蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用的製作方法
2023-05-27 22:07:46
專利名稱：蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及細菌及其應用，具體是指蛭弧菌在消除海產品及其養 殖水體中致病性弧菌的應用，特別適用於消除海產品食用或加工前、運輸過程及其養殖水 體中的常見食物中毒弧菌。
背景技術：
致病性弧菌是引起人類海產品食物中毒最為常見的病原菌，常存在於海產品貝、魚的 體表和體內中，在食物中毒中佔有相當大的比率，主要引起急性胃腸炎，特別是副溶血弧 菌(Vibrioparahaemolyticus)等，其致病性強，發病急，傳播快，感染源多，在人群中流 行的持續時間長。
已有研究表明，約有9種常見弧菌可引發人類食物中毒。副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、河弧菌(V.fluvialis)等能引起胃腸炎，而創傷弧菌(V. vulnificus)、 溶藻弧菌(V. alginolyticus)、擬態弧菌(V.mimicus)、辛辛那提弧菌(V. cincinnatiensis)
等引起傷口感染和敗血症腸道外感染。近些年，由這些致病性弧菌所引起的腸道疾病、傳 染病和食物中毒發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，均超過沙門氏菌食物中毒，躍 居細菌性食物中毒事件的首位，成為影響食品安全的重要因素，引起廣泛的關注。為此， 世界各國對海產品的進出口及食品衛生檢疫中的弧菌含量都有相當嚴格的規定。如何快
速、準確的檢測出食品中弧菌，如何清除弧菌進而預防由其引起的食源流行性疾病成為近 年來研究的熱點。如今己有一套較成熟的弧菌檢測方法，但檢測發現有弧菌該如何消除之， 則仍沒有一套有效的消除方法，僅美國一名學者曾研究過應用蛭弧菌於消除食品中病源 菌，闡明蛭弧菌在食品衛生安全方面的應用價值。隨著生物技術的發展，釆用適當的生物 淨化因子以清除海產品中食源性致病弧菌，將是未來有效預防由其所引發的腸道疾病、傳 染病及食物中毒的趨勢。
而海產品是其食源性感染最為重要的傳播媒介，人多因食用汙染細菌而又未經良好加 工的海產品而引起食物中毒。海產品所攜帶的致病性弧菌，除了引發人類食物中毒外，也
可引發海產品本身在養殖期間的病害問題。為了控制魚類弧菌病害，養殖r家不得不使用 抗生素，如此又導致漁藥的殘留。藥物的殘留以及弧菌的超標，給我國水產品的出口帶來 了障礙。
如果能在海產品被食用或加工前、甚至在養殖期間先進行致病性弧菌的消除工作，則 一方面可以減少或消除食物中毒的機率，減少或消除藥物殘留的可能，提高產品質量安全 係數，保護消費者的健康，另一方面也可為海產品的加工提供優質原材料和加工上的便利， 為出口創匯提供強有力的保障。如此既能避免每年所發生的眾多的海產品食物中毒事件， 又可為順暢的國際貿易護航。
處理海產品的工作，在國內，目前主要集中在檢測方法和技術的研發上，在國外，除 了在檢測方法和技術的研究外，也剛開始應用各種物理或化學手段以減少或消除海產品所 攜帶的病菌。
對於致病性弧菌的清除，目前國內外均仍然採用物理或化學藥物的方法，但物理或化 學藥物的方法均存在較明顯的缺點，而且還只能應用於食品的加工過程，難以擴展到海產 品的養殖過程，而研究生物的方法清除食用海產品及其養殖水體中致病性弧菌，就能為"從 養殖到餐桌"的全過程提供一種安全有效的新技術。
發明內容
本發明的目的在於克服上述現有技術存在的不足，通過開發適合於海產品致病性弧菌 的生物消除技術，提供一種蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用。 為了達到上述目的，本發明的主要技術方案如下
蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用，應用方法包括以下具體歩驟 及其條件
歩驟一蛭弧菌的分離純化
對採集的海水或底泥進行預處理，接種增殖蛭弧菌的副溶血弧菌，倒雙層平板，在含 宿主菌的雙層平板上出現噬菌斑，挑取不斷擴大的單斑，再按微生物學方法液體增殖培養、 雙層平板檢驗，再次挑取不斷擴大的單斑，並重複若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大 小、透明度均一致的噬菌斑為一株蛭弧菌純菌株，按同一時間內單斑大小計，可分離出2 株蛭弧菌純菌株，所述蛭弧菌於2008年1月13日在位於中國武漢市武漢大學內的中國典
型培養物保藏中心保藏，Scfe〃oW6ho w.BDJOl保藏編號為CCTCC NO: M 208011和 5&〃oW^/0取BDJ02保藏編號為CCTCC NO: M 208012。
步驟二蛭弧菌濃縮液的製備
將2株蛭弧菌分別進行發酵培養，分別製成濃度為10" (^pfu/ml的蛭弧菌濃縮 液，待用；
步驟三蛭弧菌在消除海產品食用前及其養殖水體中致病性弧菌的應用
在汙染了致病性弧菌的食用海產品和/或其養殖水體中加入步驟二製備的蛭弧菌濃 縮液，使蛭弧菌的濃度至少達到102pfu/ml。
所述應用方法採用2株蛭弧菌混合使用或分別獨立使用，2株蛭弧菌混合使用效果更佳。
所述應用方法特別適用於消除食用或加工前海產品攜帶的致病性弧菌，應用時蛭弧菌
最佳濃度範圍為104 1012pfu/ml。
所述應用方法還適用於消除海產品運輸過程中的致病性弧菌，應用時蛭弧菌最佳濃度 範圍為13 10"pfu/ml。
所述應用方法還適用於消除海產品養殖水體中的致病性弧菌，應用時蛭弧菌最佳濃度 範圍為102-106pfu/ml。
所述致病性弧菌是指副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫 氏弧菌、辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌和河弧菌。
本發明與現有技術相比具有如下優點
1、 本發明蛭弧菌在消除海產品攜帶的致病性弧菌的應用效果顯著
本發明蛭弧菌在消除海產品食用或加工前、運輸過程及其養殖水體中致病性弧菌的應 用效果顯著，以牡蠣、南美白對蝦和鱸魚為例，如圖1至圖9所示，致病性弧菌均有較高
的消除率。特別是2株蛭弧菌混合使用時，消除率均達99%以上。
2、 在食用前用蛭弧菌消除海產品中致病性弧菌安全性好
蛭弧菌消除海產品中致病性弧菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主細菌 的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環境中致病菌的生物淨化因子，且其在裂解完 宿主細菌後，會因飢餓而自動消亡，因此對人和動物無毒副作用。不僅可提高消費者生食 海產品的安全係數，保護消費者的健康，也為海產品的綠色加工生產提供保障。
3、 將本發明應用於海產品運輸過程中，方便、安全且效果好
海產品在運輸過程中採用蛭弧菌來消除致病菌可防止水質惡化、提高存活率，特別有 利於減少或消除化學藥物如抗生素的殘留，確保海產品的優質。
4、 適合推廣應用於海產品的養殖過程
在養殖期間即進行致病性弧菌的消除工作，特別有利於減少或消除化學藥物如抗生素 的殘留，確保海產品的優質，從根本上避免海產品食物中毒事件的發生，為出口創匯提供 強有力的保障。蛭弧菌對海產品養殖水體中致病性弧菌的消除試驗的效果如圖8、圖9所 示，養殖水體中致病性弧菌也可控制在10cfu/ml以內。
5、本發明為消除海產品所攜帶的食源性致病性弧菌提供一種新的方法，並適合推廣 應用於海產品食用、加工前的預處理、運輸過程及其養殖全過程，特別有利於減少或消除 化學藥物如抗生素的殘留，確保海產品的優質，從根本上避免海產品食物中毒事件的發生， 為出口創匯提供強有力的保障。
圖1為施用1株蛭弧菌(BDJ01)處理食用前牡蠣、南美白對蝦和鱸魚時，副溶血弧 菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌濃度對數值-時間圖2為2株蛭弧菌合用處理食用前牡蠣、南美白對蝦和鱸魚時，副溶血弧菌、溶藻弧 菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌濃度對數值-時間圖3為2株蛭弧菌合用處理食用前牡蠣、南美白對蝦和鱸魚時，辛辛那提弧菌、哈維 氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌濃度對數值-時間圖4為施用1株蛭弧菌(BDJ02)處理運輸過程中牡蠣、南美白對蝦和鱸魚時，辛辛 那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌濃度對數值-時間圖5為2株蛭弧菌合用處理運輸過程中牡蠣、南美白對蝦和鱸魚時，副溶血弧菌、溶 藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌濃度對數值-時間圖6為2株蛭弧菌合用處理運輸過程中牡蠣、南美白對蝦和鱸魚時，辛辛那提弧菌、 哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌濃度對數值-時間圖7為1株蛭弧菌(BDJ01)用於牡蠣、南美白對蝦和鱸魚養殖水體時，溶藻弧菌、 副溶血弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌、擬態弧菌濃度對數值-時間圖8為2株蛭弧菌合用於牡蠣、南美白對蝦和鱸魚養殖水體時，副溶血弧菌、溶藻弧 菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌濃度對數值-時間圖9為2株蛭弧菌合用於牡蠣、南美白對蝦和鱸魚養殖水體時，辛辛那提弧菌、哈維 氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌濃度對數值-時間圖。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明作進一步地詳細說明，但實施方式並不僅限於此，所述副 溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌、辛辛那提弧菌、哈 維氏弧菌、創傷弧菌和河弧菌等致病性弧菌同時出現均有效，但為實驗結果及圖表數據表 達清晰，九種常見致病性弧菌採用任意幾種組合的表達。
實施例1
蛭弧菌在消除食用前海產品攜帶的致病性弧菌的應用，海產品以牡蠣、南美白對蝦和
艫魚為例，應用方法包括以下具體步驟及其條件 步驟一蛭弧菌的分離純化
對採集的海水或底泥進行預處理，接種增殖蛭弧菌的副溶血弧菌，倒雙層平板，在含 宿主菌的雙層平板上出現噬菌斑，挑取不斷擴大的單斑，再按微生物學方法液體增殖培養、 雙層平板檢驗，再次挑取不斷擴大的單斑，並重複若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大 小、透明度均一致的噬菌斑為一株蛭弧菌純菌株，按同一時間內單斑大小計，分離出蛭弧 菌純菌株。
可分離出2株蛭弧菌純菌株，並命名其為BDJ01菌株和BDJ02菌株；進行特異性16S rRNA基因的PCR擴增反應和基因測序，獲得其部分序列分別為8Ubp禾D 774bp，其 GenBank登陸號(accession number)分別為EF011103和EF094471:
菌株BDJ01
LOCUS BDHSH06 16S 811 bpGenBank accession number: EF011103
ORIGIN 5，
1 CAAGTCGAACCGAGAAANGCCNTTNCGGGG TGGAGTACAG TGGCGCACGG GTGAATAACG
61 CGTAGGTGAC GTGCCTTTTA GTGGGGGACA ACATCGGGAA ACCGGTGCTA ATACCGCATA
121 AGTTAAGCGA CATTGAAAAA GCTTAAGAAA GTGGGCTTCG GCTCACGCTG AAAGATCGGC
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421 TAGTGTTTGA CGGTACCATA GAAGAAAGCA CCGGCTAACT CCGTGCCAGC AGCCGCGGTA
GTTCGGATTT ACTGGGCGTA
CGGGGCTCAA CCCCGAAACT
GGAATTTCAC GTGTAGGGGT
GCCTGCCTGG ATGAGCACTG
TACCCTGGTA GTCCACGCCG
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721 GGGGAGCAAA CAGGATTAGA TAAACGATGA GTACTAGCCC
781 TTGGAGTATG CCCCCNCCCC CNGGNACGAA A 菌株BDJ02
LOCUS BDH12 16S 774 bp GenBank accession number: EF094471
ORIGIN 5'
1 gtggcgcacg nntnantaac gcgtaggtga cgtgcctttt agtgggggac aacatcggga 61 aaccggtgct aataccgcat aagttaagcg acattgaaaa agcttaagaa agtgggcttc 121 ggctcacgct gaaagatcgg cctgcgtatc attagcttgt tggtggggta acggcctacc 181 aaggctacga tgattaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg 241 tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatattgcgc aatgggggaa accctgacgc 301 agcaatgcca cgtgagtgag gaaggccctt gggttgtaaa gctctgtcct atgggaagaa 361 ctgcattacg gttaataccc gtagtgtttg acggtaccat agaagaaagc accggctaac 421 tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 481 aaagcgcgcg caggcggatt ggcaagtcag atgtgaaatc tcggggctca accccgaaac 541 tgcgtctgaa actatcagtc tagagtctca tagggggcag gggaatttca cgtgtagggg 601 taaaatccgt agagatgtga aggaacaccc gtggcgaagg cgcctgcctg gatgagcact 661 gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 721 gtaaacgatg agtactagcc cttggaggta ttgccccccn tccagtgacc gaaa 所述蛭弧菌於2008年1月13日在位於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏 中心保藏，5&〃ov/Z)n'o 5p.BDJ01保藏編號為CCTCC NO: M 208011禾卩^fe〃ow力n'o 取BDJ02保藏編號為CCTCC NO: M 208012。
步驟二蛭弧菌濃縮液的製備
從雙層平板上挑取單斑蛭弧菌，與副溶血弧菌濃縮液混合後加入到含有DNB培養基 的三角錐瓶中，恆溫搖床250rpm， 28。C培養24h。培養物經過5000rpm、 4。C離心20min， 取上清液，再16000rpm、 4。C條件下離心20min，棄上清液，加入適量DNB液體培養基 重新懸浮蛭弧菌沉澱物，分別製成濃度為1H l(^pfu/ml的蛭弧菌濃縮液。
步驟三蛭弧菌對食用海產品攜帶的致病性弧菌的消除實驗
(1) 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、擬 態弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯氏弧菌(Vibrio furnissii)，麥奇尼科夫氏弧菌(Vibrio metschnikovii)， 辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis)、哈維氏(Vibrio harveyi)，倉ll 傷弧菌(Vibrio vulnificus)和河弧菌(Vibrio fluvialis)的製備
用鹼性蛋白腖水培養基搖床培養，160rpm、 28'C培養12 16h分別增殖上述弧菌， 培養液經5000rpm、 4'C離心20min，棄上清液，沉澱菌體用鹽度為15%。的無菌海水重新 懸浮，使其濃度為109cfu / ml。
(2) 蛭弧菌對食用前海產品攜帶的致病性弧菌的消除試驗
試驗容器為25L的水族箱，分為試驗和對照兩大系列。試驗用水為海水，每個水族 箱注入16L海水。試驗所用牡蠣平均體長為3.9X1.9cm，重10.21g;南美白對蝦平均體 長為12.1cm，重12.5g;鱸魚平均體長為24cm，重400g。每個水族箱放牡蠣、南美白對 蟲下和艫魚各10隻。試驗期間水溫為27'C。 3個水族箱作為對照系列，僅加致病性弧菌， 不加蛭弧菌。試驗系列中，3個水族箱為一組，加入一定量的蛭弧菌濃縮液，使其達到一 個預定的蛭弧菌終濃度。如此共有5個不同梯度的蛭弧菌終濃度，即104pfu/ml、 106pfu /ml、 108pfu/ml、 1010pfu/ml和1012pfu/ml。
試驗時，在相應的水族箱中加入上述步驟三(1)製備好的副溶血弧菌、溶藻弧菌、 擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌，使其濃度分別達到1.0X104cfu/ml，然 後將牡蠣、南美白對蝦和鱸魚放入其中適應後，再在試驗系列水族箱中加入不同量的蛭弧 菌濃縮液，使它們達到不同的蛭弧菌終濃度。弧菌的特異性檢測均採用實時螢光定量PCR 檢測。施用l株蛭弧菌(BDJ01)對食用海產品中副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗 尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌的消除試驗效果如圖1所示。圖1中一翻一為試驗系列中 弗尼斯氏弧菌濃度對數值曲線，_ —為試驗系列中麥奇尼科夫氏弧菌的濃度對數值曲 線，一A —為試驗系列中擬態弧菌的濃度對數值曲線， 一魯一為試驗系列中副溶血弧菌濃 度對數值曲線，一X—為試驗系列中溶藻弧菌的濃度對數值曲線。圖1中均為試驗系列中
最低蛭弧菌終濃度組(104pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭弧菌組 的消除效果更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣(水族箱) 的平均值。
從圖1中可知，致病性弧菌的初始濃度均為1.0X104cfu/ml。開始添加蛭弧菌後， 試驗系列中最低蛭弧菌終濃度組(104pfu/ml)的各弧菌濃度均呈下降趨勢。實驗結果表 明，應用l株蛭弧菌(BDJ01)對以上弧菌迸行消除時，副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧 菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌的消除率分別為98.00%、 99.21%、 96.84%、 92.06%、 94.99%。由圖可知單用1株蛭弧菌(BDJ01)可在一定程度上消除食用海產品攜帶的致病 性弧菌。
實施例2
2株蛭弧菌合用消除食用前牡蠣、南美白對蝦和鱸魚攜帶的副溶血弧菌、溶藻弧菌、 擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌和麥奇尼科夫氏弧菌，其他步驟同實施例l。圖2中一B—為試 驗系列中弗尼斯氏弧菌濃度對數值曲線， 一命一為試驗系列中麥奇尼科夫氏弧菌的濃度對 數值曲線，一A —為試驗系列中擬態弧菌的濃度對數值曲線， 一拳一為試驗系列中副溶血
弧菌濃度對數值曲線，一X—為試驗系列中溶藻弧菌的濃度對數值曲線。圖2中均為試驗 系列中最低蛭弧菌終濃度組(104pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭 弧菌組的消除效果更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣(水 族箱)的平均值。
從圖2中可知，致病性弧菌的初始濃度均為1.0X104cfu/ml。開始添加蛭弧菌後， 試驗系列中各弧菌濃度均呈下降趨勢。實驗結果表明，應用2株蛭弧菌對以上致病性弧菌 進行消除，副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌的消除 率分別為99.98%、 99.99%、 99.96%、 99.89%、 99.94%。本實施例與實施例1比較可知， 2株蛭弧菌混用致病性弧菌的消除效果明顯優於單用1株蛭弧菌(BDJ01)。
實施例3
2株蛭弧菌合用消除食用前牡蠣、南美白對蝦和鱸魚攜帶的辛辛那提弧菌、哈維氏弧 菌、創傷弧菌、河弧菌，其他步驟同實施例l。圖3中一國一為試驗系列中哈維氏弧菌濃 度對數值曲線， 一令一為試驗系列中河弧菌的濃度對數值曲線，一A —為試驗系列中辛辛 那提弧菌的濃度對數值曲線， 一參一為試驗系列中創傷弧菌濃度對數值曲線。圖3中均為 試驗系列中最低蛭弧菌終濃度組(104pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃 度蛭弧菌組的消除效果更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣 (水族箱)的平均值。
從圖3中可知，致病性弧菌的初始濃度均為1.0X104cfu/ml。開始添加蛭弧菌後， 試驗系列中各弧菌濃度均呈下降趨勢。實驗結果表明，應用2株蛭弧菌對以上弧菌進行消 除，辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌的消除率分別為99.98%、 99.94%、 99.99%、 99.96%。
實施例4
採用與實施例1相同的方法，施用1株蛭弧菌(BDJ02)消除海產品牡蠣、南美白對 蟲下和艫魚運輸過程中辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌。試驗系列中，3個 水族箱為一組，加入一定量的蛭弧菌濃縮液，使其達到一個預定的蛭弧菌終濃度，如此共 有5個不同梯度的蛭弧菌終濃度，即103pfu/ml、 106pfu/ml、 108pfu / ml、 1010pfu/ ml和10"pfu/ml。消除試驗效果如圖4所示，圖4中一B —為試驗系列中哈維氏弧菌濃 度對數值曲線， 一令一為試驗系列中河弧菌的濃度對數值曲線，一A —為試驗系列中辛辛 那提弧菌的濃度對數值曲線， 一參一為試驗系列中創傷弧菌濃度對數值曲線。圖4中均為 試驗系列中最低蛭弧菌終濃度組(103pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃 度蛭弧菌組的消除效果更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣 (水族箱)的平均值。
實驗結果表明，弧菌的初始濃度均為lX104cfu/ml。試驗系列中弧菌濃度均保持下 降趨勢。辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌的消除率分別為96.02%、 87.41%、 97.49°/。、 94.99%。由圖4可知施用1株蛭弧菌(BDJ02)對消除海產品運輸過程中的致病 性弧菌有效，但消除率略低。
實施例5
採用與實施例1相同的方法，施用2株蛭弧菌消除海產品牡蠣、南美白對蝦和鱸魚運 輸過程中副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌和麥奇尼科夫氏弧菌，其它實 施條件與實施例4相同，加入不同濃度的蛭弧菌濃縮液，使其達到一個預定的蛭弧菌終濃 度。消除試驗效果如圖5所示，圖5中一圓一為試驗系列中弗尼斯氏弧菌濃度對數值曲線， 一令一為試驗系列中麥奇尼科夫氏弧菌的濃度對數值曲線，一A —為試驗系列中擬態弧菌 的濃度對數值曲線， 一參一為試驗系列中副溶血弧菌濃度對數值曲線，一X—為試驗系列 中溶藻弧菌的濃度對數值曲線。圖5中均為試驗系列中最低蛭弧菌終濃度組(10、fu/ml) 中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭弧菌組的消除效果更好，為簡便起見，故不 再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣(水族箱)的平均值。實驗結果表明，致病性弧菌的初始濃度均為lX104cfu/ml。試驗系列中弧菌濃度一 致保持下降趨勢。比較各弧菌的初始濃度與第7h的終濃度可知均有較高的消除率，副溶 血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌和麥奇尼科夫氏弧菌的消除率分別為99.97%、 99.99%、 99.94%、 99.80%、 99.90%。由圖5可知施用2株蛭弧菌基本上可以有效清除海 產品運輸過程中的致病性弧菌。
實施例6
採用與實施例1相同的方法，施用2株蛭弧菌消除海產品牡蠣、南美白對蝦和鱸魚運 輸過程中辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌。其它實施條件同實施例4，加 入不同濃度的蛭弧菌濃縮液，使其達到一個預定的蛭弧菌終濃度。消除試驗效果如圖6 所示，圖6中一B —為試驗系列中哈維氏弧菌濃度對數值曲線， 一命一為試驗系列中河弧 菌的濃度對數值曲線，一A —為試驗系列中辛辛那提弧菌的濃度對數值曲線， 一參一為試 驗系列中創傷弧菌濃度對數值曲線。圖6中均為試驗系列中最低蛭弧菌終濃度組(103pfu /ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭弧菌組的消除效果更好，為簡便起見， 故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣(水族箱)的平均值。
實驗結果表明，弧菌的初始濃度均為lX104cfu/ml。試驗系列中弧菌濃度均保持下 降趨勢。辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌的消除率分別為99.98%、 99.92%、 99.99%、 99.95%。圖6所示施用2株蛭弧菌基本上可以有效清除海產品運輸過程中的致 病性弧菌。比較實施例4的實驗結果，可知施用2株蛭弧菌對海產品運輸過程中的致病弧 菌的清除效果明顯優於單用l株蛭弧菌(BDJ02)。 實施例7
蛭弧菌在消除海產品養殖水體中致病性弧菌的應用，海產品以牡蠣、南美白對蝦和鱸 魚為例。
將養殖水池(125L)分為試驗和對照兩大系列。試驗用水為海水，每個水池注入100L。 其它實施條件同實施例l。試驗系列中，3個水池為一組，加入一定量的蛭弧菌濃縮液， 使其達到一個預定的蛭弧菌終濃度，如此共有3個不同梯度的蛭弧菌終濃度，即102pfu /ml、 104pfu/ml禾卩106pfu/ml。
施用1株蛭弧菌(BDJ01)消除牡蠣、南美白對蟲下和艫魚養殖水體中溶藻弧菌、副溶 血弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌、擬態弧菌，釆用與實施例1相同的方法。消除 試驗效果如圖7所示，圖7中一B —為試驗系列中哈維氏弧菌濃度對數值曲線，_令_為 試驗系列中擬態弧菌的濃度對數值曲線，一A—為試驗系列中河弧菌的濃度對數值曲線，
一參一為試驗系列中副溶血弧菌濃度對數值曲線，一X—為試驗系列中創傷弧菌的濃度對 數值曲線，一O—為試驗系列中溶藻弧菌的濃度對數值曲線。圖7中均為試驗系列中最低 蛭弧菌終濃度組(102pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭弧菌組的消 除效果更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣的平均值。
從圖7中可知，弧菌的初始濃度均為102cfu/ml水平。試驗系列中各弧菌濃度亦呈 現下降趨勢，應用1株蛭弧菌(BDJ01)對以上弧菌進行消除時，溶藻弧菌、副溶血弧菌、 哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌、擬態弧菌的消除率依次為90.00%、 80.05%、 60.19%、 84.15%、 74.88%、 68.38%。
實施例8
採用與實施例l相同的方法，採用2株蛭弧菌應用於海產品養殖，即處理牡蠣、南美 白對蝦和鱸魚養殖水體中副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌和麥奇尼科夫 氏弧菌。採用與實施例7相同的方法和實施條件，加入不同濃度的蛭弧菌濃縮液，使其達 到預定的蛭弧菌終濃度。消除試驗效果如圖8所示。圖8中一B —為試驗系列中弗尼斯氏 弧菌濃度對數值曲線，_令一為試驗系列中麥奇尼科夫氏弧菌的濃度對數值曲線， 為試驗系列中擬態弧菌的濃度對數值曲線，一參一為試驗系列中副溶血弧菌濃度對數值曲 線，一X—為試驗系列中溶藻弧菌的濃度對數值曲線。圖8中均為試驗系列中最低蛭弧菌 終濃度組(102pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭弧菌組的消除效果 更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣的平均值。
從圖8中可知，弧菌的初始濃度均為1(^cfii/ml水平。試驗系列中各弧菌濃度亦呈 現下降趨勢，應用2株蛭弧菌對以上弧菌進行消除時，副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、 弗尼斯氏弧菌和麥奇尼科夫氏弧菌的濃度在第7h均小於10cfu / ml。
實施例9
採用與實施例1相同的方法，採用2株蛭弧菌應用於海產品養殖，即處理牡蠣、南美 白對蟲下和鱸魚養殖水體中辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、河弧菌。採用與實施例 7相同的方法和實施條件，加入不同濃度的蛭弧菌濃縮液，使其達到預定的蛭弧菌終濃度。 消除試驗效果如圖9所示。圖9中一B —為試驗系列中哈維氏弧菌濃度對數值曲線，一 一為試驗系列中河弧菌的濃度對數值曲線，一A —為試驗系列中辛辛那提弧菌的濃度對數 值曲線， 一參一為試驗系列中創傷弧菌濃度對數值曲線。圖9中均為試驗系列中最低蛭弧 菌終濃度組(102pfu/ml)中的弧菌濃度對數值曲線。由於其它高濃度蛭弧菌組的消除效 果更好，為簡便起見，故不再在圖中表示。所有數據均為三個平行樣的平均值。
從圖9中可知，弧菌的初始濃度均為10^fo/ml水平。試驗系列中各弧菌濃度亦呈 現下降趨勢，應用2株蛭弧菌對以上弧菌進行消除時，辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷 弧菌、河弧菌的濃度在第7h均小於10cfU / ml。
序列表如下-
華南理工大學
蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用
200810027132.8
2008-03-31
2
1
811
DNA
蛭弧菌種(Bdellovibriosp.)
16S rDNA (1)...(811) n =a或g或c或t 1
caagtogaac cgagaaangc cn加c鵬g tggagtacag tggcgcacgg gtgaataacg 60 cgtaggtgac gtgcctttta gtgggggaca acatcggg幼accggtgcta ataccgcata 120 agttaagcga cattgaaaaa gcttaagaaa gtgggcttcg gctcacgctg aaagatcggc 180 ctgcgtatca加gcttgtt ggtggggtaa cggcctacca aggctacgat gattaactgg 240 tctgagagga tgatc^tca cactggaact gagacacggt ccagactcct ac鵬aggca 300 gc^^gga atattgcgca atgggggaaa ccctgacgca gcaatgccac gtgagtg鄉360 aaggcccttg ggttgtaaag ctctgtecta tgggaagaac tgcattacgg ttaatacccg 420 tagtgtttga cggtaccata gaagaaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta 480 atacgga鵬tgcaagcgtt gttcggattt act鵬cgta aagcgcgcgc aggcggattg 540 gca^toaga t跑aaatct cggggctcaa ccccgaaact gcgtc每aaa ctatc喊ct 600 agagtctcat agggggcagg ggaatttcac gtgtaggggt aaaatccgta gagatgtgaa 660 ggaacacccg tggcgaaggc gcctgcctgg atgagcactg acgctg鄉c gcgaaagcgt 720
ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtecacgccg taaacgatga gtactagccc 780 ttggagtatg cccccncccc cnggoacgaa a 811
2
774
DNA
蛭弧菌種(Bdellovibriosp.)
16S rDNA (1)...(774) n =a或g或c或t 2
gtggcgcacg nntnantaac gcgtaggtga cgtgcctttt agtgggggac aacatcggga 60 aaccggtgct aataccgcat aagttaagcg acattgaaaa agcttaagaa agtgggcttc 120 ggctcacgct gaaagatcgg cctgcgtatc attagcttgt tggtggggta acggcctacc 180 鄉gctacga tgattaactg gtctgagagg atgatoagtc acactggaac tgagacacgg 240 tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatattgcgc aatg鵬gaa accctgacgc 300 agcaatgcca cgtgagtgag gaaggccctt gggttgtaaa gctctgtcct atgggaagaa 360 ctgcattacg gttaataccc gtagtgtttg acggtaccat agaagaaagc accggctaac 420 tccgtgccag cagccgcggt aatacgg鄉gtgcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 480 aaagcgcgcg caggcggatt ggcaagtcag atgtgaaate tcggggctca accccgaaac 540 tgcgtctgaa actatcagtc tagagtctca tagggggcag gggaatttca cgtgtagggg 600 taaaatccgt agagatgtga aggaacaccc gtggcgaagg cgcctgcctg gatgagcact 660 gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 720 gtaaacgatg agtactagcc cttggaggta ttgccccccn tccagtgacc gaaa 77權利要求
1、蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用，應用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一蛭弧菌的分離純化對採集的海水或底泥進行預處理，接種增殖蛭弧菌的副溶血弧菌，倒雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現噬菌斑，挑取不斷擴大的單斑，再按微生物學方法液體增殖培養、雙層平板檢驗，再次挑取不斷擴大的單斑，並重複若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為一株蛭弧菌純菌株，按同一時間內單斑大小計，可分離出2株蛭弧菌純菌株；步驟二蛭弧菌濃縮液的製備將2株蛭弧菌分別進行發酵培養，分別製成濃度為1011～1013pfu/ml的蛭弧菌濃縮液，待用；步驟三蛭弧菌在消除海產品食用前及其養殖水體中致病性弧菌的應用在汙染了致病性弧菌的食用海產品和/或其養殖水體中加入步驟二製備的蛭弧菌濃縮液，使蛭弧菌的濃度至少達到102pfu/ml。
2、 根據權利要求1所述的蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用，其特徵在於所述應用方法採用2株蛭弧菌混合使用或分別獨立使用。
3、 根據權利要求1或2所述的蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應 用，其特徵在於所述應用方法用於消除食用或加工前海產品攜帶的致病性弧菌，應用時 蛭弧菌濃度範圍為104 1012pfu/ml。
4、 根據權利要求1或2所述的蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應 用，其特徵在於所述應用方法還用於消除海產品運輸過程中的致病性弧菌，應用時蛭弧 菌濃度範圍為13 10"pfu/ml。
5、 根據權利要求1或2所述的蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用，其特徵在於所述應用方法還用於消除海產品養殖水體中的致病性弧菌，應用時蛭弧菌濃度範圍為102 106pfu/ml。
6、 根據權利要求1所述的蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用，其特徵在於所述致病性弧菌是指副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌、弗尼斯氏弧菌、麥奇尼科夫氏弧菌、辛辛那提弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌和河弧菌。
全文摘要
本發明公開了蛭弧菌在消除海產品及其養殖水體中致病性弧菌的應用，在汙染了致病性弧菌的海產品和/或養殖水體中加入蛭弧菌濃縮液，使蛭弧菌的濃度至少達到102pfu/ml。海產品食用前、運輸過程以及養殖水體中應用本法時，蛭弧菌濃度範圍分別為104～1012pfu/ml、103～1011pfu/ml、102～106pfu/ml。採用生物方法，安全清除食用前和/或運輸過程中海產品所攜帶的致病性弧菌99％以上；而其養殖水體中致病性弧菌也可控制在10cfu/ml以內。本發明適合於海產品食用或加工前的預處理、運輸過程及其養殖過程，特別有利於減少或消除化學藥物如抗生素的殘留，從根本上避免海產品食物中毒事件的發生。
文檔編號A01N63/00GK101356927SQ20081002713
公開日2009年2月4日 申請日期2008年3月31日 優先權日2008年3月31日
發明者娟 李, 李春霞, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學