用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法及其應用的製作方法

2023-05-28 11:57:21 3

專利名稱：：用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於對轉錄本或其片段進行分離的方法及其應用，更確切的說，本發明涉及一種用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法及其在轉錄本鑑定中的應用和在基因表達研究中的應用。
背景技術：
：在生物體中，細胞和組織在不同的發育和分化階段，以及不同的生理和病理狀態下，所表達的基因的種類和豐度都是受到嚴格調控的，闡明這些精細的基因調控機制是功能基因組研究的重要內容。近年來，人們相繼開展了一系列大規模的基因表達檢測技術，例如，大規模EST測序(Okuboetat.1991)、微陣列基因晶片研究(microarray)(Bemmo2008,Sokolovic2008)、以及基因表達的SAGE研究(serialanalysisofgeneexpression)(Takamura2008，Hashimoto2008)。這些方法都能夠定性及定量地對基因的表達產物mRNA進行檢測，並繪製基因表達譜。這些高通量的基因表達譜的研究技術，被廣泛地應用於正常細胞或組織基因的表達研究、疾病相關基因的表達研究、基因功能的研究、藥物作用機制的研究、以及毒理學研究等。在所述基因表達的研究中，為了避免在細胞中大量存在的核糖體RNA的幹擾，特別是18SrRNA和28SrRNA的幹擾，人們利用成熟的mRNA都具有polyA尾的特點，利用體外合成的oligo(dT)寡核苷酸，將帶有polyA尾的mRNA分離出，隨後對分離出的部分進行研究。這種純化方式雖然能夠有效的去除大量存在的核糖體RNA，但同時也去除了其它不含有polyA尾的轉錄本，包括大部分的非編碼RNA。由於技術上的這種制約，人們長久以來對不能夠被通過oligo(dT)寡核苷酸與polyA的結合而分離出的那一部分轉錄本的了解非常少。從基因組水平來看，在組成人類基因組的30億個鹼基對中，只有不足2%的序列用於蛋白質基因的編碼，其餘大部分序列編碼非蛋白質基因(non-codinggene，ncRNA)。雖然近年來tilingarray的研究結果提示細胞中存在大量長的ncRNA轉錄本，但由於研究手段、尤其是ncRNA轉錄本分離技術的制約，目前ncRNA的研究主要集中在小ncRNA(microRNA，siRNA,piRNA)部分，並逐步闡明了內源性小ncRNA(主要是microRNA)的生物合成(biogenesis)、成熟以及功能效應過程相關的蛋白因子和具體的作用機制。研究表明，microRNA的前體pri-miRNA是由RNA聚合酶PolII或PolIII負責轉錄的，前體pri-miRNA在核內經由Drosha/DGCR8複合物剪切，在轉運蛋白Exportin5的協助下轉運至胞漿，隨後在胞漿中被Dicer/TRBP蛋白複合物再次剪切，形成成熟的miRNA分子。成熟的microRNA首先與RISC複合體中的Ago蛋白家族成員結合，介導RISC複合體對靶基因中互補序列的識別，抑制靶基因的表達。miRNA在物種間具有高度的保守性、以及表達組織和時相的特異性，提示它們在生物體的發育過程中具有重要的調節作用。報導的文獻表明，miRNA的表達異常與腫瘤具有相關性(Lum2007;Lee2007;Mott2007;Gaur2007;Mayr2007)，例如在慢性淋巴細胞性白血病(CLL)人中，miR-15a和miR-16-l基因的表達被下調或關閉，miR-15a和miR-16陽l的表達與Bd2的表達呈負相關，這兩個miRNA在轉錄後水平上對Bcl-2的表達起負調節作用。在白血病細胞系中還觀察到，miR-15a和miR-16-l能誘導腫瘤細胞凋亡。另夕卜，在瀰漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、結直腸癌及肺癌中也觀察到miRNA的表達異常。在肺癌中，miRNA基因晶片分析已經鑑定了一些具有統計學意義的表型，能夠從分子水平區分肺癌和良性病變，研究還發現某些miRNA如hsa-mir-155禾Bhsa-let-7a-2與腫瘤預後關係密切(Yanaihara2006)。這些研究表明miRNA在腫瘤發生、發展過程中扮演著重要的角色，提示其它ncRNA，尤其是長的ncRNA在其中也可能具有重要的作用。長ncRNA是指長度大於500個核苷酸、不具有蛋白編碼潛能的內源性轉錄本。根據tilingarray、生物信息學分析和現有實驗研究的結果，人們推測哺乳動物中存在數以萬條的長ncRNA，這部分RNA轉錄本可能通過RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-蛋白等多種相互作用方式，在包括表觀遺傳修飾(如DNA甲基化、組蛋白修飾)、基因轉錄、轉錄後翻譯以及蛋白質功能活性等層面上發揮功能，表明長ncRNA對細胞生命活動中的重要功能發揮重要的調控作用，可能是細胞乃至機體整體生命活動調控網絡的關鍵因素。因此，長ncRNA及其相關蛋白的研究，以及它們之間的相互作用，正在成為生命科學研究領域的一個新的焦點。自上世紀末第一個具有調控功能的長ncRNA—XIST被發現以來，越來越多的長ncRNA得到了鑑定，但相關的生理功能和作用機制的研究還很少(GuttmanM,etal.Nature2009)。通過對腫瘤細胞和正常細胞基因表達譜的分析，人們還發現多種長ncRNA的異常表達與腫瘤的發生相關。例如OCC-l(結腸癌過表達基因-1)RNA在結腸癌細胞中過量表達。而在前列腺腫瘤中，一種名為PCGEM1的長ncRNA的過量表達，導致了腫瘤細胞的增殖和克隆形成。MALAT-lRNA是另一種己知的腫瘤相關長ncRNA，多篇文獻報導了它的高表達與非小細胞性肺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤的惡性化程度密切相關，並且MALAT-1的同源基因在小鼠肝癌細胞中也是高表達的。為了研究不具有polyA尾的轉錄本，尤其是非蛋白編碼基因的轉錄本，研究人員開發出了針對特定的核糖體RNA(例如，18SrRNA和28SrRNA)的核酸探針，利用雜交的方法將相應的核糖體RNA去除，從而達到分離非核糖體RNA轉錄本的目的。雖然雜交的方法能夠從總RNA中部分地去除核糖體RNA，減少了核糖體RNA對基因表達研究的幹擾，但在實際操作中，由於雜交效率的影響導致不能夠完全地將核糖體RNA的去除掉；並且研究數據表明，來源於不同組織或細胞的RNA樣本對雜交效率具有較大的且不可預測的影響，導致核糖體RNA去除效果的重複性較差，因而，雜交方法並不能完全解決核糖體RNA對基因表達研究的幹擾。基於以上原因，為了有效分離核糖體RNA對基因表達研究的幹擾，迫切需要開發出一種能夠將生物體核糖體RNA轉錄本與其它基因的轉錄本進行有效、穩定的分離的新方法。
發明內容本發明的目的在於克服現有對生物體的轉錄本進行分離的方法存在的對核糖體RNA的去除不完全，從而導致殘存的核糖體RNA對基因表達研究產生幹擾的缺點，提供一種能夠有效、穩定地對生物體的轉錄本進行分離以解決核糖體RNA對基因表達研究的幹擾的方法。本發明提供了一種用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法，其中，該方法包括以下步驟(1)將生物體的總RNA進行逆轉錄，得到雙鏈cDNA片段；(2)使用在由該生物體的18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段的序列範圍內沒有切割位點的限制性內切酶或其組合，對步驟(1)中得到的雙鏈cDNA片段進行切割，所述限制性內切酶能夠切割步驟(1)得到的雙鏈cDNA中除去18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40%或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段；(3)將步驟(2)中被切割的片段與未被切割的片段進行分離。本發明還提供了所述用於對生物體的轉錄本進行分離的方法在轉錄本鑑定中的應用。本發明還提供了所述用於對生物體的轉錄本進行分離的方法在基因表達研究中的應用。本發明通過使用特異性的限制性內切酶或其組合，對由生物體的總RNA通過逆轉錄得到的雙鏈cDNA片段進行切割，之後將被切割的片段與未被切割的片段進行分離。由於本發明所使用的限制性內切酶或其組合在由18SrRNA和28SrRNA的逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段的序列範圍內沒有切割位點，因此，本發明提供的方法能夠有效地將由18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段去除，從而特異性地消除18srRNA和28srRNA對基因表達研究的影響。具體實施例方式本發明提供了一種用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法，其中，該方法包括以下步驟(1)將生物體的總RNA進行逆轉錄，得到雙鏈cDNA片段；(2)使用在由該生物體的18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段的序列範圍內沒有切割位點的限制性內切酶或其組合，對步驟(1)中得到的雙鏈cDNA片段進行切割，所述限制性內切酶能夠切割步驟(1)得到的雙鏈cDNA中除去18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40。X或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段；(3)將步驟(2)中被切割的片段與未被切割的片段進行分離。根據本發明，所述限制性內切酶或其組合的選擇可以在很大範圍內改變，可以根據期望研究的轉錄本的範圍對限制性內切酶進行選擇，只要該限制性內切酶在由目標生物體的18srRNA和28srRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段的序列範圍內沒有切割位點，並且該限制性內切酶能夠切割目標生物體中除了由18srRNA和28srRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40%以上的其它種類的雙鏈cDNA片段即可。優選情況下，所述限制性內切酶或其組合能夠切割目標生物體中除了由18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的60%以上的其它種類的雙鏈cDNA片段；進一步優選為，所述限制性內切酶或其組合能夠切割目標生物體中除了由18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的80%以上的其它種類的雙鏈cDNA片段；更優選的情況下，所述限制性內切酶或其組合能夠切割除目標生物體中了由18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的95X以上的其它種類的雙鏈cDNA片段。根據本發明，所述生物體的總RNA可以通過本領域技術人員公知的方法得到，例如，可以根據《分子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著)第7章(關於真核細胞mRNA的提取、純化和分析)記載的方法提取總RNA，還可以使用總RNA提取試劑盒(invitrogen公司，15596026)根據試劑盒的說明書記載的方法提取總RNA，本領域技術人員可以在適當的範圍內對提取總RNA的方法進行各種改進。所述將生物體的總RNA進行逆轉錄的方法為本領域技術人員所公知，例如，可以根據《分子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著)第11章(cDNA文庫的製備及基因鑑定)中記載的內容進行逆轉錄，可以使用逆轉錄試劑盒(promega公司，a3500)並根據試劑盒記載的方法進行逆轉錄，從而得到雙鏈cDNA片段，本領域技術人員可以在適當的範圍內逆轉錄的方法進行各種改進。根據本發明，所述對得到的雙鏈cDNA片段進行切割的方法為本領域技術人員所公知，例如，可以根據所選擇的限制性內切酶的說明書記載的方法和條件進行酶切，本領域技術人員可以在適當的範圍內對酶切的條件進行各種改進。根據本發明，所述將被切割的片段與未被切割片段進行分離的方法可以為各種能夠將被切割的片段與未被切割的片段進行分離的方法，例如該方法可以包括將能與由步驟(2)中的切割所產生的粘性末端特異結合的、且與可篩選標記物偶連的連接適配子，與步驟(2)中的切割所產生的粘性末端進行連接，從而對被切割的cDNA片段進行標記；將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離。根據本發明，所述連接適配子的種類可以在很大範圍內改變，只要選擇的連接適配子能夠與切割所產生的粘性末端進行特異性的連接即可。根據本發明，所述的連接適配子可以是指一段雙鏈的核酸片段，該雙鏈核酸片段具有至少一個粘性末端，可與切割所產生的粘性末端進行特異性的連接。將所述粘性末端與具有可篩選標記的連接適配子進行連接的方法和條件為本領域技術人員所公知，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著)記載的方法進行連接。根據本發明，所述可篩選標記可以為生物素、地高辛或特異性核酸序列。根據本發明的一個方面，所述可篩選標記為生物素，將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離的方法包括利用生物素與親和素或鏈親和素之間特異性的相互作用，將與可分離載體偶連的親和素或鏈親和素以及與生物素偶連的連接適配子相連接的cDNA片段共同孵育，從而通過可分離載體將與生物素偶連的連接適配子相連接的被切割的cDNA片段分離。所述生物素標記是指將生物素共價結合到適配子上，通過生物素偶連的適配子與被切割cDNA片段之間的連接，對能夠被所述限制型內切酶切割的cDNA片段進行生物素標記；利用生物素與親和素或鏈親和素之間的特異性相互作用，用與可分離載體相偶連的鏈親和素對目標轉錄本進行選擇性分離。所述生物素(biotin)又稱維生素H，分子量為244.31，存在於蛋黃中。所述親和素(Avidin)又稱卵白蛋白或抗生物素，是指一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，在pH9-13緩衝液中性質均穩定，耐熱並耐多種蛋白水解酶的作用。天然親合素為鹼性蛋白，由4個相同的亞單位構成4聚體；每個親合素亞單位通過其結構中的色氨酸殘基與生物素中的Ureido環結合。因此，1個親合素分子存在4個與生物素分子結合位點。所述鏈親和素(Streptavidin)是指與親合素有類似生物學特性的一種蛋白質。是由Streptomycesavidin菌在培養過程中分泌的一種蛋白質產物，鏈親和素也可通過基因工程手段生產。分子量為65000，由4條序列相同的肽鏈構成，每條鏈親和素肽鏈可以結合l個生物素分子。因此與親和素一樣，每個鏈親和素分子也具有4個可與生物素分子結合位點。根據本發明的另一個方面，所述可篩選標記物為地高辛，將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離的方法包括將與可分離載體偶連的抗地高辛抗體和與地高辛偶連的連接適配子相連接的cDNA片段進行共同孵育，從而通過可分離載體將與地高辛偶連的連接適配子相連接的被切割的cDNA片段分離。所述地高辛標記是指將地高辛分子共價結合到適配子上，通過地高辛偶連的適配子與被切割cDNA片段之間的連接，對能夠被所述限制型內切酶切割的cDNA片段進行地高辛標記；利用抗地高辛抗體與地高辛之間的特異性作用，用與可分離載體偶連的抗地高辛抗體對目標轉錄本進行選擇性分離。根據本發明的另一個方面，所述可篩選標記物為特異性核酸序列，將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離的方法包括將與可分離載體偶連的且能夠與所述特異性核酸序列雜交的核酸序列和與特異性核酸序列偶連的連接適配子相連接的cDNA片段進行共同孵育，從而通過可分離載體將與特異性核酸序列偶連的連接適配子相連接的被切割的cDNA片段分離。所述特異性核酸序列標記是指在連接適配子中包括一段特異性的核酸序列，通過連接適配子與被切割cDNA片段之間的連接，對能夠被所述限制型內切酶切割的cDNA片段進行標記；利用與可分離載體偶連的且能與連接適配子偶連的特異性核酸序列形成雜交的核酸序列，對目標轉錄本進行分離。根據本發明，所述的可分離載體的種類為本領域技術人員所公知，例如可以為瓊脂糖凝膠珠和/或磁珠。根據本發明，所述生物體的種類沒有特別的限制，例如，所述生物體可以為動物、植物、微生物以及昆蟲，進一步優選為動物。適於本發明的動物可以為哺乳動物和非哺哺乳動物，例如，所述哺乳動物可以為伴侶動物(寵物)包括貓和狗等；農場動物包括牛、馬、綿陽、豬和山羊等；實驗室動物，包括大鼠、小鼠、兔子、和非人靈長類動物(如猴子、猩猩等)；動物園動物；以及人類。例如，所述非哺乳動物可以為鳥、魚、爬行動物、兩犧動物、以及昆蟲等。優選情況下，所述生物體為人類、猴、小鼠、大鼠或果蠅。根據本發明的一個方面，所述生物體為人類。對由人類的總RNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段進行切割的限制性內切酶或其組合的種類沒有特別的限制，只要能夠切割除了由人類18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40%或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段即可，優選情況下，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil和Xhol。進一步優選為，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil和Xhol。一方面，更優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、Bcll、BspHI、Mfel和PaeR71。另一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。最優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、Agel、ApaLI、Bcll、BspHI、Fsel、Mfel和PaeR71。根據本發明的另一個方面，所述生物體為猴。對由猴的總RNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段進行切割的限制性內切酶或其組合的種類沒有特別的限制，只要能夠切割除了由猴18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40。％或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段即可，優選情況下，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil和Xhol。進一步優選為，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil和Xhol。一方面，更優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、Bcll、BspHI、Mfel和PaeR71。另一方面，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil和Xhol。最優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、Agel、ApaLI、Bcll、BspHI、Fsel、Mfel禾卩PaeR71。根據本發明的另一個方面，所述生物體為小鼠。對由小鼠的總RNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段進行切割的限制性內切酶或其組合的種類沒有特別的限制，只要能夠切割除了由小鼠18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40%或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段即可，優選情況下，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。進一步優選為，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、Bcll、BspHI、Mfel和PaeR71。另一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc65I、AclI、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil禾DXhol。最優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、Agel、ApaLI、Bcll、BspHI、Fsel、Mfel和PaeR71。根據本發明的另一個方面，所述生物體為大鼠，對由大鼠的總RNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段進行切割的限制性內切酶或其組合的種類沒有特別的限制，只要能夠切割除了由大鼠18SrRNA和28SrRNA的逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40X或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段即可，優選情況下，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。進一步優選為，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、Bcll、BspHI、Mfel和PaeR71。另一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc65I、AclI、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、Tlil禾卩Xhol。最優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、Agel、ApaLI、Bcll、BspHI、Fsel、Mfel和PaeR71。根據本發明的另一個方面，所述生物體為果蠅。對由果蠅的總RNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段進行切割的限制性內切酶或其組合的種類沒有特別的限制，只要能夠切割除了由果蠅18SrRNA和28SrRNA的逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40X或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段即可，優選情況下，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Apal、ApaLI、Ascl、AvrII、BamHI、BbvCI、BsiWI、BspHI、Eagl、Fsel、Kasl、Kpnl、Mlul、Narl、NgoMIV、Notl、Pacl、PaeR71、PspOMI、PspXI、Pstl、Sacl、Sall、Sbfl、SgrAI、Sphl、Tlil禾口Xhol。進一步優選為，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Apal、ApaLI、Ascl、AwII、BamHI、BbvCI、BsiWI、BspHI、Eagl、Fsel、Kasl、Kpnl、Mlul、Narl、NgoMIV、Notl、Pacl、PaeR71、PspOMI、PspXI、Pstl、Sacl、Sall、Sbfl、SgrAI、Sphl、THI和Xhol。一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、BamHI、BspHI、Notl和PaeR71。另一方面，更優選的情況下，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc651、Apal、ApaLI、Ascl、AvrII、BamHI、BbvCI、BsiWI、BspHI、Eagl、Fsel、Kasl、Kpnl、Mlul、Narl、NgoMIV、Notl、Pacl、PaeR71、PspOMI、PspXI、Pstl、Sacl、Sall、Sbfl、SgrAI、Sphl、TliI和XhoI。最優選的情況下，所述的限制性內切酶組合為Acc651、Apal、ApaLI、BamHI、BspHI、Mlul、Notl和PaeR71。本發明還提供了所述用於對生物體的轉錄本進行分離的方法在轉錄本鑑定中的應用。本發明還提供了所述用於對生物體的轉錄本進行分離的方法在基因表達研究中的應用。下面通過實施例對本發明進行更加詳細的說明。實施例1-351、實驗用品的去RNase處理步驟塑料製品的處理1)在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%;2)將要處理的塑料製品放入DEPC水溶液，使其全部浸泡到溶液中；3)在通風櫃中室溫靜置過夜；4)小心倒出DEPC水溶液，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料製品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。5)烘箱用合適的溫度烘拷至乾燥。置於乾淨處備用。璃玻和金屬物品的處理250°C下烘烤3小時以上。2、細胞的培養實施例1-35中所使用的細胞系如下表所示。tableseeoriginaldocumentpage19實施例12FRhK-4(猴胚腎細胞株)實施例30S2(果蠅細胞系)實施例13FRhK-4(猴胚腎細胞株)實施例31S2(果蠅細胞系)實施例14FRhK-4(猴胚腎細胞株)實施例32S2(果蠅細胞系)實施例153T3(小鼠胚胎成纖維細胞)實施例33S2(果蠅細胞系)實施例163T3(小鼠胚胎成纖維細胞)實施例34S2(果蠅細胞系)實施例173T3(小鼠胚胎成纖維細胞)實施例35S2(果蠅細胞系)實施例183T3(小鼠胚胎成纖維細胞)HEKM!3(人胚胎腎細胞系)的培養條件培養基GIBCODMEM培養基，10%胎牛血清，2mML-穀氨醯胺，100units/ml親黴素和100^ig/ml四環素(LifeTechnologies,Gibco)。將細胞以每孔口105個細胞的密度接種於24孔板中，培養24小時後收穫細胞提取總RNA。FRhK-4(猴胚腎細胞株)的培養條件培養基GIBCODMEM培養基，10%胎牛血清，2mML-穀氨醯胺，100units/ml親黴素和100ng/ml四環素(LifeTechnologies,Gibco)。將細胞以每孔lx105個細胞的密度接種於24孔板中，培養24小時後收穫細胞提取總RNA。3T3(小鼠胚胎成纖維細胞)的培養條件培養基GIBCODMEM培養基，10%胎牛血清，2mML-穀氨醯胺，100units/ml親黴素和100|ig/ml四環素(LifeTechnologies,Gibco)。將細胞以每孔lx105個細胞的密度接種於24孔板中，培養24小時後收穫細胞提取總RNA。GH1(大鼠細胞系)的培養條件培養基ATCCF-12K培養基，2.5%月臺牛血清，15%馬血清，2mML-穀氨醯胺，100units/ml親黴素和100嗎/ml四環素(LifeTechnologies,Gibco)。將細胞以每孔lx105個細胞的密度接種於24孔板中，培養24小時後收穫細胞提取總RNA。S2細胞系(果蠅)的培養條件Schneider培養基，10%胎牛血清，在28。C無C02培養箱中，根據其生長狀態，按一定比例每3天傳代1次。3、細胞總RNA提取Note:Trizol試齊!j，Promega公司。1)去除細胞的培養基，用PBS洗滌兩次；2)每孔加入lmLTrizol，室溫放置5min，使其充分裂解；3)12，000rpm離心5min，棄沉澱；4)按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻後室溫放置15min;5)4。C12,000g離心15min;6)吸取上層水相，至另一離心管中；7)按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置10min;8)4°C12,000g離心10min，棄上清，RNA沉於管底；9)按lml75。/。乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉澱；10)4°C8,000g離心5min，儘量棄上清；11)室溫晾乾或真空乾燥10min;12)測O.D值，得到RNA的濃度。4、雙鏈cDNA合成注RibocloneM-MLV(H-)cDNA合成系統，Promega公司。1)取一滅菌的無RNA酶的Eppendorf管,加入20嗎的細胞總RNA樣本和10嗎隨機引物，加入用H2O調整體積至15pl，70。C處理5min，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，依次加入5x第一鏈緩衝液5^1rRNasinRNA酶抑制劑25UM-MLV(H-)反轉錄酶200U加水至終體積25^12)37。C溫浴l小時，取出置於冰上；3)取第一鏈反應液2(Hil,再依次加入以下成份並混勻10x第二鏈緩衝液20)ilDNA聚合酶I23|iRNaseH0.8|i加水至終體積100pl4)14。C溫浴2小時，70°C溫浴10分鐘，低速離心後置冰上；5)加入2pLT4DNA聚合酶，37。C溫浴10分鐘；6)加入10nL200mmol/LEDTA終止反應；7)用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應液，離心2分鐘；8)將水相移至另一個Eppendorf管中，加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉，pH5.2)，混勻後再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20。C)，-20°(^放置30分鐘後離心5分鐘；9)小心丟去上清液,加入0.5mL冰冷的70%乙醇，離心2分鐘；10)小心移去上清液，乾燥沉澱；11)將沉澱溶於10-20iiLTE緩衝液中。5、cDNA片段的限制性內切酶切割及適配子連接實施例1-35中所用的限制性內切酶如下表1所示。表ltableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23tableseeoriginaldocumentpage241)取20pL溶於TE溶液中的雙鏈DNA，依次加入以下成份並混勻，15。C孵育過夜；接頭-D(20uM)8pLT4連接酶緩衝液8pLT4連接酶8nL加水至終體積80pL接頭匿D5-p-CTGACTGGAAGCTGACTCAG5畫p-GACTGACCTTCGACTGAGTC陽氨基-52)用PCR產物純化試劑盒(Promega)純化連接產物；3)取5pL連接產物，依次加入以下成份並混勻，37。C孵育150min;10xNEB緩衝液45限制性內切酶(10u/uL)1pL加水至終體積50pL4)用PCR產物純化試劑盒(Promega)純化連接產物；5)取5pL連接產物，依次加入以下成份並混勻，15。C孵育過夜；接頭-U(20pM)1.5|iL連接緩衝液2.5|iLT4DNA連接酶2加水至終體積206.目標轉錄本的分離和純化鏈親和素瓊脂糖凝膠珠購自Roche公司。1)取一個滅菌的Eppendorf管，加入25pL鏈親和素瓊脂糖凝膠珠，用2xB&W緩衝液洗滌2次；2)將25鏈親和素瓊脂糖凝膠珠與2.5tRNA(2嗎/VL)混合，冰浴20min，間或振蕩混勻；3)600g離心30sec，棄上清；4)加入40(iL洗脫緩衝液l，600g離心30sec，棄上清，重複洗滌2次；5)將鏈親和素瓊脂糖凝膠珠重懸於50^iL2xB&W緩衝液中；6)加入20nL生物素標記的cDNA連接產物和30水，使總體積至100pL;7)室溫孵育3小時，間或振蕩混勻；8)600g離心30sec，棄上清；9)用lxB&W緩衝液洗滌鏈親和素瓊脂糖凝膠珠2次後，再用蒸餾水洗滌1次，540g離心20sec，棄上清；10)將鏈親和素瓊脂糖凝膠珠重懸於25pL蒸餾水中；11)取2pL重懸後的鏈親和素瓊脂糖凝膠珠，依次加入以下成份，進行聚合酶鏈式反應，10xLA-taq酶緩衝液10uldNTP8ul引物F2ul引物R2ulLA-Taq酶0.8ul加水至終體積100ul弓I物陽F5畫AAACAGGAGATCTACAAGGACAT弓I物陽R5隱CTGAGTCAGCTTCCAGTCAG反應條件94。C/3min，30x(94。C/30sec，56。C/30sec，72。C/150sec)，72oC/10min。12)利用PCR產物純化試劑盒對擴增產物進行純化。7、目標轉錄本的克隆和鑑定1)設立如下連接反應體系，將純化的擴增產物與T載體進行連接，15。C孵育過夜；T載體2.5|iL(200ng)cDNA片段3(400ng)連接酶緩衝液1pLT4連接酶1加水至終體積10pL2)將連接產物轉化至大腸桿菌細菌，挑選100個單克隆並測序分析，結果如下從獲得的片段的序列分析中發現，這些基因片段按照與蛋白編碼基因和基因組序列的匹配情況，分成以下四種類型(a)與蛋白編碼基因的外顯子顯著匹配；(b)與蛋白編碼基因的內含子顯著匹配；(c)與已知蛋白編碼基因不匹配，但與基因組序列顯著匹配，存在於已知蛋白編碼基因的間區，這部分序列認為來源於非蛋白編碼RNA轉錄本;(d)與基因組序列不存在顯著匹配。結果顯示，未得到來源於18s和28srRNA的cDNA，說明本發明能夠有效消除18s和28srRNA對其它RNA轉錄本研究的影響。實施例36-70對實施例1-35中所使用的限制性內切酶或其組合對除18s和28srRNA以外的其它轉錄本的切割程度進行檢測。1、使用Invitrogen公司的RiboMinusTM轉錄本分離試劑盒，從得到的細胞總RNA中去除18s和28srRNA轉錄本，具體步驟如下1)取40jag總RNA，分別加入4個滅菌的1.5mLEppendorf管中，每管10pg總RNA;2)向每管中加入8^RiboMinusProbe(100pmol/pl)和雜交緩衝液300pl，70-75。C孵育5min;3)將樣本放置到37。C水浴中，使其在30min內緩慢降溫至37。C;4)充分振蕩RiboMinus磁珠，使其完全重懸；5)取500nl重懸後的RiboMinus磁珠，加入到一個無RNase的1.5ml離心管中，將離心管放置磁性分離架中，使磁珠富集到管底，棄上清；6)加入500^1滅菌的無RNase的水，振蕩使磁珠重懸，將離心管放置磁性分離架中，使磁珠富集到管底，棄上清；重複洗滌4-5次；7)加入500pl雜交緩衝液，再次洗滌磁珠；將磁珠重懸到200雜交緩衝液中，並使其保持在37°C條件下；8)將步驟3)中的樣本加入到步驟7)中的含有磁珠的雜交緩衝液中，充分振蕩混勻；9)37。C孵育15min，間或輕輕混合，孵育結束後短暫離心，將反應物收集到管底；10)將離心管放置到磁性分離架中，使磁珠與上清分離。磁珠上富集了核糖體RNA轉錄本，上清中含有非rRNA的其它目標轉錄本；11)將上清轉移至一個新的無RNase的2ml離心管中，加入以下成份，糖原(20嗎/nl)1^醋酸鈉(3M)1/10的樣品體積100%乙醇2.5X樣品體積12)混勻後-80。C放置30min，4。C條件下12,000g離心15分鐘，棄上清；13)加入500^170%冰冷的乙醇洗滌，4。C條件下12,000g離心5分鐘，棄上清；14)重複洗滌6-8次；15)空氣乾燥RNA沉澱5min,然後使其融解於10-30pl無RNase的水中，保存在-80。C條件下。2、將步驟1中得到的已去除18s和28srRNA的RNA轉錄本，使用Promega公司的RibocloneM-MLV(H-)cDNA合成系統進行雙鏈cDNA合成，具體步驟如下1)取一滅菌的無RNA酶的Eppendorf管，力卩入20jig的細胞總RNA樣本和10昭隨機引物，加入用H20調整體積至15pi,70°C處理5min，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，依次加入5x第一鏈緩衝液5^1rRNasinRNA酶抑制劑25UM-MLV(H-)反轉錄酶200U加水至終體積25^12)37。C溫浴1小時，取出置於冰上；3)取第一鏈反應液20^1，再依次加入以下成份並混勻10x第二鏈緩衝液20filDNA聚合酶I23|iRNaseH0.8^1加水至終體積lOOpl4)14。C溫浴2小時，70°C溫浴10分鐘，低速離心後置冰上；5)加入2)iLT4DNA聚合酶，37。C溫浴10分鐘；6)加入10|iL200mmol/LEDTA終止反應；7)用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應液，離心2分鐘；8)將水相移至另一個Eppendorf管中，加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉，pH5.2),混勻後再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20。C)，-20。C放置30分鐘後離心5分鐘；9)小心丟去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，離心2分鐘；10)小心移去上清液，乾燥沉澱；11)將沉澱溶於10-20pLTE緩衝液中。3、使用表1中所示的限制性內切酶對步驟2得到的cDNA片段進行切割，並加入與限制性內切酶對應的適配子，使被切割的cDNA片段與相應的連接適配子進行連接，具體步驟參見實施例1-35中的相應部分。4、通過Qubit(Invitrogen公司)核酸定量儀，檢測步驟3產物的量(A1)，具體操作步驟見Irwitrogen公司網頁的產品手冊。5、將與適配子結合的cDNA片段分離出，具體步驟參見實施例1-35中的相應部分。6、通過Qubit(Invitrogen公司)核酸定量儀，檢測除去與適配子結合的cDNA片段後的剩餘cDNA的量(A2)，具體操作步驟見Invitrogen公司網頁的產品手冊。7、根據公式(Al-A2)/Alxl00X，計算所述限制性內切酶對除去18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的其它種類的雙鏈cDNA片段的切割程度，結果如下表3所示。表3tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31從上表3可以看出，本發明的方法能夠分離到除了18S和28S以外的總量的40%以上的其它種類的轉錄本，並且本發明能夠有效消除18S和28SrRNA對基因表達研究的影響。權利要求1、一種用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)將生物體的總RNA進行逆轉錄，得到雙鏈cDNA片段；(2)使用在由該生物體的18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段的序列範圍內沒有切割位點的限制性內切酶或其組合，對步驟(1)中得到的雙鏈cDNA片段進行切割，所述限制性內切酶能夠切割步驟(1)得到的雙鏈cDNA中除去18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段以外的總量的40％或以上的其它種類的雙鏈cDNA片段；(3)將步驟(2)中被切割的片段與未被切割的片段進行分離。2、根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物體為人類或猴，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。3、根據權利要求2所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。4、根據權利要求3所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、Bcll、BspHI、Mfel和PaeR71。5、根據權利要求3所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Mlul、Nhel、PaeR71、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。6、根據權利要求5所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合為Acc651、Agel、ApaLI、Bcll、BspHI、Fsel、Mfel和PaeR71。7、根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物體為小鼠或大鼠，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。8、根據權利要求7所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。9、根據權利要求8所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、Bcll、BspHI、Mfel禾卩PaeR71。10、根據權利要求8所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc651、Acll、Agel、ApaLI、AsiSI、Bcll、Bmtl、BspDI、BspHI、Clal、Fsel、Kpnl、Mfel、Nhel、PaeR71、Pcil、PspXI、Sall、Sbfl、TliI和XhoI。11、根據權利要求10所述的方法，其中，所述的限制性內切酶組合為Acc651、Agel、ApaLI、Bcll、BspHI、Fsel、Mfel和PaeR71。12、根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物體為果蠅，所述限制性內切酶或其組合包括以下限制性內切酶中的至少一種Acc651、Apal、ApaLI、Ascl、AvrII、BamHI、BbvCI、BsiWI、BspHI、Eagl、Fsel、Kasl、Kpnl、Mlul、Narl、NgoMIV、Notl、Pacl、PaeR71、PspOMI、PspXI、Pstl、Sacl、Sall、Sbfl、SgrAI、Sphl、TliI和XhoI。13、根據權利要求12所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少六種Acc651、Apal、ApaLI、Ascl、AvrII、BamHI、BbvCI、BsiWI、BspHI、Eagl、Fsel、Kasl、Kpnl、Mlul、Narl、NgoMIV、Notl、Pacl、PaeR71、PspOMI、PspXI、Pstl、Sacl、Sall、Sbfl、SgrAI、Sphl、Tlil和Xhol。14、根據權利要求13所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合為Acc651、ApaLI、BamHI、BspHI、Notl和PaeR71。15、根據權利要求13所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合包括以下限制性內切酶中的至少八種Acc651、Apal、ApaLI、Ascl、AvrII、BamHI、BbvCI、BsiWI、BspHI、Eagl、Fsel、Kasl、Kpnl、Mlul、Narl、NgoMIV、Notl、Pacl、PaeR71、PspOMI、PspXI、Pstl、Sacl、Sall、Sbfl、SgrAI、Sphl、Tlil和Xhol。16、根據權利要求15所述的方法，其中，所述限制性內切酶組合為Acc651、Apal、ApaLI、BamHI、BspHI、Mlul、Notl和PaeR71。17、根據權利要求1所述的方法，其中，所述將步驟(2)中被切割的片段與未被切割的片段進行分離的方法包括將能與由步驟(2)中的切割所產生的粘性末端特異結合的、且與可篩選標記物偶連的連接適配子，與步驟(2)中的切割所產生的粘性末端進行連接，從而對被切割的cDNA片段進行標記；將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離。18、根據權利要求17所述的方法，其中，與所述連接適配子偶連的可篩選標記物為生物素、地高辛或特異性核酸序列。19、根據權利要求18所述的方法，其中，與所述連接適配子偶連的可篩選標記物為生物素，將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的cDNA片段進行分離的方法包括利用生物素與親和素或鏈親和素之間特異性的相互作用，將與可分離載體偶連的親和素或鏈親和素以及與生物素偶連的連接適配子相連接的cDNA片段共同孵育，從而通過可分離載體將與生物素偶連的連接適配子相連接的被切割的cDNA片段分離。20、根據權利要求18所述的方法，其中，與所述連接適配子偶連的可篩選標記物為地高辛，將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離的方法包括將與可分離載體偶連的抗地高辛抗體和與地高辛偶連的連接適配子相連接的cDNA片段進行共同孵育，從而通過可分離載體將與地高辛偶連的連接適配子相連接的被切割的cDNA片段分離。21、根據權利要求18所述的方法，其中，與所述連接適配子偶連的可篩選標記物為特異性核酸序列，將被標記的被切割的cDNA片段與未被標記的未被切割的雙鏈cDNA片段進行分離的方法包括將與可分離載體偶連的且能夠與所述特異性核酸序列雜交的核酸序列和與特異性核酸序列偶連的連接適配子相連接的cDNA片段進行共同孵育，從而通過可分離載體將與特異性核酸序列偶連的連接適配子相連接的被切割的cDNA片段分離。22、根據權利要求19-21中的任意一項所述的方法，其中，所述可分離載體為瓊脂糖凝膠珠和/或磁珠。23、權利要求1-22中的任意一項所述的方法在轉錄本鑑定中的應用。24、權利要求1-22中的任意一項所述的方法在基因表達研究中的應用。全文摘要本發明提供了一種用於對生物體的轉錄本或其片段進行分離的方法。本發明還提供了所述方法在轉錄本鑑定中的應用和在基因表達研究中的應用。本發明提供的方法能夠有效地將由18SrRNA和28SrRNA逆轉錄而得到的雙鏈cDNA片段與其它cDNA片段進行分離，從而消除18srRNA和28srRNA轉錄本對基因表達研究的影響。文檔編號C12Q1/68GK101575598SQ20091008663公開日2009年11月11日申請日期2009年6月16日優先權日2009年6月16日發明者權杜,梁子才申請人:北京大學