豬幹擾素α的一個SNP標記及應用的製作方法

2023-05-28 11:14:36

豬幹擾素α的一個SNP標記及應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於豬分子標記製備與應用【技術領域】，具體涉及豬幹擾素α的一個SNP分子標記，該分子標記是從豬TLR6基因外顯子中克隆得到，本發明還包括豬TLR6基因外顯子序列突變位點的檢測方法與應用。本發明通過製備得到一種豬幹擾素(IFN)-α免疫性狀相關的SNP分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在序列表SEQ ID NO:1第587bp處存在一個A/G鹼基突變，該突變導致PCR-BtsI-RFLP多態性。本發明還公開了該分子標記的製備方法及其在豬幹擾素α關聯分析中的應用。
【專利說明】豬幹擾素 α的一個SNP標記及應用
[0001] 本發明屬於豬遺傳標記製備【技術領域】，具體涉及豬幹擾素 α的一個SNP標記及應 用，該標記是從豬TLR6基因外顯子中克隆得到，本發明還包括豬TLR6基因外顯子序列突變 位點的檢測方法與應用。

【背景技術】
[0002] 分子標記輔助選擇（Molecular marker-assisted selection，MAS)是隨著現代分 子生物學技術的迅速發展而產生的新技術，利用與育種性狀相關的各種標記代替以表型為 基礎的選擇，從分子水平上分析個體的遺傳組成，從而實現對基因型的直接選擇，進行分子 育種。可克服直接選擇的弊端，提高選擇準確性和縮短世代間隔（吳常信2000)。按技術特 性，分子標記可分為三大類。第一類是以分子雜交為基礎的DNA標記技術；第二類是以聚合 酶鏈式反應（Polymerase chain reaction, PCR反應）為基礎的各種DNA指紋技術；第三 類是一些新型的分子標記，如單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism, SNP)， 由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性，包括單鹼基的轉換、顛換以及單鹼 基的插入、缺失等。限制性內切酶片段長度多態性標記（Restriction fragment length polymorphisms, RFLP標記）根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點鹼 基發生改變，導致酶切片段大小發生變化，這種變化可以通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從 而比較不同品種（個體）之間DNA水平的差異（Beuzen，Stear et al.2000)。
[0003] TOLL樣受體（Toll-like rec印tors，TLR)存在於體內的天然免疫受體之一，是一 類橫跨膜蛋白基因家族。目前研究已發現11個成員，主要表達於免疫細胞表面，在激活和 調節先天性免疫及誘導獲得性免疫中發揮關鍵作用（李麗燕2011)。TLR基因的變異是機 體對病原微生物抵抗力差異的重要遺傳基礎。TLR6是TLRs家族成員之一，和其他模式識 別受體（pattern-recognition receptors,PRRs) -樣，主要通過識別病原微生物相關分子 來啟動免疫應答反應，使機體免疫細胞釋放細胞因子和其他介質，以抵抗外界微生物對機 體的損傷（Takeuchi, Kawai et al. 1999 ;0kamura, Watari et al. 2001)。幹擾素（IFN-α ) 主要是由效應T淋巴細胞分泌的一種糖蛋白，在抵抗病毒感染的過程中能夠抑制病毒的復 制，而發揮著抗病的生物學功能。李媛媛（2010)等在人類的過敏性紫癜（HSP)免疫發病機 制的研究中發現，病理狀態下Toll樣受體家族的異常活化（變異），幹擾素 -a表達水平呈 現上調表達趨勢（李媛媛，李成榮et al.2010)。Hoffjan，S(2005)等的研究認為，TLR6 基因的單核苷酸多態性變異與機體對病原微生物的識別有關，進而直接影響疾病抵抗力的 差異（Hoffjan, Stemmier et al. 2005)。IFN-α是機體重要的抗病毒物質，其在體內表達 水平不同個體間的抗病力也有所差異。本研究利用PCR-RLFP技術檢測了豬TLR6基因多態 性，分析其多態性與免疫性狀的相關性，試圖尋找影響豬免疫性能的新基因，以建立影響豬 免疫性狀的新標記，期望能為豬抗病育種及標記輔助選擇育種提供理論依據。
[0004] 針對目前豬免疫性狀的分子標記研究很少，本發明在豬TLR6基因的編碼區找到 的IFN- a免疫性狀SNP分子標記屬首次發現。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於獲得豬幹擾素 α的一個SNP標記，該標記與豬IFN-α免疫性 狀相關的單核苷酸多態性（SNP)分子標記有關。本發明另一個目的在於提供與豬免疫性狀 相關的單核苷酸多態性分子標記的應用。
[0006] 本發明的技術方案如下所述：
[0007] 申請人:從報導的豬TLR6基因中克隆得到豬幹擾素 α的一個SNP分子標記，核苷 酸序列如下：
[0008] CCCAGAGAGC CGCCAAGCAG GTTAGCAACA CACAACCACA GTTCTTTGCT AACAAGGTCT
[0009] GTATTGCCTT TCTGGCACCA GCCACTTGTA TAATTGGAAA AAAATAACAT TAAATTATGG
[0010] GGACAGAAAT GATTCTGATA GTGAATAAAG AACTCATTGA GATTTTGTGT TTACTAAGGA
[0011] GATGTTTCAG AACAGTCATC CAATCTTTAT ACATCTTTGT TTTCCATCCA ATCTTTATAT
[0012] ATCGTAACAT ATATTTCTAG AATTTGGATG CCTAGCAAGA TGTTCTGAAG AACAGCAGCA
[0013] ACCCTCTGGG GGATGGTAAC TTCAACATCA TGAGCAAAGA CAAAGAACCT ACTGTCATAA
[0014] GCCTTCATTC TGTGTATGTC ATGACCTTAG TATGGGGAAC CCTAATCCAG TTCTCTGAAG
[0015] AAAGTGAATT TGTGGTAGAC AAGTAGTCAA AAATAGGCCT TACTCGTGTT GCCACCCCAA
[0016] ACCAAAGTCT TAGATGTGTC TCAAAACTTC ATAACTGAGC TTCACCTCTC TGACATCAGC
[0017] TTTCTCTCGC AGCTGACGGT TTTGAGACTT TCCCAGAATA GGATGC R
[0018] (A/G)GTG CCTTGATATC
[0019] AGTGTTTTCA AGTTCAATCA GGATTTGGAA TATTTGGATT TATCTCACAA TCAGTTGCAG
[0020] ACAATCTTGT GCCATCCCAT CACCAGCCTC AAGCATTTGG ACCTCTCATT CAATGACTTT
[0021] GAAGCCCTGC CCATATGTAA GGAGTTTGGC AACTTGACAC AACTGAATTT CTTGGGATTA
[0022] AGTGCTACAA AGTTACAGCA ATTAGATCTA CTACCAATTG CTCACTTGCA TCTAAGTTGC
[0023] ATCCTTCTGG ATTTGGAACG TTATTACATG AAAGAAAATG AGAAAGAAAG TCTTCAAATT
[0024] CTGAACACAA AGAAACTTCA CCTGGTCTTT CATCCAAATA GCTTCTTCTC TGTCCAAGTA
[0025] AACATATCGG TTAAGAGTGT AGGGTGTTTA CAACTGGCTA ATATTAAACT GAGTGATGAC
[0026] AACTGTCAGG TTTTCATTAC ATTTTTATTG GAACTCACTC AAGGGCCAAC CTTACTAAAT
[0027] TTTACGCTCA ACCATGTGG
[0028] 上述序列中的587位中的R是A或G，該突變導致PCR-BtsI-RFLP多態性。
[0029] 申請人:設計了擴增上述TLR6基因片段的引物對（該引物對也是擴增本發明的分 子標記的引物對），其DNA序列如下所示 ：
[0030] 正向引物：5'CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAG 3' ；
[0031] 反向引物：5' CCACATGGTTGAGCGTAAA 3'。
[0032] 實現本發明的具體製備方法是：提取杜洛克X二花臉F2代豬基因組DNA ;根據 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/中公布的豬TLR6基因序列信息，設計PCR擴增引物 (其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2和3所示）。用該引物對進行PCR擴增，得到長度為 1099bp的擴增片段，該片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，在該序列的第587位 有一個等位基因的突變（A/G)，該突變導致PCR-BtsI-RFLP多態性，進而對所獲得的PCR產 物酶切分型，進行基因型與豬IFN-α免疫性狀之間的關聯分析的應用，為豬的分子標記輔 助選擇提供一個新的分子標記。
[0033] 更詳細的發明技術方法參見《【具體實施方式】》所述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 序列表SEQ ID NO: 1 :是本發明製備的豬幹擾素 α的一個SNP標記（杜二F2代 豬）的核苷酸序列，序列長度為l〇99bp ;
[0035] 序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是擴增SEQ ID NO:所示的1特異基因片段 所用的正向引物和反向引物，也是檢測豬A/G變異PCR-BtsI-RFLP (限制性內切酶酶切片段 長度多態性）基因型分型方法的正向引物和反向引物。
[0036] 圖1 :為本發明在杜洛克X二花臉F2代（或簡稱杜二F2代）豬中TLR6基因序 列測序結果的SNP位點。
[0037] 圖2 :為本發明包括豬TLR6基因部分外顯子的基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜。瓊 脂糖凝膠濃度為2%，附圖標記說明：M泳道為DNA Marker DL2000,泳道1、2為序列表SEQ ID N0:2所示引物在杜二F2代豬群體中的擴增片段，片段大小為1099bp ;
[0038] 圖3 :為豬TLR6基因 PCR-BtsI-RFLP檢測結果。瓊脂糖凝膠濃度為2%，附圖標記 說明：M泳道為DNA Marker DL2000, GG基因型片段大小為1099bp，AA基因型片段大小為 507bp 和 592bp，AG 基因型為 507bp、592bp 和 1099bp。
[0039] 圖4 :是本發明的是本發明製備的豬幹擾素 α的一個SNP標記的DNA序列。在該 序列的587位中存在一個突變R，該R是A或G，該突變導致PCR-BtsI-RFLP多態性。

【具體實施方式】
[0040] 實施例1
[0041] 一、豬基因組DNA提取（樣品為杜二F2代豬種，由廣東省溫氏集團提供）
[0042] 本發明所使用的豬群體（杜洛克X二花臉F2代，簡稱杜二F2代，下同）的DNA 樣品全部採用北京天根生化技術有限公司生產的基因組DNA試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit ;按該試劑盒說明書進行操作）提取，具體步驟如下所示：
[0043] (1)將取自杜二F2代豬耳樣（組織）放入2ml的EP管中，用酒精棉擦拭乾淨的眼 科手術剪剪成糊狀後加入200 μ 1緩衝液GA (該試劑盒自帶）。
[0044] (2)再加入20μ 1蛋白酶K溶液（該試劑盒自帶），混勻後置於56°C水浴鍋中消化 過夜。
[0045] (3)加入200 μ 1緩衝液GB (該試劑盒自帶），充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶 液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
[0046] (4)加入200 μ 1無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉澱，簡短離 心以去除管蓋內壁的水珠。
[0047] (5)將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0048] (6)向吸附柱CB3中加入500 μ 1緩衝液⑶（該試劑盒自帶），12000rpm離心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0049] (7)向吸附柱CB3中加入600 μ 1漂洗液PW(該試劑盒自帶），12000rpm離心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0050] (8)重複操作步驟7。
[0051] (9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3 置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。
[0052] (10)將吸附柱CB3轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200 μ 1洗脫緩衝液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管 中。
[0053] (11)對提取出的DNA的濃度及質量進行檢測後置於一 20°C下保存備用。
[0054] 二、突變位點的PCR擴增
[0055] 本發明的突變位點位於TLR6基因組的外顯子上，根據NCBI提供的豬TLR6基因序 列信息，在突變位點兩端設計引物擴增並檢測突變所用的引物對的核苷酸序列如下：
[0056] 正向引物：5'CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAG 3' ；
[0057] 反向引物：5' CCACATGGTTGAGCGTAAA 3'。
[0058] 反應體系為 20 μ L，其中 DNA 模板 1 μ L (約 IOOng)，10 X buffer (含 Mg2+) 2 μ L，上 述正反向引物終濃度各〇. 3μπι，dNTPs混合物終濃度為75μΜ，0. 6U Taq DNA聚合酶，不足 部分用雙蒸水補足。
[0059] PCR 擴增程序：95°C預變性 5min，94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，循環 35 次，最後 72°C延伸5min，15°C 2min停止反應。
[0060] 本實施例中，PCR擴增產物用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均為特異的PCR產 物，片段全長為l〇99bp，如圖2所示。
[0061] 三、PCR-BtsI-RFLP 檢測分子標記 A587-G587
[0062] 將PCR產物15yL，10Xbuffer 5yL，限制性內切酶BtsI為IyL(IOU),用雙蒸水 補足50 μ L，樣品混勻後離心，在55°C培養箱酶切I. 5h。2%瓊脂糖凝膠電泳分離後紫外燈 下檢測拍照，記錄基因型。結果見圖3。
[0063] 分子標記基因型分析：如圖3所示，用上述引物對擴增豬基因組DNA獲得的 1099bp的特異性擴增片段，序列分析在587bp處存在A587-G587突變，並導致BtsI多態性。 該基因突變位點由兩個等位基因控制，其中G是沒有形成酶切位點的等位基因，A是形成酶 切位點的等位基因。這兩個等位基因可組成三種基因型：其中GG型為未發生酶切的純合型 (電泳檢測時只有l〇99bp-條DNA帶），AA型為發生酶切的純合型（電泳檢測時出現592bp 和507bp的兩條DNA帶），AG為雜合型（電泳檢測時出現1099bp，592bp和507bp三條DNA 帶）。
[0064] 實施例2
[0065] 一、構建家系及基因型掃描
[0066] 用於性狀關聯分析的試驗豬群（杜二F2代）是由 申請人:所在的華中農業大學動 物遺傳育種與繁殖分子生物學實驗室與廣東溫氏集團合作構建的杜洛克與二花臉豬雜交 F2代試驗豬群體，仔豬出生時採集耳朵組織樣本，共計254頭。仔豬生長到35日齡時，收集 血清樣本，並用ELISA法（為常規方法，分析方法由尚柏生物醫學技術（北京）有限公司完 成）測定關聯分析的細胞因子水平數據包括：幹擾素 α、幹擾素 β、IGg抗體等。杜二F2 代豬基因組DNA全部由華中農業大學所在的動物遺傳育種與繁殖分子生物學實驗室從每 個杜二F2代豬個體耳緣組織樣品中提取獲得（製備方法參見實施例1)，置於-20°C保存備 用。
[0067] 對254頭杜二F2代豬的DNA樣品用PCR-BtsI-RFLP方法進行基因分型，檢測 A587-G587位點的多態性。結果表明，AA基因型有57個，基因型頻率為0. 22 ;AG基因型127 個，基因型頻率為0. 49 ;GG基因型有70個，基因型頻率為0. 27。
[0068] 二、豬TLR6基因分子標記位點A587-G587與豬免疫性狀的關聯分析
[0069] 根據本發明所使用的資源家系的群體結構及其影響因素， 申請人:運用混合線性 模型來分析豬TLR6基因 A587-G587位點的不同基因型對測定的豬胴體性狀的影響，採用 SAS (Version 8. 1)軟體中Mixed Procedure程序進行數據處理與統計分析，模型如下：
[0070] Yijk = V- +Sex^genotypej++ ε iJk
[0071] 其中，Yijk表示處理後的性狀值，μ表示每個性狀的均值，％\表示性別效應， genotype』表示基因型效應，ε ijk為隨機誤差。分析結果表明，A587-G587位點的多態性與 豬幹擾素 -α (IFN-α )呈顯著相關（P〈〇. 05)。A587-G587位點的多態性與豬幹擾素性狀關 聯分析的詳細結果見表1。
[0072] 表1豬TLR6基因 A587-G587位點的多態性與幹擾素 a免疫性狀的關聯分析
[0073]

【權利要求】
1. 豬幹擾素a的一個SNP分子標記，其核苷酸序列如下所示： CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAGCAACACACAACCACAGTTCTTTGCTAACAAGGTCTGTATTGCCTTTC TGGCACCAGCCACTTGTATAATTGGAAAAAAATAACATTAAATTATGGGGACAGAAATGATTCTGATAGTGAATAAA GAACTCATTGAGATTTTGTGTTTACTAAGGAGATGTTTCAGAACAGTCATCCAATCTTTATACATCTTTGTTTTCCA TCCAATCTTTATATATCGTAACATATATTTCTAGAATTTGGATGCCTAGCAAGATGTTCTGAAGAACAGCAGCAACC CTCTGGGGGATGGTAACTTCAACATCATGAGCAAAGACAAAGAACCTACTGTCATAAGCCTTCATTCTGTGTATGTC ATGACCTTAGTATGGGGAACCCTAATCCAGTTCTCTGAAGAAAGTGAATTTGTGGTAGACAAGTAGTCAAAAATAGG CCTTACTCGTGTTGCCACCCCAAACCAAAGTCTTAGATGTGTCTCAAAACTTCATAACTGAGCTTCACCTCTCTGAC ATCAGCTTTCTCTCGCAGCTGACGGTTTTGAGACTTTCCCAGAATAGGATGCR[A/G]GTGCCTTGATATCAGTGTT TTCAAGTTCAATCAGGATTTGGAATATTTGGATTTATCTCACAATCAGTTGCAGACAATCTTGTGCCATCCCATCAC CAGCCTCAAGCATTTGGACCTCTCATTCAATGACTTTGAAGCCCTGCCCATATGTAAGGAGTTTGGCAACTTGACAC AACTGAATTTCTTGGGATTAAGTGCTACAAAGTTACAGCAATTAGATCTACTACCAATTGCTCACTTGCATCTAAGT TGCATCCTTCTGGATTTGGAACGTTATTACATGAAAGAAAATGAGAAAGAAAGTCTTCAAATTCTGAACACAAAGAA ACTTCACCTGGTCTTTCATCCAAATAGCTTCTTCTCTGTCCAAGTAAACATATCGGTTAAGAGTGTAGGGTGTTTAC AACTGGCTAATATTAAACTGAGTGATGACAACTGTCAGGTTTTCATTACATTTTTATTGGAACTCACTCAAGGGCCA ACCTTACTAAATTTTACGCTCAACCATGTGG 上述序列中的587位中的R是A或G，導致PCR-BtsI-RFLP多態性。
2. 擴增如權利要求1所述分子標記的引物對，其DNA序列如下所示： 正向引物：5'CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAG 3'， 反向引物：5'CCACATGGTTGAGCGTAAA 3'。
3. 權利要求1所述的分子標記在豬幹擾素a性狀檢測中的應用。
4. 權利要求2所述的引物對在豬幹擾素a檢測中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313030SQ201410580129
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】朱猛進, 郭敬頌, 王超, 劉向東, 趙書紅, 何民慧 申請人:華中農業大學