納米孔裝置和用於核酸分析的方法

2023-05-28 04:57:36

專利名稱：納米孔裝置和用於核酸分析的方法
技術領域：
本發明涉及確定來自例如遺傳物質(諸如DNA)的核酸材料的信息的領域。特別地， 本發明涉及藉助納米孔裝置的快速核酸分析的領域。特別是，本發明涉及一種布置成與遺傳物質樣品協作的納米孔裝置，該納米孔裝 置包括
-用於容納核酸樣品的輸入室； -利用第一納米孔連接到輸入室的第一室；
-在第一納米孔兩端施加電勢差的裝置，該電勢布置成通過第一納米孔汲取遺傳物質 樣品的第一片段；
-能夠在電勢差影響下流動通過第一納米孔的電解溶液，該流動作為第一離子電流可 被檢測到，第一離子電流的變化表示由第一納米孔檢測到第一靶分子。
背景技術：
包括遺傳物質的核酸材料的結構和組成，特別是基因定序以及與特定疾病關聯的 基因標記的鑑定，變得越來越重要。在生物醫學和製藥工業以及關聯研究中，正更加重視精 確且迅速的信息收集。特別是，為了向定點照護應用提供遺傳信息，應快速地獲悉與疾病關 聯的遺傳方式或者對藥物治療的反應。正在發展多種方法和裝置來促進這一點。已經發現，生物傳感器元件能夠以單個鹼基的解析度來識別各個DNA鏈，鹼基為 用於在DNA中編碼信息的四種可能類型的分子(A、C、G或T)之一。特別是，利用了所謂的 納米孔。這些納米孔為薄層中以許多可能幾何形狀形成的典型地IOOnm或更小的開口。使 待定序的遺傳物質片段經過或者強制通過該開口。樣品形狀或者樣品分子與納米孔分子的 臨時結合導致各種鹼基的特性在檢測裝置中的配準，從而促進定序。在來源上，納米孔可以 是生物學的或合成的。每個納米孔對於所期望的檢測是特異的，且因此可以製成用於特定 基因序列(例如，與具體癌症突變關聯)或者用於SNP (單核苷酸多態性)(例如與麻醉或化 療中的藥物反應關聯)的檢測器。與當前定序裝置相比，納米孔的使用允許快速的檢測。美國專利申請2007/0054276討論了多聚核苷酸分析系統和納米孔分析的方法， 以及如何快速地確定核酸分子的序列以用於識別基因突變和多態性。它公開了以下納米孔 定序的構思，該納米孔定序基於物理檢測各個核苷酸的屬性，或者單個多聚核苷酸中的核 苷酸經過納米孔開口時核苷酸環境的物理變化(例如電流)。使用納米孔分析系統可以識別 SNP以測量改性的靶(target)多聚核苷酸的電子籤名(例如離子電流或隧穿電流)，改性和 未改性分子的電子籤名變得可區分。所使用的納米孔檢測系統包括電子設備，該電子設備 能夠測量納米孔檢測系統的結構中的納米孔開口與多聚核苷酸之間的相互作用的電子特 性。計算機系統控制電子測量並處理所產生的數據。每個單體的體積、形狀或電荷會按特 有的方式影響電導。電壓梯度施加到納米孔裝置從而將靶多聚核苷酸從開口的一側汲取到 另一側。來自同一申請人的美國專利申請2007/0048745進一步公開了用於聚合物的納米孔分析的裝置、系統和方法。J. Amer. Chem. Soc. 128 (2006) 1705和Nature Biotech 19 (2001) 636 中的 論文公開了利用經設計的(engineered)納米孔而使用生物納米孔來對單個DNA鏈進行序 列特定檢測。DNA鏈分子與納米孔中的分子的結合引起流過納米孔的離子電流的變化。當前工作集中於用於特異基因序列的納米孔檢測和讀出。裝置對樣品僅進行一種 特異測量。這些當前的裝置和方法的問題在於，採集多於一種靶序列的信息是緩慢的，需要 進行重複的測量。因而，本發明的目的是提供一種改進的裝置，該裝置能夠更快地提供更多的定序 fn息ο

發明內容
根據本發明，該目的通過下述設置來實現 -利用第二納米孔連接到輸入室的第二室，
-在該第二納米孔兩端施加的電勢差與該第一納米孔兩端的電勢差相等且相同 (equal to and common with),
-在該第二納米孔兩端的電勢布置成通過該第二納米孔汲取核酸樣品的第二片段並 且影響該電解溶液使其流動通過該第二納米孔，
-該流動作為第二離子電流可被檢測到，該第二離子電流的變化表示由該第二納米孔 檢測到第二靶分子。本發明允許將第二室結合到該納米孔裝置中。這允許同時進行兩種測量，因而更 快速地獲得定序信息。本發明的附加優點在於，該第二納米孔從與該第一納米孔相同的輸入室接收輸入 片段，因此由第一和第二納米孔處理的樣品來自相同的源並且沒有可能影響定序結果的老 化效應或其它處理差異。輸入到裝置的可能樣品的實例為多聚核苷酸，諸如是DNA、RNA或 uRNA。在某些情形中，例如對於活檢樣品，如果樣品必須分成兩半從而進行兩個不同的定序 檢測則是非常不利的。存在這樣的可能性，樣品的不同成分在這兩個半份之間可能沒有適 當地分布。用於兩種測量的單一樣品輸入消除了這種不精確性。然而，核酸樣品不限於天 然核酸。合成或人造的核酸也可以用作樣品。本發明的又一個優勢在於，在第一和第二納米孔兩端施加的電勢差相同。這種一 致性提高了裝置的功能性以及所獲得的測量結果的可靠性。經過每個納米孔的片段受到相 同的力，並且電解溶液在具有相似屬性的電場下以相同速率通過納米孔汲取。可以從相同的電壓源或者不同的電壓源施加該電勢差。電壓源可以在裝置內部或 外部。結合第一和第二室描述了本發明，但本發明不限於兩個室，因為可存在經由第三、 第四、第五或第η個納米孔(所有的納米孔均受到相同的電勢)連接到輸入室的第三、第四、 第五或第η個室。納米孔可以是生物學的或者合成的。每個納米孔按照定義設計成檢測特定靶分 子。(例如 Howorka、Cheley 和 Bayley 在 Nature Biotech 19 (2001) 636 中的論文討論了如何通過單獨DNA寡核苷酸的α溶血素孔的腔內的共價連接實現單鏈DNA(ssDNA)分子與 拴系(tethered) DNA鏈的結合)。納米孔的活性檢測成分例如可以是天然或人造核酸。然 而，在本發明中，取決於所使用納米孔裝置的應用情況，在各種室中使用的納米孔可以彼此 相同、彼此完全不同或者針對多種測量特定納米孔具有加權分布。生物納米孔和合成納米孔以不同方式協作從而改變離子電流的流動，離子電流的 變化記錄(register) 了檢測到樣品片段中存在靶分子。由於樣品片段和納米孔檢測分子 之間的結合，生物納米孔在檢測到靶分子時臨時地閉合(close)。該結合阻止電解溶液流過 納米孔，由此停止電荷流動並因此停止離子電流。合成納米孔典型地由諸如矽的襯底中的 經刻蝕形成的孔洞而形成，所述孔洞由於附連分子的物理存在而閉塞，該附連分子僅在檢 測到靶分子時存在。對於大範圍的實驗，已經證明生物孔是有用的，但是其表現出例如尺寸 固定和穩定性有限的一些缺點。諸如溫度和應力的外部因素可能觸發這種不穩定性。從固 態材料製作納米孔允許對納米孔的直徑和通道長度以及表面屬性有著更大的控制。輸入室和第一室之間的連接在上文中被描述為單一納米孔，但是應理解，通過多 個納米孔(所有納米孔同等地接入輸入室樣品片段)並行地形成的連接不應被排除。根據本發明的納米孔裝置布置成與核酸樣品協作。然而，納米孔裝置也能夠與其 它材料的樣品協作，所述其它材料包括但不限於蛋白質、肽、糖、糖脂、脂類以及合成聚合物 或分子。在本發明的上下文中，「樣品」可以來自生物來源。涵蓋生物流體，諸如淋巴液、尿 cerebral fluid)、Bronco Leverage Fluid (BAL)、ifiU夜、(
液。還涵蓋組織，諸如上皮組織、結締組織、骨頭、諸如內臟或平滑肌以及骨骼肌的肌肉組 織、神經組織、骨髓、軟骨、皮膚、黏膜或毛髮。在本發明的上下文中，「樣品」也可以是取自環境來源的樣品，諸如植物樣品、水樣 品、土壤樣品，或者可以取自家庭或工業來源或者也可以是食物或飲料樣品。在本發明的上下文中，「樣品」也可以源於生物化學或化學反應的樣品，或者源於 製藥、化學或者生物化學組成的樣品。樣品的數量優選地為ΙΟΟΟμΙ或更少，更優選地500μ1或更少，甚至更優選地100μ1 或更少，最優選地50μ1或更少。在適當情況下，例如對於固體樣品或粘稠懸浮液的情形，在本發明中使用之前，樣 品可能需要用溶劑溶解、均質化或萃取從而獲得液體樣品。液體樣品因此可以是溶液或懸 浮液。在本發明中使用之前，液體樣品可以進行一種或多種預處理。這種預處理包括但 不限於稀釋、過濾、離心處理、預濃縮、沉澱、透析、溶菌、洗脫、萃取和析出。預處理也可以包括將例如下述化學或生物化學物質添加到溶液酸、鹼、緩衝劑、 鹽、溶劑、反應性染料、清潔劑、乳化劑、螯合劑、酶、離液劑。納米孔檢測裝置可以應用於許多環境，不過尤其用於
-已知序列的定量檢測，所謂的「無PCR」檢測(PCR為聚合酶鏈反應)，其中感興趣的數 據是所存在的某種核苷酸序列或基因的數量並且納米孔設置成檢測該特定序列。- SNP (單一核苷酸多態性)檢測，其中納米孔布置成檢測序列中的突變。-定序，其中最終目標是確定核酸的鹼基對序列。
在本發明另一實施例中，納米孔裝置進一步包括利用第三納米孔連接到該輸入室 的第三室，在該第三納米孔兩端施加的電勢差與在該第一納米孔兩端施加的電勢差相等且 相同，在該第三納米孔兩端施加的電勢布置成通過該第三納米孔汲取該核酸樣品的第三片 段並且影響該電解溶液使其流動通過該第三納米孔，該流動作為第三離子電流可被電流檢 測器檢測到，該第三離子電流的變化表示檢測到用於驗證裝置測量的控制靶分子。對於某些類型的樣品片段，某些序列或者總是存在或者總不存在。為了測量這種 序列或者確認它們的存在，給出正或負指示劑以支持對樣品片段進行其它測量。這提高了 整體測量結果的質量。在本發明另一實施例中，關聯裝置布置成關聯由至少兩個離子電流的變化表示的 檢測。每個離子電流代表檢測到特定靶分子。納米孔裝置可以布置成利用不同納米孔來 檢測若干不同靶分子。然而，如果這些檢測與另一分子的檢測相關聯地發生，則單獨分子的 檢測會更有意義或更感興趣。因而通過關聯離子電流的變化，可以提取額外的信息。其實例為，隨時間將第一和第二離子電流之間的變化關聯以確定與正常基因序列 相比突變出現的頻率。例如在腫瘤學領域，這將是有意義的。關聯裝置也可用於將正或負指示劑的檢測(例如第三離子電流)與樣品檢測(例如 第一和/或第二離子電流)進行比較，從而確定有效裝置功能性。在本發明另一實施例中，該第一靶分子為選定的野生型基因序列並且該第二靶分 子為同一基因序列中的特異突變，用於突變的統計學出現的相對檢測。這是該裝置的具體實施例，其涉及研究兩種類型的DNA，這對於在癌症治療中發展 新策略是重要的。待分析的基本樣品包括野生及突變的至少兩種類型DNA。突變樣品可包 括諸如核苷酸的SNP (單一核苷酸多態性)、刪除或插入之類的突變。本發明的裝置可用於 對這些物質在樣品中出現的平衡進行簡單的定量檢測。可以分析特異突變基因(例如腫瘤 抑制基因或致癌基因)在癌細胞群落中出現的範圍。這在確定治療決策中將是非常重要的 診斷工具，並允許個性化處理——例如突變基因可以是經過驗證的藥物靶，或者在手術中 無癌細胞的切除邊緣將被確定。特別地，當與第一和第二靶分子(分別為野生和突變DNA)的檢測的關聯相組合時， 野生型樣品片段的10個結合事件可以僅對應於突變樣品片段的3個結合事件。通過在例 如1小時的時間段上關聯所述檢測來研究該信息，隨後將促成這樣的結論所研究樣品的 3/13或大約23%含有缺陷的突變材料。該數字對於臨床決策將是有意義的。在本發明另一實施例中，至少一個納米孔為生物納米孔。
在本發明另一實施例中，生物納米孔布置成與脂雙層協作。根據本發明的一種基於生物納米孔的方法將可應用於小型定序裝置，尤其用以在 定點照護進行簡單、快速且不昂貴的突變檢測。在本發明另一方面中，提供了一種製造納米孔裝置的方法，該方法包括下述步 驟
一提供用於容納核酸樣品的輸入室；
一提供利用第一納米孔連接到該輸入室的第一室；
一提供在電勢差影響下能夠流動通過該第一納米孔的電解溶液；一提供在該第一納米孔兩端施加電勢差的裝置； 一提供藉助第二納米孔連接到該輸入室的第二室，以及
一布置所述裝置，以在該第二納米孔兩端施加與在該第一納米孔兩端的電勢相等且相 同的電勢差。本發明允許將第二室結合到納米孔裝置中。這允許同時進行兩個測量，由此更快 地獲得定序信息。本發明的優點在於，在第一和第二納米孔兩端施加的電勢差相同。這種一致性提 高了裝置的功能性以及所獲得的測量結果的可靠性。經過每個納米孔的片段受到相同的 力，並且電解溶液在具有相似屬性的電場下以相同速率通過納米孔汲取。可以從相同的電壓源或者不同的電壓源施加該電勢差。電壓源可以在裝置內部或 外部。結合第一和第二室描述本發明，但本發明不限於兩個室，因為可存在經由第三、第 四、第五或第η個納米孔(所有的納米孔均受到相同的電勢)連接到輸入室的第三、第四、第 五或第η個室。納米孔可以是生物學的或者合成的。每個納米孔按照定義設計成檢測特定靶分 子。納米孔的活性檢測成分例如可以是天然或人造核酸。然而，在本發明中，取決於納米孔 裝置所使用的應用情況，在各種室中使用的納米孔可以彼此相同、彼此完全不同或者針對 多種測量的特定納米孔具有加權分布。對於大範圍的實驗，已經證明生物孔是有用的，但是其表現出例如尺寸固定和穩 定性有限的一些缺點。諸如溫度和應力的外部因素可能觸發這種不穩定性。從固態材料制 作納米孔允許對納米孔的直徑和通道長度以及表面屬性有著更大的控制。輸入室和第一室之間的連接在上文中被描述為單一納米孔，但是應理解，通過多 個納米孔(所有納米孔同等地接入輸入室樣品片段)並行地形成的連接不應被排除。在本發明另一方面中，提供了一種使用納米孔裝置的方法，其中藉助該第一納米 孔檢測野生基因序列並且藉助該第二納米孔檢測所述基因序列的特異突變。這是該裝置的具體實施例，其涉及研究兩種類型的DNA，這對於在癌症治療中發展 新策略是重要的。待分析的基本樣品包括野生及突變的兩種類型DNA，且本發明的裝置可以 用於對這些物質在樣品中出現的平衡進行簡單的定量檢測。可以分析特異突變基因(例如 腫瘤抑制基因或致癌基因)在癌細胞群落中出現的範圍。這在確定治療決策中將是非常重 要的診斷工具，並允許個性化處理——例如突變基因可以是經過驗證的藥物靶，或者在手 術中無癌細胞的切除邊緣將被確定。在本發明的另一方面中，提供了一種方法，其關聯由第一或第二離子電流以及第 三離子電流至少之一的變化表示的檢測以產生表示有效裝置測量的信號。關聯裝置也可用於將正或負指示劑的檢測(例如第三離子電流)與樣品檢測(例如 第一和/或第二離子電流)進行比較，從而確定有效裝置功能。對於某些類型的樣品片段，某些序列或者總是存在或者總不存在。為了測量這種 序列或者確認它們的存在，給出正或負指示劑以支持對樣品片段進行其它測量。這提高了 整體測量結果的質量。在本發明另一方面中，提供了一種方法，其關聯由至少兩個離子電流的變化表示的檢測以產生離子電流之間的比較關係。這樣的實例為，隨時間將第一和第二離子電流之間的變化關聯以確定與正常基因 序列相比突變出現的頻率。例如在腫瘤學領域，這將是有意義的。舉例而言，當與第一和第二靶分子(分別為野生和突變DNA)的檢測的關聯相組合 時，野生型樣品片段的10個結合事件可以僅對應於突變樣品片段的3個結合事件。通過在 例如1小時的時間段上關聯所述檢測來研究該信息，隨後將促成這樣的結論所研究樣品 的3/13或大約23%含有缺陷的突變材料。該數字對於臨床決策將是有意義的。


現在將參考附圖進一步闡述本發明。圖1說明根據本發明的納米孔裝置。圖2說明包括對裝置測量的有效性進行控制的裝置的本發明另一實施例。圖3說明包括多個室的本發明另一實施例。圖4說明其中多個室布置成陣列形式的本發明另一實施例。圖5說明製造根據本發明的納米孔裝置的方法。圖6說明使用根據本發明的納米孔裝置的方法。對於附圖之間一致的特徵，附圖標記的編號保持一致。
具體實施例方式圖1描繪根據本發明的納米孔裝置100。該裝置包括用於將核酸材料的樣品(未 示出)輸入到輸入室120的樣品輸入110，該核酸材料的樣品諸如是DNA、RNA或uRNA，其被 製備成小片段(未示出)。對於DNA，這些小片段具有負電荷。輸入室120布置成經由第一 納米孔135連接到第一樣品室130且經由第二納米孔145連接到第二樣品室140。納米孔 135、145進一步包括特異檢測分子(未示出)，該特異檢測分子針對納米孔的所需要的檢測 功能被定製。電解溶液(未示出)存在於室120、130、140中且包括帶電顆粒。施加電勢差的 裝置150布置成使得納米孔135、145 二者的兩端存在電勢差。(施加電勢差的這個裝置在 此處被示為位於納米孔裝置100內部，但是這不應解讀為是限制性的，因為如果需要，也可 以使用外部裝置)。第二納米孔145兩端的電勢差與第一納米孔135兩端的電勢差相等且 相同。電勢差的效果是通過納米孔135、145汲取電解溶液的離子，且也單獨地通過納米孔 135、145汲取樣品的小片段。通常，對於DNA，樣品片段帶負電荷，這導致施加電勢的裝置以 這樣的方式布置納米孔135、145的輸入室120側處於地電勢且納米孔的第一室130和第 二室140側處於正電勢，從而在正確方向上(此處由箭頭160和165指示)通過納米孔135、 145汲取帶電樣品。(然而，這只是施加電勢的裝置的可能布置的一種實例。將理解，可以按 其它方式實現負到正電壓降，這取決於待分析的樣品，反向電勢會是合適的)。當通過每一 個納米孔135和145汲取電解溶液時，產生離子電流。因而通過第一納米孔135的流動形 成第一離子電流，通過第二納米孔145的流動形成第二離子電流。利用納米孔135、145對 靶分子的檢測引起該離子電流的變化。對於DNA定序的當前實例，生物納米孔在檢測時將 臨時閉合，由此阻斷電解溶液的流動且臨時停止離子電流。該離子電流和流動停止由一種 用於電流檢測的裝置(未示出)來檢測。
樣品輸入室120的共同性允許在同一時間段內對同一樣品進行不同的測量和檢 測。這對於測量結果的一致性是有益的，並且避免了分離樣品的問題，分離樣品會影響靶分 子在樣品中的統計分布。此外，相同電勢差的施加確保了由不同納米孔進行的不同測量是 在相同外部條件下進行的。這有助於通過納米孔裝置確定的數據的可靠性和精確性。注意，輸入室120以及第一室130和第二室140在圖1中示為在布局上是線性和 二維的且在形狀上呈方形。這不應解讀為是限制性的，因為取決於納米孔裝置100的要求， 本發明允許任意形狀的室120、130、140且還允許室以三維布置。圖2示出包括納米孔裝置200的本發明另一實施例。該裝置為納米孔裝置100的 延伸且包括與該裝置相同的特徵。然而，通過添加第三室210來增大納米孔裝置200，第三 室210利用第三納米孔220連接到輸入室120。該納米孔允許沿箭頭230的方向的電解溶 液(未示出)的流動以及樣品片段(未示出)的通過。(同樣，這是針對如圖1中所描述特定樣 品的方向，並且對於納米孔裝置200，不應解讀為是限制性的)。納米孔220按與前述納米孔 135、145相同的方式操作，並且形成用於檢測的第三離子電流。在此實施例中，第三納米孔220包括檢測分子或機制以檢測總是存在於樣品片段 中而與基因突變無關的特定序列。因而該納米孔記錄了經過該納米孔的每個樣品片段通過 的檢測。這給出正結果，該正結果可以用作納米孔裝置200的功能的有效性檢查。該結果 可以被輸入到關聯裝置(未示出)，用於與來自其它納米孔135、145的檢測進行計算比較。這種使用第三室設置的有效性檢查不局限於正測量結果。取決於納米孔裝置200 的應用，第三納米孔220也可以被設計以檢測其中預期是負檢測結果的序列。同樣，室130、140、210的形狀不限於所說明的形狀和設計，並且布局可以以二維 或三維形式布置。圖3說明本發明的另一可能實施例，其中納米孔裝置300包括在中央輸入室320 周圍的多個室 311、312、313、314、315、316、317、318。每個室 311、312、313、314、315、316、 317、318獨立於其它室，但是每個室利用納米孔連接到輸入室320，分別為每個室提供了單 一納米孔341、342、343、344、345、346、347、348。(本發明不應解讀為限制於此處或在任何其 它實施例中示出的單一納米孔，而是可以布置成具有並行的多個納米孔開孔以將每個室連 接到輸入室)。納米孔341、342、343、344、345、346、347、348受到相同的電勢差，並且布置成 以相同方式操作，如前文所述。(施加電勢差的裝置未示出)。經由流過納米孔(未示出)的 電解溶液，對於每個納米孔產生離子電流，該離子電流被檢測，並且這些電流的變化表示檢 測到樣品中的靶分子(未示出)。圖4描繪納米孔裝置400包括陣列405的本發明的另一實施例，其中陣列405包 括各個室 410、411、412、413、414、415、416、417、418，每個室分別經由納米孔 420、421、422、 423、424、425、426、427、428而遠程連接到具有樣品輸入440的輸入室430。相同的電勢差布 置成從施加電勢的相同裝置(未示出)施加於納米孔420、421、422、423、424、425、426、427、 428兩端。納米孔裝置400進一步包括連接裝置以將樣品從輸入室分別引導至各個室410、 411、412、413、414、415、416、417、418，該連接裝置在此處示為各個導管 450、451、452、453、 454、455、456、457、458、459，但是不限於此特定實施例。納米孔的操作以及與該操作(例如 離子電流檢測)關聯的裝置如先前所描述。陣列405可以被支持在襯底(未示出)上，該陣 列也可包括引導輸入430和室410、411、412、413、414、415、416、417、418之間的樣品流動的裝置(未示出)。圖5說明一種用於製造根據本發明的納米孔裝置的方法。該方法涉及提供用於 容納核酸樣品的輸入室510，提供利用第一納米孔連接到輸入室的第一室520，提供在電勢 差影響下能夠流動通過第一納米孔的電解溶液530，提供在第一納米孔兩端施加電勢差的 裝置M0，提供藉助第二納米孔連接到輸入室的第二室550，以及布置所述裝置，以在該第 二納米孔兩端施加與在該第一納米孔兩端的電勢相等且相同的電勢差560。圖6說明根據本發明的納米孔裝置的方法。該方法涉及藉助該第一納米孔檢測野 生基因序列610以及藉助該第二納米孔檢測所述基因序列的特異突變620。這種方法對於確定樣品中突變基因的定額是尤為重要的，該定額可以表示具體癌 症疾病的進展或者表示個性化護理的最佳處理。附圖標記列表 100納米孔裝置 110樣品輸入
120輸入室
130第一室
135第一納米孔
140第二室
145第二納米孔
150施加電勢差的裝置
160表示在電勢差影響下第一樣品片段移動通過第一納米孔的方向的箭頭 165表示在電勢差影響下第二樣品片段移動通過第二納米孔的方向的箭頭 200納米孔裝置 210第三室 220第三納米孔
230表示在電勢差影響下第三樣品片段移動通過第三納米孔的方向的箭頭
300納米孔裝置
311…318第一至第八室
320輸入室
330樣品輸入
341…348第一至第八納米孔 400納米孔裝置 405陣列
410…418第一至第九室
420至428第一至第九納米孔
430輸入室
440樣品輸入
450第一至第九導管
510方法步驟
520方法步驟530方法步驟540方法步驟550方法步驟560方法步驟610方法步驟620方法步驟。
權利要求
1.一種納米孔裝置(100)，布置成與核酸樣品協作，該納米孔裝置包括 -用於容納該核酸樣品的輸入室(120);-利用第一納米孔(135)連接到該輸入室的第一室(130)；-在該第一納米孔(135)兩端施加電勢差的裝置(150)，該電勢布置成通過該第一納 米孔(135)汲取(160)該核酸樣品的第一片段；-能夠在該電勢差影響下流動通過該第一納米孔(135)的電解溶液，該流動作為第一 離子電流可被檢測到，該第一離子電流的變化表示由該第一納米孔(135)檢測到第一靶分 子；其特徵在於，該納米孔裝置進一步包括 -利用第二納米孔(145)連接到該輸入室的第二室(140)；-在該第二納米孔(145)兩端施加的電勢差與該第一納米孔(135)兩端的電勢差相等 且相同；-在該第二納米孔(145)兩端的電勢布置成通過該第二納米孔(145)汲取(165)該核 酸樣品的第二片段並且影響該電解溶液使其流動通過該第二納米孔(145)；-該流動作為第二離子電流可被檢測到，該第二離子電流的變化表示由該第二納米孔 (145)檢測到第二靶分子。
2.如權利要求1所述的納米孔裝置(200)，進一步包括利用第三納米孔(220)連接到 該輸入室(120)的第三室(210)，在該第三納米孔(220)兩端施加的電勢差與在該第一納米 孔(135 )兩端施加的電勢差相等且相同，在該第三納米孔(220 )兩端施加的電勢布置成通 過該第三納米孔(220)汲取(230)該核酸樣品的第三片段並且影響該電解溶液使其流動通 過該第三納米孔(220)，該流動作為第三離子電流可被電流檢測器檢測到，該第三離子電流 的變化表示檢測到用於驗證裝置測量的控制靶分子。
3.如權利要求1或2所述的納米孔裝置(100)，進一步包括關聯裝置，該關聯裝置布置 成關聯由至少兩個離子電流的變化表示的檢測。
4.如上述權利要求中任意一項所述的納米孔裝置(100)，其中該第一靶分子為選定的 野生基因序列並且該第二靶分子為同一基因序列中的特異突變，用於突變的統計學出現的 相對檢測。
5.如上述權利要求中任意一項所述的納米孔裝置(100)，其中至少一個納米孔為生物 納米孔。
6.如權利要求5所述的納米孔裝置，其中該生物納米孔布置成與脂雙層協作。
7.一種製造納米孔裝置的方法，包括下述步驟 提供用於容納核酸樣品的輸入室(510)；提供利用第一納米孔連接到該輸入室的第一室(520)；提供在電勢差影響下能夠流動通過該第一納米孔的電解溶液(530)；提供在該第一納米孔兩端施加電勢差的裝置(540)；其特徵在於該方法進一步包括下述步驟提供藉助第二納米孔連接到該輸入室的第二室(550)，以及布置所述裝置，以在該第二納米孔兩端施加與在該第一納米孔兩端的電勢相等且相同 的電勢差(560)。
8.一種使用如權利要求1所述的納米孔裝置的方法，包括下述步驟 藉助該第一納米孔檢測野生基因序列(610)；藉助該第二納米孔檢測所述基因序列的特異突變(620)。
9.一種使用如權利要求2所述的納米孔裝置的方法，包括下述步驟關聯由該第一或第二離子電流以及該第三離子電流至少之一的變化表示的檢測以產 生表示有效裝置測量的信號。
10.一種使用如權利要求1或2所述的納米孔裝置的方法，包括下述步驟關聯由至少兩個離子電流的變化表示的檢測以產生離子電流之間的比較關係。
全文摘要
描述了一種納米孔裝置，其中提供了樣品輸入(110)、輸入室(120)以及經由第一和第二納米孔(135、145)連接到輸入室(120)的第一和第二樣品室(130、140)。
文檔編號G01N15/12GK102099668SQ200980127789
公開日2011年6月15日 申請日期2009年2月17日 優先權日2008年7月17日
發明者範德斯託爾佩 A., J. A. 範萬魯伊 E., 麥克庫 E., J. 範德扎格 P. 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司