刺激神經再生的方法

2023-05-27 19:53:11 1

專利名稱：刺激神經再生的方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，特別是神經系統的醫藥生物領域。更具體地講，本發明涉及刺激神經再生的方法，它適用於外周神經和中樞系統，特別是脊髓。由於其局部和特異性特徵，本發明方法可以在各種病理狀況中刺激神經再生，特別是在脊髓、外周神經、臂或腰神經叢的損傷中。
中樞及外周神經系統的損傷在傷科中是常見的。骨髓的無論源自外傷還是變性的損傷、外周神經的損傷、臂或腰神經叢的損傷迄今留給傷者或患者沉重的生活障礙。雖然外周神經系統具有強自發再生能力，但採用神經修復的常規技術只能產生不可靠的結果。這些技術主要包括直接吻合術或當張力太大無法縫合兩個神經端時(實體缺失或由於神經過分撕破需要切除一段神經時)放置自體或異體的神經移值物。腕部接受了正中神經修復的病人中只有5％以下的人在5年後恢復正常的感覺和運動(1)。
最近，連接損傷神經末端的管形假器的使用(套管式連接技術)為這些神經修復常規技術提供了一種替代方法(2，3)。這一技術提供了簡化重新對齊神經束的條件的優點，並已在實驗中和臨床上橋連一些小的實體缺失(最多5-7mm(1-6))中取得成功。但對於更長的實體缺失，在管中加入神經營養物質或細胞看來是必不可少的。在實驗中已試驗了體內用於支持管的多種因子如FGF-1、FGF-2或NGF(7-10)，或全身應用的CNTF或IGF II，但不是為了清楚揭示它們在神經再生中的作用(7-12)。另外，現在還沒有一種治療脊髓損傷的臨床方法。
本發明提供創傷性或變性性神經損傷治療問題的解決方案。本發明實際上涉及一種用生物相容性套管和神經營養因子編碼核酸的組合物刺激神經再生的方法。本發明還涉及一種用於刺激神經再生的裝置，其包括一種生物相容性套管和引入其中的神經生長刺激因子(神經營養因子)的表達系統。本發明的另一方面涉及用於刺激神經再生的藥盒，其一方面包括一種生物相容性套管，另一方面包括含有神經生長刺激因子表達系統的組合物。本發明還涉及其中引入了神經營養因子表達系統的生物相容性套管在製備用於刺激神經再生的組合物中的應用。
本發明另外還適用於外周神經的再生及刺激脊髓中軸突的再生。
本發明來源於多個發現。它特別來源於如下發現藉助於適當的裝置可以在兩段神經之間外科重建一個物理橋，並且可以在該裝置中引入神經營養因子的表達系統。本發明還來源於這樣的發現可以在足以刺激神經元生長的期間內引入局部濃集的營養因子。因而本發明聯合了多種在治療方面特別有利的特性。本發明首先允許持續的作用，這是因為營養因子的延遲釋放作用。另外神經營養因子的生物效應被套管的支柱作用所增強，它可加速和引導神經元的生長。本發明方法還允許在創傷或變性部位的很局部因而很特異性的作用，營養因子被分隔在密封的裝置中。實施例中給出的結果表明用本發明的方法可進行快速有效和局部的神經修復。
本發明方法特別在於神經段水平的局部幹預。斷開的神經或神經束的近段或遠段被引入一生物相容性套管的一端，它被物理地固定在此處。然後將含有神經營養因子表達系統的組合物引入該套管中。該斷開神經或神經束的另一端被引入套管的另一端，也被物理地固定。為了避免表達系統擴散到套管之外，最好將其用生物膠連接和/或固定在兩末端處。該裝置另外還允許表達系統的再次注入。同時存在支持物和高濃度的神經營養因子及持續時間長，如實施例中所示，可以重建神經連續性，從而恢復相應的活動。
具體到外周神經系統，本發明方法包括取損傷之下外周神經或神經根，在切除該神經或神經根的一部分後將其置於一生物相容性套管中。將該神經段的近端部分(無論它是運動神經或感覺神經)引入套管中並固定，例如通過縫合或放置生物膠。將編碼活性因子的表達系統注射在套管中，留在原處。該神經段的遠端部分被引入在套管的另一端，從而得以恢復軸突的連續性(圖1)。
在中樞神系統，特別是脊髓，本發明方法也特別適用於脊髓損傷的橋接。這種類型的創傷另外構成本發明系統的主要應用之一，對於這種創傷迄今還沒有任何臨床治療方法。可以設想兩種類型的應用方法將損傷之下的外周傳入神經與該損傷之上的健康脊髓橋接(圖5)，或將損傷之上的健康脊髓與該損傷之下的脊髓橋接(圖6)。
在第一種情況下，脊髓損傷之下的一個或多個神經根被切割、引入管形假器(套管)中並通過縫合和生物膠固定。該支持管這時可以接受攜帶可刺激運動神經元軸突延長之基因的表達系統；和/或任選的用於刺激軸突重新生長的各種已知因子如外周神經移植物，或細胞。然後將該支持管引入在損傷之上的健康脊髓中所作的縱向切口中，使該管的近端與灰質前角(脊髓運動神經元定位處)對齊。通過一根或多根與蛛網膜的縫線和生物膠將該支持管固定(圖5B)。這種裝配因而可以恢復某些重要肌肉的功能。
在第二種情形下，切去脊髓的破碎部分，在上下遊間植入一個支持管，以連接損傷的上下部分之間的主要神經束(錐體束、皮質脊髓束等)(圖6)。然後在該支持管中充滿前述物質。
在本發明中，神經段的近端部分或神經的近端部分指與中樞神經系統接觸的神經部分。對於外周神經，其近端部分是與脊髓連接的部分。對於脊髓的損傷，近端部分是與中樞神經系統接觸的部分。
還應理解，神經段的遠端部分或神經的遠端部分指神經的外周部分。對於外周神經，其遠端部分是與運動板塊(神經肌肉結)相連的部分。對於脊髓損傷，遠端部分是與中樞神經系統失去連接的部分。
為實施本發明，套管可以是與治療應用相適應的任何裝置。套管的結構和組成最好按如下定義(i)它恢復軸突的連續性，(ii)它能包含包括活性因子表達系統的組合物，(iii)它能作為軸突再生長的支柱，包括脊髓向外周，外周向脊髓，和脊髓向脊髓。套管的支柱特性通過神經能粘附和在其上(特別是其內表面)生長的特性來起作用。粘附可以是任何能導致細胞在套管上附著和/或固定的生物和/或化學和/或物理相互作用形式的結果。另外，對於人類的治療應用，還希望套管是不透性的或半透性的，但不會讓表達系統通過。
最好，該套管是生物相容的無毒固體支持物。特別可以是由諸如聚矽氧烷、PAN/PVC、PVFD、聚四氟乙烯(PTFE)纖維或丙烯酸共聚物等合成材料組成的套管。在一種特別的實施方案中，優選使用由或主要由生物材料(特別是交聯膠原、骨粉)、基於碳水化合物的聚合物、聚乙醇酸/聚乙酸衍生物、透明質酸酯、或基於鈣質的支持物構成的套管。在本發明中優選使用膠原或聚矽氧烷。可以用源自人、牛或鼠的膠原。更優選使用由I、III或IV型膠原(最好是IV、IVOX)或聚矽氧烷的雙層構成的套管。可以舉出具體的實例，如由聚矽氧烷構成的Silastic套管(Dow-Corning)。另外，該套管最好具有管、一截圓柱體或角形的形狀。套管的直徑可由本領域技術人員根據具體的應用來確定。具體講，對於刺激外周神經的再生，相對直徑可為0.05-15mm。更具體地講，套管的內徑在0.5-10mm之間。用於脊髓的再生，可選擇更大內徑的套管。特別地，對於這些應用，所用套管根據所涉及的神經段具有可達15-20mm的內徑。對於臂神經叢的破損神經根的橋接，套管的直徑最好相應於神經根的直徑，套管的長度一般取決於待補償的缺失長度。可以使用長度在0.5-5cm的套管。優選地，套管長度小於5cm，實質缺失超過5cm是不常見的。
如上所述，本發明方法首先涉及將神經的第一部分引入套管中，這最好是神經的近端部分。然後將其固定以便確保(i)神經的良好生長和(ii)裝置的密封性。為此，可以在神經和套管間進行縫合和/或放置生物膠。縫合可按外科的常規方法用適當的線進行。生物膠可以是可用於神經系統的任何生物相容性膠，特別是用於人類外科的任何生物膠，尤其是由纖維蛋白構成的膠Biocolle(Biotransfusion，CRTS，裡爾)、Tissucol Immuno AG，奧地利維也納)等。
如上所述，本發明方法包括在套管中引入包含神經營養因子表達系統的組合物。
在本發明中，術語「表達系統」指能使編碼神經營養因子的核酸在體內表達的任何構建物。最好，該表達系統包含在轉錄啟動子控制下的編碼神經營養因子的核酸(表達盒)。核酸可以是DNA或RNA。對於DNA，可以使用cDNA、g DNA或雜合DNA，即含有g DNA的一個或多個內含子但不是全部的DNA。DNA還可以是合成的或半合成的，特別是優化了密碼子或造成截短形式的人工合成DNA。
轉錄啟動子可以是在哺乳動物(優選人)細胞(特別是神經細胞)中有功能的任何啟動子。當負責相關神經營養因子表達的天然啟動子區在相關細胞或機體中有功能時，可以用這種天然啟動子區。也可以用不同來源的啟動子區(負責其它蛋白的表達，或甚至是合成的)。特別可以用真核細胞或病毒基因的啟動子區。例如可以用源自靶細胞基因組的啟動子區。在真核啟動子中，可以使用特異性或非特異性，可誘導地或不可誘導地、弱或強地刺激或抑制某基因轉錄的任何啟動子或衍生序列。這特別可以是遍在型啟動子(HPRT、PGK、α-肌動蛋白、微管蛋白等基因的啟動子)、中間絲的啟動子(GFAP、結蛋白、波形蛋白、神經絲、角蛋白等基因的啟動子)、治療性基因的啟動子(例如MDR、CFTR、第八因子、ApoAI等基因的啟動子)或應答於某種刺激的啟動子(甾類激素的受體、視黃酸受體等)。同樣，可用源自病毒基因組的啟動子序列，例如腺病毒的E1A和MLP基因的啟動子、CMV的早期啟動子或RSV病毒LTR的啟動子。另外，可通過添加活化、調節或進行組織特異或集中表達的序列而修飾這些啟動子區。
在本發明中優選使用真核或病毒的組成性啟動子，特別是選自HPRT、TGK、α-肌動蛋白、微管蛋白基因的啟動子或腺病毒E1A和MLP基因的啟動子、CMV的早期啟動子或RSV病毒LTR啟動子的那些。
另外，表達盒最好包含引導合成產物至靶細胞分泌道中的信號序列。這種信號序列可以是所合成產物的天然信息序列，但也可以是任何其他功能性信號序列或一種人工信號序列。
最後，表達盒一般包括指示轉錄終止信號的3′區和一個聚腺苷酸化位點。
可用於本發明的營養因子主要分類為神經營養蛋白家族、神經因子家族、TGF-β家族、成纖維細胞生長因子(FGF)家族和胰島素型生長因子(IGF)家族(綜述見16)。
在神經營養蛋白家族中，本發明中優選使用BDNF、NT-3或NT-4/5。
Thoenen(17)描述的腦衍生神經營養因子(BDNF)是一種118個胺基酸、分子量為13.5KD的蛋白質。在體外，BDNF刺激神經突的形成，視網膜節神經元、隔膽鹼能神經元及中腦多巴胺能神經元的培養存活力(綜述見18)。編碼人BDNF和大鼠BDNF的DNA序列已被克隆和測序(19)，編碼豬的BDNF的序列也已測定(20)。雖然其具有潛在的有意義的特性，但BDNF的治療應用遇到了各種困難特別是，BDNF生物利用性的缺乏限制了任何治療應用。在本發明中產生的腦衍生神經營養因子(BDNF)可以是人BDNF或動物BDNF。
神經營養蛋白3(NT3)是一種119個胺基酸的分泌蛋白，它甚至在很低濃度下使神經元體外生存(21)。已報導了編碼人NT3的cDNA的序列(22)。
TGF-β家族特別包括衍生自神經膠質細胞的神經營養因子。這種衍生自神經膠質細胞的神經營養因子GDNF(23)是一種134個胺基酸、分子量為16kD的蛋白質。它具有體外促進多巴胺能神經元和運動神經元存活的重要能力(16)。本發明中產生的神經膠質細胞衍生神經營養因子(GDNF)可以是人GDNF或動物GDNF。編碼人GDNF和大鼠GDNF的cDNA的序列已被克隆和測序(23)。
另一種可用於本發明的神經營養因子是CNTF(睫狀神經營養因子)。CNTF是一種可阻止神經元死亡的神經因子。如以前報導的那樣，臨床試驗已無結果而過早中斷。本發明現在體內長時間持續地產生CNTF，單獨產生或與其它營養因子聯合產生。人及鼠的CNTF的cDNA和基因已被克隆和測序(EP385 060；WO91/04316)。
可用於本發明的其它神經營養因子例如是IGF-1(Lewis等，1993)和成纖維細胞生長因子(FGFa，FGFb)。尤其IGF-1和FGFa是很有意義的候選者。FGFa的基因序列及允許其體內表達的載體已在文獻中報導(WO 95/25803)。
優選地，本發明的表達系統能在體內產生選自神經營養蛋白、神經因子和TGF的神經營養因子。更優選產生選自BDNF、GDNF、CNTF、NT3、FGFa和IGF-1的因子。尤其有意義的是產生NT3。
另外，根據本發明的一種變化方案，還可以利用本發明的表達系統以產生兩種神經營養因子。在此實施方案中，表達系統包括兩種表達盒，或同時表達兩種核酸的單一表達盒(雙順反子單元)。當該系統包含兩種表達盒時，它們可以使用相同或不同的啟動子。
在本發明的表達系統中，表達盒最好構成載體的一部分。載體特別可以是病毒載體或質粒載體。在含多個表達盒的表達系統中，這些表達盒可以被分立的載體或被同一個載體所攜帶。
所用的載體可以是標準的質粒載體，除本發明的表達盒外，還包含複製起點和基因標記。另外已報導了各種類型的改進載體，它們沒有基因標記和複製起點(WO 96/26270)或具有例如條件性的複製起點(PCT/FR96/01414)。這些載體可有利地用於本發明中。
所用的載體還可以是病毒載體。已從病毒構建了各種載體，它們具有顯著的基因轉移特性。特別可以舉出腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒和皰疹病毒。為了用作基因轉移的載體，這些病毒的基因組可被修飾使其不能在細胞中自主複製。這些病毒被稱為複製缺陷性。一般地，用表達盒取代病毒複製所必需的區域來修飾該基因組。
在本發明中，優選使用腺病毒衍生的病毒載體。腺病毒是約36kb(千鹼基)長的雙鏈線性DNA病毒。其基因組特別包括在每個末端的反向重複序列(ITR)、衣殼化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4區中。其中E1區中包含的基因是病毒繁殖所必需的。晚期基因主要包含在L1-L5區中。腺病毒Ad5的基因組已被整個測序，在資料庫中可以找到(特別見Genebank M73260)。同樣，其他腺病毒(Ad2、Ad7、Ad12等)基因組的部分甚至全部也已被測序。
為了作為基因轉移載體，已製備了包含不同治療基因的腺病毒衍生的不同構建物。更具體地講，在現有技術中描術的構建物是缺失E1區(病毒複製所必需)並在此處插入外源DNA序列的腺病毒(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因50(1986)161)。另外，為了改善載體的性能，已提出在腺病毒基因組中創造其他缺失或修飾。例如，已在突變體ts125中引入了熱敏性的點突交，使與DNA結合的72kDa蛋白質(DBP)失活(13)。另一些載體含有在另一病毒複製和/或繁殖必需區域(E4區)中的缺失。E4區實際上參與晚期基因的表達調節、晚期核RNA的穩定性、宿主細胞蛋白表達的消滅和病毒DNA複製的有效性。E1和E4區都缺失的腺病毒載體因而其有很低的病毒基因轉錄和表達的基底噪音。例如在專利申請WO 94/28152、WO95/02697、WO 96/22378中描述了這種載體。另外，還報導了在IVa2基因中有修飾的載體(WO 96/10088)。
文獻中描述的缺陷性重組腺病毒是來自不同血清型腺病毒的產物。實際上存在多種血清型的腺病毒，其結構和特性有差異，但它們具有可比的基因結構。特別地，重組腺病毒可源自人或動物。對於人源的腺病毒，優選舉出分類為C組的那些，特別是2(Ad2)、5(Ad5)、7(Ad7)或12(Ad12)型腺病毒。在源自動物的不同腺病毒中，優選舉出來自狗的腺病毒，特別是CAV2腺病毒的毒株(例如manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。在特別是專利申請WO 94/26914(引入本發明作為參考)中描述了其他源自動物的腺病毒。
在一優選的實施方案中，重組腺病毒是C組人腺病毒。更優選是Ad2或Ad5腺病毒。
這些腺病毒在衣殼化細胞系中產生，即在能夠反式補充重組腺病毒基因組中的一種或多種缺陷功能的細胞系中。例如一種這樣的細胞系是293細胞系，其中已整合了一部分腺病毒基因組。更準確地講，293細胞系是含有血清型5腺病毒(Ad5)基因組左端(約11-12％)的人胚腎細胞系，所述左端部分包括左側ITR、衣殼化區、E1區(包括E1a和E1b)、編碼pIX蛋白的區域和編碼pIVa2蛋白的部分區域。該細胞系能夠反式補充E1區缺陷的重組腺病毒(即失去E1區全部或部分的腺病毒)，產生高滴度病毒原種。該細胞系還能夠在允許的溫度(32℃)下產生另外含熱敏性E2突變的病毒原種。還報導了能夠補充E1區的其他細胞系，它們尤其基於人肺癌細胞A549(WO 94/28152)或人視網膜細胞(人類基因治療(Hum.Gen Ther)(1996)215)。另外，也已報導了能夠反式補充腺病毒多種功能的細胞系。特別地，可以舉出補充E1和E4區的細胞系(Yeh等，病毒學雜誌(J.Virol)70(1996)559；癌症基因治療(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322；Krougliak等，人類基因治療(Hum.Gen.Ther.)6(1995)1575)和補充E1和E2區的細胞系(WO 94/28152，WO 95/02697，WO 95/27071)。這些重組腺病毒一般按如下過程產生在衣殼化細胞系中引入病毒DNA，在約2或3天後(腺病毒的動力學周期為24-36小時)裂解細胞，然後在氯化銫梯度上離心分離重組病毒顆粒。在專利申請FR9608164中描述了其它的方法，所述申請引入本文作為參考。
治療基因的表達盒可以按現有技術中描述的技術插入到重組腺病毒基因組的不同位點。首先可以插入在E1缺失處。還可以插入在E3區，添加新序列或替代原序列。該表述盒還可以處於缺失的E4區中。為了構建帶兩個表達盒的載體，可將一個表達盒插入在E1區中，另一個插入在E3或E4區中。這兩個表達盒也可以引入在同一個區域中。
為了實施本發明，可以按不同的方式配製含有表達系統的組合物。該組合物特別可以是無菌等滲鹽溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或這些鹽的混合物)或通過加入蒸餾水或生理血清能構成可注射液的幹組合物，特別是凍幹組合物。也可以使用其他的賦形劑，例如穩定化蛋白質(特別是人血清白蛋白FR 9603074)、泊洛沙姆或水凝膠。水凝膠可以用任何生物相容性無細胞毒聚合物(均聚或共聚)製備。這樣的聚合物例如描述在專利申請WO93/08845中。其中一些，特別是從環氧乙烷和/或環氧丙烷獲得的那些是商業化的。另外，當表達系統由質粒載體構成時，最好在組合物中加入一種或多種有利於基因轉移的化學或生化試劑。對此，可以特別舉出聚賴氨酸型陽離子聚合物(LKLK)n、(LKKL)n(如專利申請WO 95/21931中所述)、聚乙烯亞胺(WO 96/02655)和DEAE葡聚糖或陽離子脂質或脂轉染試劑。它們具有濃集DNA並促進其與細胞膜結合的特性。對於脂轉染試劑，可以舉出脂聚胺(脂轉染胺試劑、transfectam，如專利申請WO 95/18863或WO 96/17823中所述)，不同的陽離子或中性脂質(DOTMA、DOGS、DOPE等)，以及核源的肽(WO 96/25508)，它們可以是為了靶向某些組織而功能化的。利用這種化學載體製備本發明的組合物可以按本領域技術人員已知的任何技術進行，一般通過各成分的簡單接觸進行。
特別優選地，本發明中所用的表達系統由編碼一種神經營養因子的缺陷性重組腺病毒構成。更具體地講，該神經營養因子是NT3。在本發明的應用中，這些腺病毒最好以104-1014pfu、優選106-1010pfu的劑量形式配製和給藥。術語「pfu」(噬斑形成單位)相當於腺病毒溶液的感染能力，通過適當的培養細胞的感染和一般在15天後計量所感染細胞的空斑數來測定。病毒溶液的pfu滴度的測定技術在文獻中有充分描述。下述實施例特別顯著地表明，109和107的劑量可以(i)在切斷的神經元中有效地轉移基因，(ii)在所述神經元中持續地表達轉基因，及(iii)恢復軸突的連續性。
表達系統向套管中的引入可以按不同的方式進行，特別是通過注射器。優選用微注射器的注射(Hamilton或Terumo微注射器)。
本發明特別有意義的應用之一是刺激外周神經的再生長。這種治療方法用於各種病理狀況，特別是神經創傷或變性。該方法可用於任何外科手術可及的神經，特別是上肢的橈神經、尺神經、中神經、手指側神經和骨間神經，下肢的坐骨神經(出生時直徑約1cm)或股神經(直徑6-7mm)。
本發明另一特別有利的應用是在臂神經叢(直徑5-6mm)根部或脊髓中(由創傷造成損傷)水平恢復神經連續性。這種類型的損傷迄今未知任何治療方法。本發明方法可以在脊髓斷裂之下段和之上段之間造成一個橋，以連接主要神經束並再生神經連續性。對於這些應用，所用的套管優選具有可達到15-20mm的內徑。特別對於臂神經叢撕裂神經根的搭橋，套管的直徑相應於神經根的直徑。
本發明因而還涉及一種在神經損傷處局部持續地釋放神經營養物質的產品，其包括能橋連損傷上下部分的生物相容性套管，在該套管中引入了神經營養因子的表達系統。
本發明可用於在人體及動物中體內刺激神經再生。在動物中，本發明還可用於研究一種新營養因子(新蛋白、突變體等)的特性。為此，將動物的神經切斷，然後將待測因子的表達系統引入本發明的裝置中。如實施例所述的那樣測定所述因子恢復神經連續性的能力。該裝置還可以用於比較不同的因子，或研究不同因子的協同作用。
以下藉助於實施例更詳細地描述本發明，這些實施例應視為說明性質的而不是限制性的。


圖1描繪了本發明裝置在外周神經上的安置。
圖2在脊髓骶腰椎部分拍攝的顯微照片，顯示在脊髓運動神經元中大量產生β-半乳糖苷酶(由底物X-Gal揭示)。
圖3第12天組織再生長的宏觀狀態。(A)在對照動物中觀察到的實例，在神經分隔的遠近兩端間沒有觀察到任何組織連續性。(B)接受107pfu Ad-NT3注射的動物中支持管內容物的狀態。可以觀察到連接神經分隔遠近兩端的組織軸線的存在。
圖4在第12天觀察到的HRP反向標記的狀態。(A)在對照組中，觀察到有稀少的弱標記運動神經元。(B)在107pfu Ad-NT3治療組中，存在大量強標記的脊髓神經元。
圖5描繪本發明裝置在損傷之下外周傳入神經和損傷之上脊髓間的搭橋安置。
圖6描繪本發明裝置在脊髓中的安置。
圖7描繪在處理神經和安置本發明的裝置後隨時間觀察到的運動反應。
1方法1-1腺病毒載體如前文所述，病毒載體特別是腺病毒構成本發明的一種特別優選的實施方案。
所用的重組腺病毒按現有技術中描述的技術通過同源重組獲得。實際上，它是在293細胞中構建的，即通過線性化病毒基因組片段(dl 324)和含有左側ITR、衣殼化序列、轉基因及其啟動子和允許重組的病毒序列的質粒間的重組。這些病毒在293細胞中擴增。它們一般在我們的P3實驗室中再純化。病毒基因組還可以按專利申請WO 96/25506中描述的技術在原核細胞中製備。特別使用下列病毒-Ad-βGal衍生自Ad5血清型的缺陷性重組腺病毒，其含有(i)E1區的缺失，在此缺失處引入了一個表達盒，後者包含在勞氏肉瘤病毒LTR啟動子(稱為LTR-RSV或RSV)控制下的編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的核酸，和(ii)E3區的缺失。該腺病毒的構建已由Stratford-Perricaudet等報導(J.Clin.Invest.90(1992)626)。-Ad-NT3血清型Ad5的重組腺病毒，在其基因組中缺失的E1區處插入了NT3的表達盒，後者包含轉錄啟動子(特別是LTR-RSV)控制下的編碼NT3的cDNA。另一構建體包括在E4區中的額外缺失，如專利申請WO 96/22378中所述。-Ad-CNTF血清型Ad5的重組腺病毒，在其基因組中缺失的E1區處插入了CNTF的表達盒，後者包含轉錄啟動子(特別是LTR-RSV)控制下的編碼CNTF的cDNA。構建的詳細描述已在專利申請WO94/08026中給出。另一構建體包括在E4區中的額外缺失，如專利申請WO 96/22378中所述。-Ad-GDNF一種Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中缺失的E1區處插入了一個GDNF的表達盒，後者包括在轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼GDNF的cDNA。構建的詳細描述已在專利申請WO 95/26408中給出。另一構建體還在E4區中有缺失，如專利申請WO 96/22378中所述。-Ad-BDNF一種Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中缺失的E1區處插入了BDNF表達盒，後者包括轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼BDNF的cDNA。構建的詳細描述已在專利申請WO95/25804中給出。另一構建體還在E4區中有缺失，如專利申請WO96/22378中所述。-Ad-FGFa一種Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中缺失的E1區處插入了FGFa的表達盒，後者包括轉錄啟動子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼FGFa的cDNA。構建的詳細描述已在專利申請WO95/25803中給出。另一構建體還在E4區中有缺失，如專利申請WO96/22378中所述。
所構建病毒的功能通過感染培養的成纖維細胞來驗證。用ELISA在培養上清液中分析相應神經營養因子的存在和/或用神經元初級培養物揭示該上清液的營養特性。
可以理解，能夠獲得腺病毒衍生的其他構建物並用於本發明中，特別是帶有額外缺失和/或不同的啟動子和/或編碼其他神經營養因子的載體。1-2.外科手術過程動物由320-340g的Sprague-Dawley雄性大鼠(法國Iffa Credo-Les Oncins)構成。在全身麻醉下(腹膜內注射1mg/kg戊巴比妥-SanofiSantéAnimale)，在右後腿大腿處切口，分離肌肉層以暴露右坐骨神經。在窩和坐骨神經分離間的中點切斷神經，拿掉5mm的節段(圖1B)。拿出一個聚矽氧烷管形假器(長14mm，內徑1.47mm，壁厚0.23mm-Silastic，Dow Corning Corporation，美國)。將神經的近端引入該管中並用9/0尼龍縫線連結管和神經以將神經固定在位。在管和遠端神經間設置另一縫線，獲得神經兩端間10mm的缺失(在所用試驗條件下在大鼠中觀察到的外周神經自發再生的極限距離)(圖1c)。用纖維蛋白膠(Tissucol，Immuno AG，奧地利維也納)對近端接頭進行密封，然後用微注射器將10μl病毒溶液或對於對照動物的等滲鹽的溶液引入支持管中並與神經近端接觸(圖1D)。支持管的死體積用等滲鹽溶液(0.9％氯化鈉溶液)充滿，然後將神經的遠端也引入管形假器中，並用纖維蛋白膠保證該末端的密封性(圖1E)。分別用6/0和4/0尼龍標縫線重新縫合肌肉層和皮膚。將動物放在單個的籠中，保持在12h/12h的明/暗周期下。1-3.軸突再生和辣根過氧化物酶反向標記脊髓運動神經元的監控12天後，將動物全身麻醉後，重新暴露連接物，分離周圍的粘附物。在原神經切口近端下遊3mm處切割連接物之前觀察到存在組織連續性。所得「殘肢」用等滲鹽溶液清洗，然後充滿30％(w/v)的HRP溶液(Sigma Chemical，St Louis，MO，美國)。培養1小時後，棄去該溶液，用等滲鹽溶液清洗該神經末端，然後再縫合肌肉層和皮膚，將動物放回它們的籠中。40小時，再將動物麻醉、固定，用PBS清洗後用3.6％戊二醛心內灌注。然後解剖分離脊髓，在3.6％戊二醛中後固定3小時，再放在30％(w/v)蔗糖中48-72小時。通過35μm厚的系列縱向切割，冷凍切割脊髓的腰骶部分，按Mesulam(15)描述的常規技術用3，3 ′，5，5′-四甲基聯苯胺(Benzidine)顯示HRP的存在。1-4.β-半乳糖苷酶的檢測用底物X-Gal顯現了β-半乳糖蔗酶活性(14)。簡言之，將100μm厚的腰骶脊髓縱向切片在含有六氰合鐵酸鉀(4mM)，鐵氰化鉀(4mM)、X-Gal底物(0.4mg/ml)、氯化鎂(4mM)的PBS中37℃保溫18小時。保溫後將這些組織切片用PBS清洗，然後放在水性介質(明膠-甘油)中。2.顯示非複製性腺病毒被去軸突脊髓運動神經元反向轉運，驗證轉基因的表達。
該第一種研究得以證明去軸突神經元能夠進行腺病毒載體的反向轉運，並在可達4周的時間內表達一種轉基因。每管注射了109pfu的載體(在1-1中描述的β-半乳糖苷酶腺病毒)，在第4天、第14天和第4周檢測其轉基因的表達。
第4天在相當於支配坐骨神經之神經根的脊髓骶腰部分腹角處觀察到了β-半乳糖苷酶的強表達(圖2)。在第14天再次發現脊髓運動神經元的這種轉基因強表達，β-半乳糖苷酶陽性細胞平均總數為63.2±33.6，即感染效率為支配坐骨神經之脊髓神經元總數的約12.25％。在直達4周的時間內檢測到了脊髓骶腰區中β-半乳糖苷酶活性的存在，而標記強度降低(表1)。3.編碼神經營養蛋白(NT3)的載體對缺失10mm的大鼠坐骨神經軸突再生長的效果試驗。
由於這些結果證明可能使用體內基因治療類型的系統刺激去軸突後的神經再生長，我們試驗了帶編碼神經營養蛋白3轉基因的腺病毒(1-1中描述的Ad-NT3)對外周神經再生的作用。去軸突並用含107pfu載體或等滲鹽水的導向支管修復，12天後的結果表明只在用Ad-NT3處理的動物組中觀察到了組織連續性(圖3，表II)。HRP反向標記對已再生軸突通過導向支管的脊髓運動神經元數目的分析表明，這種組織連續性是由神經再生長構成的，平均182.3±76.5個HRP陽性神經元，而對照組為24.25±42.7個HRP陽性神經元(圖4，表II)。
從這些結果可以得出，使用帶神經營養因子編碼基因的複製缺陷性腺病毒載體的本發明裝置，可用於促進中樞及外周軸突的再生長。4.在大鼠中比較外周神經切斷後的功能恢復在成年大鼠坐骨神經上造成損傷以形成至少10mm的實質缺失。將損傷的近端和遠端部分用本發明的裝置連接(聚矽氧烷管，長14mm，內徑14.7mm-Silastic)，在其中引入了鹽水溶液、AV-RSVβGal(107pfu，10μl)、AV-RSVβNT3(107pfu，10μl)或NT3蛋白。通過肌電圖測定了功能恢復每兩周記錄一次腓腸肌中的運動反應(圖7)。
與其它組比較，在用AV-RSVNT3處理的組中觀察到了功能恢復。這種提高在112天的期間內與AV-RSVβGal組比較，在70天到112天的期間內與rNT3組比較都有滿意的顯著性。各自的肌電特性分析表明用AV-RSVNT3處理提高了給定動物啟動神經再生長的可能性。但是，當再生長已開始時，並不改變再生長速度。
這些結果表明用本發明中描述的技術對神經營養因子編碼基因的轉移對提高外周神經切斷後的功能恢復是有效的。
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表I編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒載體對去軸突運動神經元感染效力的測定

表II注射Ad-NT3第12天對軸突再生長的影響

N.D.未測定*在灌注過程中動物死亡
權利要求
1.用於刺激神經再生的裝置，其包括在其中已引入了神經營養因子表達系統的生物相容性套管。
2.用於刺激神經再生的藥盒，其包括生物相容性套管和含有神經營養因子表達系統的組合物。
3.其中引入了神經營養因子表達系統的生物相容性套管在製備用於刺激神經再生的組合物中的應用。
4.權利要求3的應用，是製備用於刺激外周神經再生的組合物。
5.權利要求3的應用，是製備用於刺激脊髓中軸突再生的組合物。
6.其中引入了神經營養因子表達系統的生物相容性套管在製備用於治療神經系統創傷性損傷的組合物中的應用。
7.用於在神經損傷處局部持續釋放神經營養物質的產品，它由可連接損傷上下部分的生物相容性套管構成，其中引入了一種神經營養因子表達系統。
8.根據權利要求3-6之一的應用，其特徵在於所述套管由無毒生物相容性材料的管形支持物構成。
9.根據權利要求3-6之一的應用，其特徵在於神經的第一段被引入在套管的一端並用縫線和/或膠固定，在套管中引入表達系統，然後將神經的第二段插入在套管的另一端並用縫線和/或膠固定。
10.根據權利要求3-6之一的應用，其特徵在於表達系統由含編碼所述神經因子之核酸的載體構成。
11.根據權利要求10的應用，其特徵在於載體是一種病毒載體。
12.根據權利要求11的應用，其特徵在於病毒載體是一種腺病毒載體。
13.根據權利要求10的應用，其特徵在於神經營養因子選自神經營養蛋白、神經因子、TGF-β、FGF和IGF家族的因子。
14.根據權利要求13的應用，其特徵在於神經營養因子選自BDNF、GDNF、CNTF、NT3、GFGa和IGF-1。
全文摘要
本發明涉及用於刺激神經再生的方法,其可應用於外周神經以及中樞神經系統,特別是脊髓的神經。本發明特別地使用一種包括其中引入了神經營養因於表達系統的生物相容性套管的系統。
文檔編號A61K48/00GK1251047SQ9880366
公開日2000年4月19日 申請日期1998年3月25日 優先權日1997年3月26日
發明者P·丘爾夫, F·萊瓦, M·塔迪 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司