149]3)棄待檢樣品液，洗滌液200 μ I/孔，洗滌3次，每次3min。
[0150]4)拍幹酶標板後加入HRP標記抗體，1:800倍稀釋，100 μ I/孔，37°C放置30min ；
[0151]5)棄酶標抗體，加入洗滌液，200 μ I/孔，洗滌3次，每次3min ；
[0152]6)每孔加入新配的底物A、B液各50 μ 1，室溫避光顯色IOmin
[0153]7 )終止反應:每孔加入50 μ I反應終止液終止反應；
[0154]8)測定0D630值:酶標儀測定波長為630nm時OD值；
[0155]9)根據PI計算公式算出每孔阻斷率:PI (% )=(陰性對照OD值-樣品OD值)/(陰性對照OD值-陽性對照OD值)X 100%
[0156]10)結果判定:陰、陽性對照的PI值是反應試劑盒質量和試驗操作規範的重要標誌，我們選擇免疫了滅活的甲型Hl亞型流感病毒的豬血清作為陽性對照，SPF空白豬血清作為陰性對照。ELISA試驗成立的條件是陽性對照PI值大於89%，陰性對照PI值小於83%。陽性對照、陰性對照必須控制在這個範圍內，否則檢測結果無效。
[0157]儘管本發明的內容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發明範圍的限制，本發明的範圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的範圍內對本發明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發明的保護範圍內。
【權利要求】
1.一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒，該試劑盒由以下物質組成: a)一種甲型Hl亞型流感病毒A-1nflu/JML-F9; b)一種特異性強的抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體； c)抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體製備成抗體阻斷ELISA核心試劑盒; d)盒體內的樣品稀釋液、10倍洗滌液、底物液A、底物液B、反應終止液，陽性對照樣品和陰性對照樣品； 其中: 所述的試劑組分及其配比如下: (1)樣品稀釋液的配製:PBS+TritonX-100+3%BSA;在121°C高壓蒸汽下滅菌30分鐘後分裝，置4°C貯存； (2)陽性血清的製備:選用4周齡健康仔豬，免疫前採血用血凝抑制試驗方法檢測陰性後，隔離觀察7日，將甲型Hl亞型流感病毒懸液甲醛滅活後，加入等量的佐劑乳化作為免疫原，通過頸部肌肉注射途徑進行3次免疫，每次劑量分別為2mL、2mL、4mL，免疫間隔時間為21日，末次免疫後7~10日採血並分離血清，進行HI試驗檢測抗體效價，免疫豬抗體HI效價達到1:320時，採取頸部動脈採血方式，無菌採集血液，離心分離血清備用，取備用血清經56°C滅活30分鐘後用樣品稀釋液稀釋，調整到ELISA方法檢測OD63tlnm值為0.8~1.6之間，按血清量的0.01%體積比加入硫柳汞，0.45Mm濾膜過濾除菌，無菌分裝，每管ImL ； (3)陰性血清的製備:選用4周齡健康仔豬，經血凝抑制試驗檢測為甲型Hl亞型流感病毒抗體陰性，隔離觀察7日後，採取頸部動脈採血方式，無菌採集血液，離心並分離血清備用，取備用血清經56°C滅活30分鐘後用樣品稀釋液適當稀釋，調整到ELISA方法檢測OD63tol值低於0.2，按血清量的0.01%體積比加入硫柳汞，0.45Mm濾膜過濾除菌，無菌分裝，每管ImL ； (4)底物液A:0.006%H202緩衝液；
(5)底物液B:取 Na2HP04*12H20 14.2 g，檸檬酸 10.5g，用 ddH20 定容至 500mL 成 0.1mL磷酸鹽檸檬酸緩衝液，PH5.0 ;按終濃度為20mg/L添加聯苯二胺； (6)反應終止液:0.025%體積比氫氟酸；HF 625 μ L，用ddH20定容至IOOmL ；
(7)10 倍洗滌液:NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 1000mL，pH7.4。
2.權利要求1所述的一種甲型Hl亞型流感病毒抗體阻斷ELISA檢測試劑盒在甲型Hl亞型流感病毒抗體檢測中的應用，其檢測步驟是: (1)包被:以純化抗原最佳包被濃度包被酶標板為100μ I/孔,37°C孵育Ih後置4°C過夜； (2)洗板:棄包被液，PBST洗滌液，200μ I/孔，洗滌3次，每次3min ； (3)封閉:拍幹酶標板，加入封閉液，200μ1/孔，37°C孵育2h，封閉非特異性結合位點； (4)洗板:棄封閉液，同步驟(2); (5)加待檢樣品:拍幹酶標板，加入待檢樣品，100μ I/孔，設陰性對照，37 °C孵育30min ；(6)洗板:棄待檢樣品液，同步驟(2)； (7)加酶標抗體:拍幹酶標板後加入HRP標記的抗單克隆抗體，體積比為1:800倍稀釋，.100 μ I/孔，37。。放置 30min ； (8)洗板:棄酶標抗體，同步驟(2)； (9)顯色:每孔加入新配的底物液A、底物液B各50μ 1，室溫避光顯色IOmin ； (10)終止反應:每孔加入50μ I反應終止液終止反應； (11)測定OD63tl值:酶標儀測定波長為630nm時OD值； (12)根據PI計算公式算出每孔阻斷率判斷陰陽性，PP/o=陰性對照OD值-樣品OD值/陰性對照OD值-陽性對照O D值X 100%ο
【文檔編號】C07K16/10GK103592436SQ201210290743
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月15日 優先權日:2012年8月15日
【發明者】金梅林, 李淑雲, 王燦, 趙剛, 郭學波 申請人:華中農業大學