基於細胞流式技術的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法

2023-05-28 01:05:41

專利名稱：基於細胞流式技術的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種蘆筍抗病多倍化超雄株的選育方法，尤其是在流式分離分析基礎上的小孢子抗性多倍體的懸浮誘導培養方法。
背景技術：
游離小孢子培養是指以機械等方法分離出處於適宜生育期的植物花粉粒，在液體培養基上進行懸浮培養，進而誘導花粉胚和單倍體植株，最終經人工加倍處理獲得基因型高。C純合的雙單倍體後代(DH群體)的過程。與常規的通過花葯培養獲得雙單倍體的方法相比，游離小孢子培養具備明顯優勢(I)減除了基因型的影響，誘導頻率高。小孢子為單細胞，群體數量大，單次培養的基數可達數十萬個，即使誘導頻率為萬分之一，也能確保再生植株的成功誘導。(2)小孢子為裸露的細胞，消除了藥壁組織的幹擾，所產生的後代植株不會混雜來自藥壁組織細胞誘導的二倍體植株，群體遺傳背景均一。(3)小孢子可塑性強，·易於受培養環境因子的誘導，使之向著育種家期望的方向發育。(4)操作技術相對簡單，分離效率高。目前，該技術已成功應用於油菜、大麥、小黑麥等作物的抗性突變體篩選、自交系的培育、倍性育種、植物基因轉化、分子標記輔助選擇等現代生物技術育種領域。成為提高作物雜種優勢、固定作物雜種優質、培育多倍化純系品種、抗性品種縮短育種周期的有效工具。並即將成為現代生物技術育種體系的核心技術。蘆筍為百合科多年生宿根草本植物，雌雄異株，以嫩莖為產品器官，是深受消費者喜愛的保健蔬菜。自然條件下蘆筍雄株發莖數多，產量比雌株高25%左右，因此全雄育種已成為國內外蘆筍育種研究的熱點。天然的蘆筍雄株的基因型是Mm，雌株的基因型是mm，要獲得後代全雄的Fl雜種種子，只能依靠超雄株MM與雌株_進行雜交，然而由於蘆筍的遺傳基礎過於複雜，通過自交獲得超雄株親本往往需要十幾年甚至更久，因此，在以往的常規育種中要獲得一個優良的全雄雜交種十分困難，這也是蘆筍種子價格昂貴的主要原因。近年來，隨著現代組織培養技術的不斷成熟，中國學者對蘆筍的組織培養技術做了大量而卓有成效的研究，已成功誘導了蘆筍再生植株，並開展了花葯培養、脫毒培養技術基礎上的倍性育種研究。使我國蘆筍的新品種培育水平達到了國際先進水平。然而，由於花葯培養不可消除的培養缺陷，獲得單倍體植株和優良品系的效率並不高。一些早期引入的UC800、UC72、瑪麗華盛頓等多是國外早已淘汰的品種，產量低、抗病性弱、品質差，導且形成經濟產量所需的時間長，一般情況下當年育苗，第2年移栽，第3年才開始採收，與雜交品種當年育苗，當年移栽，第2年即可採收相比，晚了 I年。蘆筍是多年生宿根蔬菜，一次栽培可連續採收15年，因此其品種的優劣將影響蘆筍整個生命周期的產量與品質，並決定其栽培的成敗。自20世紀80年代開始，我國各科研單位相繼開展了蘆筍育種的研究，隨著組織培養等生物技術的發展，我國蘆筍育種研究者利用現代生物技術與常規育種相結合，取得了較大的科研成果和進展，培育出了一些高產、優質、抗病的蘆筍新品種。目前，單株無性系雜交育種是我國蘆筍育種的主要方法即通過引進蘆筍品種資源，根據選育目標，篩選出具有各種優良性狀的雌、雄株作為雜交親本，組配雜交組合，再對Fl進行比較鑑定，篩選出優良的雜交組合，並結合組培快繁技術，擴繁兩個親本的單株無性系，利用雌、雄親本無性系進行規模製種，即可育成符合選育目標的新品種(系)。除此之外，山東、江西等地的研究者還利用秋水仙素處理超雄株獲得四倍體超雄株，再與二倍體雌株雜交的方法培育3倍體全雄株的方法進行了蘆筍多倍體品種選育的研究，並培育了 J2-2，濰紫P-7，井岡紅等3倍體新品種。但上述品種並不具備具備耐鹽、耐旱、耐貧瘠抗病等特性。

發明內容
本發明的目的在於克服上述現有技術的缺點，提供一種以人工游離的小孢子為外植體，以培育抗莖枯、耐鹽多倍體超雄株為目的，綜合運用小孢子培養、抗病耐鹽突變體篩選、人工加倍和流式倍性分析等多種現代生物育種新技術培育蘆筍品種的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來解決的一種基於細胞流式技術的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，按照如下步驟·(I)挑選大田優良雄株，進行室內栽植、鏡檢；(2)機械分離小孢子；(3)對機械分離出的小孢子進行流式分選；(4)對流式分選出的小孢子進行懸浮培養；(5)對步驟(4)培養誘導的花粉胚進行抗性突變體篩選；(6)對步驟(5)獲得的單倍體抗性植株進行人工加倍處理；(7)對步驟(6)獲得的加倍再生植株進行流式分析；(8)將步驟(7)獲得的四倍體超雄系分別進行田間選配雜交組合和離體快速繁殖；(9)將田間選配雜交組合所得三倍體抗性超雄株和離體快速繁殖所得植株進行品比試驗；並將試驗篩選優良株系用於品種申定和大田推廣。所述步驟(I)是挑選大田高產、筍尖大小一致、無病蟲害優良雄株，進行室內栽植、收集未開放小花、鏡檢，選擇形態一致，處於單核期小花。所述步驟(2)是先將小孢子在10°C預處理7d+水解酪蛋白，然後機械勻漿7s、在9600rpm兩次，過濾、200g洗滌，離心收集小孢子。所述步驟(3)是將回收小孢子無菌條件下流式分析，根據前向角散射光，將體積較大的E型花粉壓電分選出來。所述步驟(4)是對流式分選出的小孢子進行懸浮培養，NBP99+10%FIC0IL 25°C,暗培養21-35d。所述步驟(5)是採用MES分化培養基+不同濃度抗性突變體毒素篩選壓力，18°C，120001x,逐步誘導抗性單倍體植株。所述步驟(6)是採用體積百分比濃度O. 08%秋水仙素苗期蘸根人工加倍單倍體植株。所述步驟(7)是應用流式DNA含量分析技術，根據不同倍性植株間細胞核相對螢光強度差異，將加倍後群體中的四倍體植株鑑選出來。所述步驟(8)是將所得四倍體單株進行農藝性狀評價，將抗病優良高產單株與二倍體優良雌株兩兩組合測定配合力。所述步驟(9)將雜交種播種與大田鑑定農藝性狀和品種比較試驗，優良單株用於新品種鑑定和推廣。本發明的有益效果是(1)不同的外植體。以小孢子為外植體具有許多花葯不具備的優勢，效率更高、操作更簡單，國際和國內尚沒有展開過類似的研究和應用。(2)技術綜合性強。綜合了多種現代生物技術育種新技術，育種周期更短，效率更高。(3)品種綜合性強。選育的品種將集多種優良特性於一身，而不是簡單意義上的脫毒快繁。(4)育種技術新。


圖I為本發明的小孢子培養高效誘導蘆筍單倍體的方法流程圖。·
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步詳細描述參見圖1，一種基於細胞流式技術的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，按照如下步驟(I)挑選大田優良雄株(高產、笑尖大小一致、無病蟲害)，進行室內栽植、鏡檢(收集未開放小花、鏡檢，選擇形態一致，處於單核期小花);(2)機械分離小孢子(10°C預處理7d+水解酪蛋白)(機械勻眾7s 9600rpm兩次，過濾、200g洗滌，離心收集小孢子)；(3)對機械分離出的小孢子進行流式分選；所述步驟(3)是將回收小孢子無菌條件下流式分析，根據前向角散射光，將體積較大的E型花粉壓電分選出來。(4)對流式分選出的小孢子進行懸浮培養(NBP99+10%FIC0IL 25 V，暗培養21-35d)；(5)對步驟(4)培養誘導的花粉胚進行抗性突變體篩選；所述步驟(5)是採用MES分化培養基+不同濃度抗性突變體毒素篩選壓力，18°C，120001x，逐步誘導抗性單倍體植株。(6)對步驟(5)獲得的單倍體抗性植株進行人工加倍處理(秋水仙素人工加倍);所述步驟(6)是採用體積百分比濃度O. 08%秋水仙素苗期蘸根人工加倍單倍體植株。(7)對步驟(6)獲得的加倍再生植株進行流式分析；所述步驟(7)是應用流式DNA含量分析技術，根據不同倍性植株間細胞核相對螢光強度差異，將加倍後群體中的四倍體植株鑑選出來。(8)將步驟(7)獲得的四倍體超雄系分別進行田間選配雜交組合和離體快速繁殖；所述步驟(8)是將所得四倍體單株進行農藝性狀評價，將抗病優良高產單株與二倍體優良雌株兩兩組合測定配合力。(9)將田間選配雜交組合所得三倍體抗性超雄株和離體快速繁殖所得植株進行品比試驗；並將試驗篩選優良株系用於品種審定和大田推廣。所述步驟(9)將雜交種播種與大田鑑定農藝性狀和品種比較試驗，優良單株用於新品種鑑定和推廣。A花粉粒的流式分選任何植物的花粉都具有二型性，一些處於花葯內部的花粉粒個體往往較大，而周邊貼近絨氈層的花粉粒較小，這些大小不同的花粉粒在誘導花粉植株的效率上差異很大，對有些植物來說小花粉粒容易，而有的植物正好相反。運用流式分選技術，根據前向角散射光面積的大小，將不同花粉粒分離進行培養將大大提高花粉植株的誘導效率。B花粉粒的機械式分離早期在其他植物的研究中，常用擠壓法分離花粉粒進行培養，然而過大的物理壓力常常早成花粉粒的破裂或受傷，培養反應很差，以機械式並輔以密度梯度離心的方法分離小孢子，不僅分離效率大大提高，對小孢子的損傷也能降低到最小程度，同時可降活細胞和死細胞進行初步的分離，更有助於提高誘導效率。C小孢子培養與抗性突變體篩選小孢子在成熟前花粉外壁沒有形成，也沒有細胞壁的形成，整個小孢子只包被著一層很薄的細胞膜，由於缺少了細胞壁的阻隔，外界的營養因子、激素和脅迫因子很容易作用到花粉粒內部，誘導花粉粒發生變化，使之按照育種人的要求發展。如在培養基中逐步加入不同梯度濃度的鹽，莖枯病菌毒素，使細胞不斷被馴化，最終形成具有抗病和耐鹽的新株系。
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D倍性育種很多二倍體植株經加倍後都會引起器官巨大化，如菠菜、甜菜四倍體品種的產量要遠高於二倍體，三倍體的無籽西瓜產量也常常高於二倍體。天然蘆筍雄株基因型為Mm，進行花粉培養後可得到M或m單倍體，一次加倍後可得到二倍體MM (超雄株)和mm個體，它們與其他品種的麗和mm植株進行互補雜交即可獲得全雄的Fl雜種。當麗和mm植株進行再次加倍後可獲得四倍體MMMM植株和mmmm植株，當MMMM和mm植株雜交時便可獲得三倍體不育超強雄株MMm，由於倍性的增加和生殖生長缺失引起的營養節約將使三倍體全雄蘆筍具備更高的產量和品質，至於更高倍性的雜種是否會進一步提升產量我們還不得而知，但仍值得去探索嘗試。E流式鑑定流式細胞術是上世紀八十年代發展起來的一項細胞粒子高速分析、分選技術，已廣泛用於醫學領域。其原理是不同倍性的細胞具備含有不同大小的核DNA，當這些DNA被DNA特異結合性螢光染料染色之後，在激發光的激發後會產生自發螢光，自發螢光的強弱與螢光染料的多少正相關，也代表著核DNA含量的多少核倍性的大小。當這些被染色的細胞粒子經過一個檢測點的時候，不同大小的細胞就會被識別和分選。其精。C可以達到板半條染色體的差異，當蘆筍再生植株被加倍後，如何快速檢測眾多再生個體的倍性就變得非常緊迫，而流式分析技術為我們提供了非常便捷的方法，它能夠在一個工作日內檢測上百個植株，而如果採用常規細胞壓片染色體記數方法來鑑定，要完成一個材料的鑑定往往需要一到數周。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案範圍內，當可利用上述揭示的方法及技術內容作出些許的更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬於本發明技術方案的範圍內。
權利要求
1.一種基於細胞流式技術的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於，按照如下步驟 (1)挑選大田優良雄株，進行室內栽植、鏡檢； (2)機械分離小孢子； (3)對機械分離出的小孢子進行流式分選； (4)對流式分選出的小孢子進行懸浮培養； (5)對步驟(4)培養誘導的花粉胚進行抗性突變體篩選； (6)對步驟(5)獲得的單倍體抗性植株進行人工加倍處理； (7)對步驟(6)獲得的加倍再生植株進行流式分析； (8)將步驟(7)獲得的四倍體超雄系分別進行田間選配雜交組合和離體快速繁殖； (9)將田間選配雜交組合所得三倍體抗性超雄株和離體快速繁殖所得植株進行品比試驗；並將試驗篩選優良株系用於品種審定和大田推廣。
2.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(I)是挑選大田高產、筍尖大小一致、無病蟲害優良雄株，進行室內栽植、收集未開放小花、鏡檢，選擇形態一致，處於單核期小花。
3.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(2)是先將小孢子在10°C預處理7d+水解酪蛋白，然後機械勻漿7s、在9600rpm兩次，過濾、200g洗滌，離心收集小孢子。
4.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(3)是將回收小孢子無菌條件下流式分析，根據前向角散射光，將體積較大的E型花粉壓電分選出來。
5.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(4)是對流式分選出的小孢子進行懸浮培養，NBP99+10%FIC0IL 25°C，暗培養21_35d。
6.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(5)是採用MES分化培養基+不同濃度抗性突變體毒素篩選壓力，18°C，120001x，逐步誘導抗性單倍體植株。
7.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(6)是採用體積百分比濃度0. 08%秋水仙素苗期蘸根人工加倍單倍體植株。
8.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(7)是應用流式DNA含量分析技術，根據不同倍性植株間細胞核相對螢光強度差異，將加倍後群體中的四倍體植株鑑選出來。
9.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(8)是將 所得四倍體單株進行農藝性狀評價，將抗病優良高產單株與二倍體優良雌株兩兩組合測定配合力。
10.如權利要求I所述的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，其特徵在於所述步驟(9)將雜交種播種與大田鑑定農藝性狀和品種比較試驗，優良單株用於新品種鑑定和推廣。
全文摘要
本發明公開一種基於細胞流式技術上的蘆筍抗性超雄多倍化育種方法，按照如下步驟(1)挑選大田優良雄株，進行室內栽植、鏡檢；(2)機械分離小孢子；(3)進行流式分選；(4)進行懸浮培養；(5)進行抗性突變體篩選；(6)進行人工加倍處理；(7)進行流式分析；(8)將步驟(7)獲得的小孢子分別進行田間選配雜交組合和離體快速繁殖；(9)將田間選配雜交組合所得株體和離體快速繁殖所得株體進行品比試驗；並將試驗所得株體用於大田生產。本發明的有益效果是(1)育種周期更短，效率更高、操作更簡單；(2)品種綜合性強；(3)育種技術新。
文檔編號A01H4/00GK102783416SQ20121025954
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者郭東偉 申請人:陝西天正達生物科技股份有限公司