一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法

2023-05-28 15:46:36

一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法
【專利摘要】本發明公開一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法。該方法的步驟為：製備濃度為2×102～2×105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，再將蛭弧菌稀釋液與穀氨酸鈉和蔗糖的混合溶液按體積比1:1混合，得到蛭弧菌製劑；將蛭弧菌製劑與預處理過的含橈足類的水樣進行混合。本發明提供的方法簡單易行，適於工業化大批量生產，其中所含有的穀氨酸鈉和蔗糖，對水體及橈足類本身無毒副作用，並不會引起水體的汙染和橈足類等有益水生浮遊生物的死亡。通過本發明的方法可有效控制橈足類攜帶的總菌，在24h內即可控制總菌數在103cfu/mL以內，並在較長時間內減緩其再生。
【專利說明】一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於蛭弧菌【技術領域】，特別涉及一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法。

【背景技術】
[0002]橈足類(Cop印oda)，隸屬於節肢動物門、甲殼綱、橈足亞綱。為小型甲殼動物，體長< 3mm，營浮遊與寄生生活，分布於海洋、淡水或半鹹水中。橈足類活動迅速、世代周期相對較長，同樣與其一樣作為水產養殖中應用的餌料的還有橈足類和枝角類。橈足類作為水生有益浮遊生物具有十分重要的意義。其不但是各種經濟魚類，如鱅、鯡、鮐和各種幼魚、鬚鯨類的重要餌料，還可以作為漁場的標誌，有些魚類專門捕食橈足類，所以橈足類的分布和魚群的洄遊路線密切相關。有些橈足類的產量很大，如挪威沿海水域直接捕撈飛馬哲水蚤可以作為人類、家畜和家禽的食料，具有很高的營養價值。同時其還可以作為水體汙染的指示生物。但是，橈足類的體長較大，形態結構較為完整，是許多種類細菌的中間宿主。如果橈足類自身攜帶過多細菌，那麼將對橈足類自身的生存及在水產養殖中的應用造成巨大影響及危害。總細菌數目過多，潛在的致病菌存在的可能性也就更大，其中可能存在的致病菌的種類和數目也會增加，會給對用其作為餌食的水產生物幼體造成病害。養殖戶在水產生物育苗的過程中，會對引入的橈足類等餌料進行簡單的過濾，或對其施用消毒劑以達到消毒的目的，這不但影響了橈足類的活性、可能還會引入新的細菌，更有可能在一定程度上殺死橈足類等浮遊生物，同時破壞了養殖的水生生態環境，對水產生物的育苗產生不利影響。
[0003]因此，在使用橈足類作為優質餌料對水產生物育苗時，都應當對於其中攜帶的全部細菌引起重視。國內的許多研究都致力於將蛭弧菌製劑應用於控制病原菌，利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，將蛭弧菌製劑施用於水體當中，可有效控制水體中的總細菌數目，從而降低其對於水產生物造成侵害的可能，從源頭上控制水產生物病害的發生。目前將蛭弧菌製劑應用於控制水生浮遊生物橈足類所攜帶的的總菌尚無報導。為了有效保障養殖水體及活生物餌料橈足類等的安全性，簡單的消毒處理方式已無法滿足需求。
[0004]應用蛭弧菌製劑控制橈足類所攜帶的的總菌，從源頭上對水產養殖中存在的可能致病細菌進行防控，以形成具有疾病防預功能的養殖生態系統，具有十分重要的意義。


【發明內容】

[0005]為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在於提供一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法。該方法創新性提出了一種蛭弧菌製劑在控制有益浮遊生物橈足類所攜帶的總菌的方式；並可以適當的延長其製劑中的菌體活性。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，包括以下步驟:
[0007](I)製備蛭弧菌稀釋液；
[0008](2)將步驟⑴製備的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合，即得到蛭弧菌製劑；
[0009](3)含橈足類(Cop印oda)的水樣的預處理；
[0010](4)將步驟(2)蛭弧菌製劑與步驟(3)的含橈足類的水樣進行混合。
[0011]所述的蛭弧菌優選為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ;對所述的蛭弧菌進行進行負染後於電子顯微鏡下觀察形態可知:BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65 X 0.2 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用雙層平板培養的方法於28°C培養四天可形成直徑I?2mm的透明圓形卩遼菌斑；
[0012]所述的蛭弧菌稀釋液優選通過以下步驟獲得:
[0013]①宿主菌濃縮液的製備:挑取大腸桿菌單菌落(大腸桿菌E.coli，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GIM1.355),接種於營養肉湯液體培養基中，培養，得到培養液，然後將培養液離心，棄上清，每10mL培養液收集的沉澱用2?3mL DNB(dilutednutrient broth)液體培養基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4°C保存備用；
[0014]②蛭弧菌稀釋液的製備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養基的體積比1: 1:50的比例進行混合，恆溫培養，每24h添加一次宿主濃縮液，培養48h，得到培養液；將培養液離心，取上清液過濾，濾液使用質量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調整其濃度，製備得到2X 12?2X 15PFU(plaque-formingunit)/mL的蛭弧菌稀釋液；
[0015]所述的蛭弧菌優選為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02,為2009年8月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ；
[0016]步驟①中所述的營養肉湯液體培養基優選為營養肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min後保存備用；
[0017]步驟①中所述的培養的條件優選為200rpm、28°C培養18h ；
[0018]步驟①中所述的離心的條件優選為4°C、6000rpm離心20min ；
[0019]步驟②中所述的恆溫培養的條件優選為230rpm、28°C培養；
[0020]步驟②中所述的將培養液離心的條件優選為6000rpm、4°C離心20min ；
[0021]步驟②中所述的過濾優選為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾；
[0022]步驟①和②中所述的DNB液體培養基，優選通過如下步驟製備:稱取0.8g/L的營養肉湯，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶,用蒸懼水溶解混勻，調pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa條件下處理20min保存備用；
[0023]步驟②中所述的質量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水優選用海水晶製備得到；
[0024]步驟(2)中所述的保護劑優選為質量體積比(g/mL) 5?25%穀氨酸鈉和質量體積比(g/mL) 5?25%鹿糖的混合溶液；
[0025]步驟(2)中所述的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合優選按照蛭弧菌稀釋液與保護劑進行體積比1:1混合；
[0026]步驟(3)中所述的含橈足類的水樣的預處理方法，包括如下步驟:採集自橈足類的養殖水體的水樣，將從養殖水體取得的水樣靜置30?35min，取上層帶有浮遊橈足類的水樣，除去沉澱在底部的泥沙等雜質，即為實驗所使用含橈足類的水樣；經觀察計數，其橈足類數目為3?4個/mL ;
[0027]步驟(4)中所述的混合優選將蛭弧菌製劑與含橈足類的水樣按照體積比1: (10?100)混合；
[0028]本發明的機理是:通過向培養好的蛭弧菌中添加穀氨酸鈉及蔗糖，製備成為一種蛭弧菌製劑，分別探討不同濃度的蛭弧菌製劑對於橈足類所攜帶的總菌的控制效果。
[0029]本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果:
[0030](I)本發明獲得了一種蛭弧菌製劑的製備方法，通過該方法製備得到的蛭弧菌製劑可以在較長的時間內維持其製劑中蛭弧菌裂解活性。
[0031](2)本發明製備的蛭弧菌製劑中含有保護劑(穀氨酸鈉和蔗糖的混合液)，而穀氨酸鈉和蔗糖的混合液對水體及橈足類本身無毒副作用，同時不會引起水體的汙染和橈足類等有益水生浮遊生物的死亡。
[0032](3)本發明提供的蛭弧菌製劑的製備方法簡單易行，適於工業化大批量生產，其中所含有的穀氨酸鈉和蔗糖，選材廣泛價格低廉，適用於推廣使用。
[0033](4)本發明提供的該種蛭弧菌製劑可以有效的控制橈足類所攜帶的的總菌，在24h內即可控制總菌數目在103cfu/mL以內，並在較長的時間內減緩其再生。
[0034](5)本發明中所述的蛭弧菌製劑的濃度可以根據實際應用的需要進行適當的調整，以達到最佳的控制橈足類所攜帶的總菌目的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是實驗組A、實驗組B、實驗組C和實驗組Cl的實驗效果比對圖。
[0036]圖2是實驗組A、實驗組B、實驗組D和實驗組Dl的實驗效果比對圖。
[0037]圖3是實驗組A、實驗組B、實驗組E和實驗組El的實驗效果比對圖。
[0038]圖4是實驗組A、實驗組B、實驗組F和實驗組Fl的實驗效果比對圖。
[0039]圖5是實驗組A、實驗組B、實驗組C、實驗組D、實驗組E和實驗組F的實驗效果比對圖。

【具體實施方式】
[0040]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0041]下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件。
[0042]蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02為2009年8月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M209170。對所述的蛭弧菌進行進行負染後於電子顯微鏡下觀察形態可知:BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65X0.2 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用雙層平板培養的方法於28°C培養四天可形成直徑I?2mm的透明圓形卩遼菌斑。蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02在中國專利申請文件「申請號:200910042275.0，名稱為:一種消除水產品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株及其應用」中公開。
[0043]實施例1
[0044]具體實驗方法如下:
[0045]一、材料、培養基和溶液
[0046](I)材料
[0047]蛭弧菌:BDS02。
[0048]宿主菌:大腸桿菌GMl.355，購於廣東省微生物所菌種保藏中心。
[0049]含橈足類(Copepoda)的水樣:採集自海南省文昌市鋪前鎮的海水養殖場的含有針刺尖頭水蚤(Arietellus aculeatus)的養殖水體的水樣,經觀察計數,其燒足類數目大約在3個/mL。
[0050](2)培養基
[0051]2216E佐貝爾海洋細菌培養基:海水晶15g，蛋白腖5g，酵母浸膏lg，磷酸高鐵0.0lg，蒸餾水100mL, ρΗ7.6?7.8，瓊脂15g。121。。0.1MPa下滅菌20min後傾注平板保存備用。
[0052]TCBS瓊脂培養基(弧菌選擇性培養基):TCBS瓊脂89g，加入蒸餾水lOOOmL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，傾注滅菌平板保存備用。
[0053]營養肉湯液體培養基:營養肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min後保存備用。
[0054]DNB液體培養基:營養肉湯0.8g/L，酪蛋白酸水解物0.5g/L，酵母提取物0.lg/L,15g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調pH值至7.2?7.6，121 °C 0.1MPa條件下處理20min保存備用。
[0055](3)溶液
[0056]PBS (磷酸緩衝液)緩衝液(0.1M):量取0.2mol/L磷酸二氫鈉(27.8g磷酸二氫鈉定容至lOOOmL) 28mL和0.2mol/L磷酸氫二鈉(53.65g七水磷酸氫二鈉定容至lOOOmL) 72mL混合均勻，用蒸餾水定容至200mL，即為0.1moI/LPBS溶液，pH約為7.2。
[0057]二、實驗方法
[0058](I)宿主菌濃縮液的製備
[0059]挑取大腸桿菌單菌落(大腸桿菌E.coli，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GMl.355)，接種於營養肉湯液體培養基中，200rpm、28 °C培養18h，得到培養液，然後將培養液4°C、6000rpm離心20min，棄上清，每10mL培養液收集的沉澱用2?3mLDNB(diluted nutrient broth)液體培養基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4?保存備用；
[0060](2)蛭弧菌稀釋液的製備
[0061]按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養基的體積比1:1:50的比例進行混合，230rpm、28 V恆溫培養，每24h添加一次宿主濃縮液，培養48h,得到培養液；將培養液6000rpm、4°C離心20min,取上清液用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾，濾液使用質量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調整其濃度，分別得到I X 12PFU(plaque-formingunit) /mL、I X 103PFU/mL、I X 104PFU/mL、I X 105PFU/mL 和 2 X 12PFU (plaque-formingunit)/mL、2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL、2X 105PFU/mL 的 8 種濃度的蛭弧菌稀釋液。
[0062](3)蛭弧菌製劑樣品的製備
[0063]將步驟(2)中培養稀釋後的2X 102PFU/mL、2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL 和2X105PFU/mL4種濃度的蛭弧菌稀釋液，按照體積比1:1的比例添加含有質量體積比(g/mL)6% (w/v)鹿糖和質量體積比(g/mL)6% (w/v)穀氨酸鈉的混合溶液,從而得到製備出的均含有質量體積比(g/mL)3% (w/v)鹿糖和質量體積比(g/mL)3% (w/v)穀氨酸鈉的4種濃度的蛭弧菌製劑。
[0064]使用DNB雙層平板法檢測其蛭弧菌製劑中蛭弧菌的活菌濃度並記錄，即作為蛭弧菌製劑，並可將其應用於控制橈足類所攜帶的的總菌當中。
[0065](4)實驗用樣品的處理及實驗組設置
[0066]實驗用水樣的處理:由於橈足類大小多為體長< 3mm，因此在處理實驗用水樣時，將從養殖水體取得的水樣若干靜置30min，傾倒出上層帶有浮遊橈足類的水樣，除去沉澱在底部的泥沙等雜質，即為實驗所使用的水體樣本。吸取1mL水樣進行觀察，記錄其中的橈足類數目，即為實驗用所含橈足類的水樣。
[0067]實驗組設置:對於所取養殖水體，通過設置對照組、不同濃度的蛭弧菌製劑進行實驗，每個實驗組別的具體設置如下，即實驗組A?Fl:
[0068]實驗組A:每50mL實驗水樣中添加ImL滅菌的質量體積比(g/mL) 15%。鹽度蒸餾水，作為對照組。
[0069]實驗組B:每50mL實驗水樣中添加ImL含有質量體積比(g/mL) 3% (w/v)穀氨酸鈉和質量體積比(g/mL) 3% (w/v)鹿糖的混合溶液。
[0070]實驗組C:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中製備的濃度為102PFU/mL的蛭弧菌製劑。
[0071]實驗組Cl:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中製備的濃度為102PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌製劑。
[0072]實驗組D:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中製備的濃度為103PFU/mL的蛭弧菌製劑。
[0073]實驗組Dl:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中製備的濃度為103PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌製劑。
[0074]實驗組E:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中製備的濃度為104PFU/mL的蛭弧菌製劑。
[0075]實驗組El:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中製備的濃度為104PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌製劑。
[0076]實驗組F:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑶中製備的濃度為105PFU/mL的蛭弧菌製劑。
[0077]實驗組Fl:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中製備的濃度為105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌製劑。
[0078]實驗組A?Fl的10個實驗組別，每個做3個平行，每個平行樣品水樣為50mL使用三角燒瓶盛裝，置於無菌恆溫箱內，室溫25°C放置Id後開始進行實驗，容器上方覆蓋滅菌塑料膜密封，防止灰塵等雜物汙染，以使水體中的細菌菌群達到穩定。對於實驗組A?F1，每24h添加一次對應的實驗樣品，按照後續的檢測要求進行檢測。
[0079](5)取樣檢測
[0080]對於所有實驗組別，在添加蛭弧菌製劑等後立即取樣檢測，即為Oh的檢測值，後續每隔24h取樣進行檢測，取樣時間點分別為0h、24h、48h、72h和96h，取樣的全過程都嚴格遵循無菌操作，具體操作方法如下:
[0081]對於橈足類的取樣處理方式:使用接種針挑取I個橈足類浮遊生物個體放入滅菌培養皿，再通過研缽碾碎後，用ImL的質量體積比(g/mL) 15%。鹹淡水衝洗，整個取樣過程都嚴格遵循無菌操作，在超淨臺內進行，所得的液體即為待檢測橈足類樣品。
[0082](6)總細菌數的檢測
[0083]在到達設定的檢測時間點時，將步驟(5)中的取樣處理後的橈足類樣品使用PBS緩衝液按10倍梯度進行稀釋，取各梯度稀釋液0.lmL，均勻塗布於2216E佐貝爾海洋細菌培養基平板，將平板倒置於28°C恆溫培養箱中培養4?5d，計算出樣品中的總細菌濃度，單位為 cfu/mL0
[0084](7)數據分析
[0085]實驗中各實驗組3個平行樣品菌數檢測的數值取平均值，使用MS Excel進行顯著性分析，可信度高，菌數檢測結果均以平均數土標準差的形式表示。
[0086]三、實驗結論
[0087]蛭弧菌製劑對橈足類所攜帶的總菌的控制
[0088](I)濃度為102PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果比對
[0089]圖1可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內其總細菌數目維持在108cfu/mL左右，總體呈現平穩趨勢，達到
9.23X 107cfu/mLo添加質量體積比(g/mL) 3%穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL) 3%鹿糖組,其中的總細菌數的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內其總細菌數目對數值變化在±0.52個數量級，並且在96h時其終總菌數達到穩定，為9.83X 107cfu/mL。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內總細菌數變化無顯著差異，並且組內不同時間點時的總細菌數，在O?96h內無明顯差異。添加濃度為102PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組Cl)，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有一定程度的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至3.69 X 106cfu/mL，並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為102PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組C)，可以看出，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有較好的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至5.36 X 14Cfu/mL，並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數目的變化與對照組、3%穀氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌製劑組均存在顯著差異。
[0090](2)濃度為103PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果比對
[0091]圖2可以清晰看出，實驗期間，對照組與添加質量體積比(g/mL) 3%穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL) 3%蔗糖組，其中的總細菌數的變化趨勢與濃度為102PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果相同。添加濃度為103PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組Dl)，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有一定程度的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至1.24X 106cfu/mL,並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為103PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組D)，可以看出，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有較好的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.26X 107cfu/mL降至4.87 X 104cfu/mL,並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數目的變化與對照組、3%穀氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌製劑組均存在顯著差異。
[0092](3)濃度為104PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果比對
[0093]圖3可以清晰看出，實驗期間，對照組與添加質量體積比(g/mL) 3%穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL) 3 %蔗糖組，其中的總細菌數的變化趨勢與濃度為102PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果中相同。添加濃度為104PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組El)，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有一定程度的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至5.89X 105cfu/mL,並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為104PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組E)，可以看出，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有較好的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.39X 107cfu/mL降至2.59 X 102cfu/mL，並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數目的變化與對照組、3%穀氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌製劑組均存在顯著差異。
[0094](4)濃度為105PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果比對
[0095]圖4可以清晰看出，實驗期間，對照組與添加質量體積比(g/mL) 3 %穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL) 3 %蔗糖組，其中的總細菌數的變化趨勢與濃度為102PFU/mL的蛭弧菌製劑的實驗效果中相同。添加濃度為105PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組Fl)，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有一定程度的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至3.21 X 106cfu/mL,並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為104PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌製劑組別(即實驗組F)，可以看出，在首次添加蛭弧菌製劑後，O?24h內就對於總菌有較好的控制，使總細菌數目快速下降，由初始的9.41 X 107cfu/mL降至4.33 X 104cfu/mL,並且隨著每24h添加入蛭弧菌製劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數目的變化與對照組、3%穀氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌製劑組均存在顯著差異。
[0096]綜上所述，對比發現，所有不含有3%穀氨酸鈉+3%蔗糖的單純蛭弧菌製劑在控制橈足類攜帶細菌中的效果均沒有含有3%穀氨酸鈉+3%蔗糖的混合蛭弧菌製劑的效果好，其2者存在顯著差異，因此說明，添加了保護劑的蛭弧菌製劑在控制橈足類中總細菌數目的效果上，好於未添加的組別，因此後面的研究集中於對比不同濃度的含有保護劑蛭弧菌製劑對於橈足類攜帶細菌的控制效果。
[0097](5)不同濃度蛭弧菌製劑效果比對
[0098]圖5可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內其總細菌數目維持在108cfu/mL左右；添加質量體積比(g/mL) 3%穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL)3%蔗糖組，其中的總細菌數的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內其總細菌數目對數值變化在±0.52個數量級，並且在96h時其終總菌數達到穩定。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內總細菌數變化無顯著差異，並且組內不同時間點時的總細菌數，在O?96h內無明顯差異。添加不同濃度蛭弧菌製劑的組別均對於橈足類所攜帶的的總菌有較好的控制效果，觀察對比102PFU/mL、103PFU/mL、104PFU/mL和105PFU/mL4種濃度的蛭弧菌製劑的控制效果發現，104PFU/mL濃度的蛭弧菌製劑可以對橈足類所攜帶的的總菌有較好的控制效果，其在24h就可以使其中的總細菌數目下降5個數量級，而其他濃度的蛭弧菌製劑在24h時，對於橈足類所攜帶的的總菌的控制效果沒有104PFU/mL濃度的蛭弧菌製劑好，在對於總菌對數值的控制上較104PFU/mL濃度的蛭弧菌製劑少2個數量級，但仍然具備一定的控制效果。
[0099]同時，對比對照組和質量體積比(g/mL) 3%穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL)3%蔗糖組發現，向含有橈足類的水體中投放濃度為質量體積比(g/mL) 3%穀氨酸鈉+質量體積比(g/mL)3%蔗糖的混合溶液並未使其中的總細菌數目有顯著變化，並且不含有保護劑的蛭弧菌製劑具有一定的控制效果，但是沒有與保護劑共同使用時的協同效果好，這表明在製備蛭弧菌製劑中添加的穀氨酸鈉和蔗糖對於含有橈足類的水體及橈足類本身無汙染及毒副作用，還可以獲得更加優異的控制效果。因此，其可以用於蛭弧菌製劑的製備當中。
[0100]總之，104PFU/mL的蛭弧菌製劑即可在24h快速的降低橈足類所攜帶的的總菌數目，並且隨著每24h添加一次蛭弧菌製劑，對於橈足類所攜帶的總菌的控制效果可以在較長時間內得到維持，是一種良好的防控水體及橈足類所攜帶的總菌的有益菌製劑，將其投入大規模生產後，相信其可以對當前的水產養殖業及食品加工行業都產生重大深遠的影響。
[0101]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)製備蛭弧菌稀釋液； (2)將步驟(I)製備的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合，即得到蛭弧菌製劑； (3)含橈足類的水樣的預處理； (4)將步驟(2)蛭弧菌製劑與步驟(3)的含橈足類的水樣進行混合。
2.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 所述的蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 209170。
3.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 所述的蛭弧菌稀釋液的濃度為2 X 12?2X 105PFU/mL。
4.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 所述的保護劑為質量體積比5?25%穀氨酸鈉和質量體積比5?25%蔗糖的混合溶液。
5.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 步驟(2)中所述的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合按照蛭弧菌稀釋液與保護劑進行體積比1:1混合。
6.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 所述的含橈足類的水樣中的橈足類數目在3?4個/mL。
7.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 步驟(4)中所述的混合是將蛭弧菌製劑與含橈足類的水樣按照體積比1: (10?100)混合。
8.根據權利要求1所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 所述的蛭弧菌稀釋液通過以下步驟獲得: ①宿主菌濃縮液的製備:挑取大腸桿菌單菌落，接種於營養肉湯液體培養基中，培養，得到培養液，然後將培養液離心，棄上清，每10mL培養液收集的沉澱用2?3mL DNB液體培養基懸浮，得到宿主菌濃縮液，4°C保存備用； ②蛭弧菌稀釋液的製備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養基的體積比1:1:50的比例進行混合，恆溫培養，每24h添加一次宿主濃縮液,培養48h,得到培養液；將培養液離心，取上清液過濾，濾液使用質量體積比1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調整其濃度，製備得到2X 12?2 X 105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液。
9.根據權利要求8所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 步驟①中所述的營養肉湯液體培養基為營養肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min後保存備用； 步驟①中所述的培養的條件為200rpm、28°C培養18h ； 步驟①中所述的離心的條件為4°C、6000rpm離心20min ； 步驟②中所述的恆溫培養的條件為230rpm、28°C培養； 步驟②中所述的將培養液離心的條件為6000rpm、4°C離心20min ； 步驟②中所述的過濾為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾； 步驟②中所述的質量體積比1.5%鹽度的滅菌蒸餾水用海水晶製備得到。
10.根據權利要求8所述的控制橈足類攜帶的總細菌數的方法，其特徵在於: 步驟①和②中所述的DNB液體培養基，通過如下步驟製備:稱取0.8g/L的營養肉湯，.0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa條件下處理20min保存備用。
【文檔編號】A61K35/74GK104126529SQ201410269824
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月17日 優先權日:2014年6月17日
【發明者】蔡俊鵬, 孫秋平, 郭衍彪 申請人:華南理工大學