斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-28 12:19:51 1

斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1及其應用。基因Rspo1的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，全長756bp，其編碼蛋白共251個胺基酸，序列如SEQIDNO:2所示。本發明方法利用反轉錄PCR技術從斜帶石斑魚中克隆到了一個斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1，並根據實驗結果說明了Rspo1可能參與調控斜帶石斑魚其他性別調控基因的表達，為相關魚類性別調控的研究提供一定的理論依據和重要線索。基因Rspo1編碼的蛋白有望應用於魚類催產、催熟、人工調控雌雄轉換、大規模工業化養殖等方面。
【專利說明】斜帶石斑魚性別調控基因Rspol及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於水生動物基因工程【技術領域】，涉及一種斜帶石斑魚性別調控基因及其應用，特別涉及斜帶石斑魚性別調控基因Rspol及其應用。
【背景技術】
[0002]Rspol~4超家族，作為經典Wnt信號的配體，它們之間有著40%~60%的蛋白一致性和結構同源性。Rspo蛋白包含一個N端信號肽，兩段臨近的富含半胱氨酸的區域，一段高同源的TSP-1模塊，以及一段包含雙向核定位信號的碳端尾巴。他們在各種發育和癌症發生通路中其重要作用。Rspol的結構具有5'端信號肽，具有轉移分泌蛋白的作用；兩段含有半胱氨酸的弗林樣片段，這是它與其受體結合的重要部位；還有一段TSP-1 (凝血酶敏感蛋白-1 )。在斜帶石斑魚的Rspol中，未發現C端核定位信號。Rspol是該超家族中的一種，它的最初發現是在人類性別調控方面發揮的重要作用。傳統觀點認為雌性性別決定和分化是被動的，但目前對RSP01的研究卻對上述提出了質疑。
[0003]RSP01是一種小分泌因子，能夠刺激經典的Wnt/b-連環素信號通路，提高細胞膜上的Wnt與Rspol共受體LRP6的水平。重要的是，Wnt/b-連環素通路在卵巢和睪丸早期發育中起到重要作用。雌性小鼠敲除Rspol很明顯發生性逆轉，有些生育能力降低。與fct4敲除不同，Rspol敲除的小鼠部分是可育的，卵泡在一定程度上發育，但是大多數的雌性是不育的。敲除XX中RPS01的小鼠發生明顯的性別轉化，局部上皮的Rspol信號對於乳腺的發育是必須的。RSP01是卵巢性別調控基因，它積極地掌管卵巢的分化，而WNT4是RSP01的即時的或者是協同的下遊基因，它和RSP01重疊表達，直接或者間接地受RSP01調節。我們推測，Rspol在魚類中也可能存在相同性別調控的功能。
[0004]與高等的脊椎動物相比，大多數低等魚類沒有性染色體，其性別決定主要由多種性別調控基因所控制，至今依然沒有找到魚類的性別決定基因。魚類性別調控的研究，能夠使得人為控制魚類性別的分化和成熟，提早或者延遲魚類的性成熟，甚至可以人為調控魚類的性別轉化，得到轉化後的、具有功能性的雌魚或雄魚。此類研究的成果，將對人工養殖的工業化、現代化產生深遠影響。
[0005]石斑魚是一種深海性的名貴經濟魚種，營養豐富，肉質細嫩潔白，類似雞肉，素有「海雞肉」之稱，成為港澳臺等地區的美味佳餚。在國際自然保護聯盟的「瀕危物種紅色名錄」上，163種石斑魚類，有20種面臨滅絕，另有5種屬瀕危水平。斜帶石斑魚屬鱸形目，屬於雌雄同體、雌性先熟的物種，群體生活，出生的時候都是雌性，成年後才會轉為雄性。斜帶石斑魚的這些特徵使其成為研究性別調控的重要材料。因此，研究斜帶石斑魚及其性別調控機制，對於斜帶石斑魚功能基因組學及斜帶石斑魚育種、人工調控雌雄轉換、大規模工業化養殖的實現等等都具有重要的應用價值。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種斜帶石斑魚性別調控基因Rspol及其應用。[0007]本發明所採取的技術方案是:
斜帶石斑魚性別調控基因Rspol的編碼蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008]編碼斜帶石斑魚性別調控基因Rspol蛋白的核酸序列。
[0009]進一步的，上述核酸序列為基因Rspol的cDNA，全長756bp，其序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]斜帶石斑魚性別調控基因Rspol的重組蛋白含有如SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列。
[0011]編碼斜帶石斑魚性別調控基因Rspol的重組蛋白的核酸序列。
[0012]進一步的，上述核酸序列含有如SEQ ID N0:4所示的核酸序列。
[0013]Rspol的編 碼蛋白或重組蛋白在製備魚類性別催熟劑中的應用。
[0014]Rspol的編碼蛋白或重組蛋白在製備魚類性別轉換劑中的應用。
[0015]本發明的有益效果是:
本發明方法利用反轉錄PCR技術從斜帶石斑魚中克隆到了性別調控基因Rspol，並構建了 Rspol的原核表達載體，可大量表達獲得斜帶石斑魚性別調控基因Rspol所編碼的蛋白。
[0016]在本發明中，斜帶石斑魚Rspol蛋白能夠在卵巢組織的大量表達，並說明了 Rspol參與調控斜帶石斑魚中其他性別調控基因的表達，豐富了魚類性別調控的系統信號通路理論，能為相關魚類性別調控的研究提供一定的理論依據。
[0017]在本發明中，斜帶石斑魚Rspol蛋白在魚類催產、催熟、人工調控雌雄轉換、大規模工業化養殖等方面具有重要的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為基因Rspol的PCR擴增圖；
圖2為重組質粒pQE30-Rspol轉化大腸桿菌M15的菌液PCR驗證圖；
圖3為Rspol重組蛋白的Western檢測圖，其中1表示誘導後總菌體,2表示誘導前總菌體,3表示誘導後上清,4表示誘導前上清,5表示誘導後沉澱,6表示誘導前沉澱；
圖4為Rspol重組蛋白純化後的SDS-PAGE檢測圖，從左到右箭頭所示的泳道分別為50mM、100mM 150mM、200mM、250mM、300mM咪唑洗脫液的洗脫情況。黑色框內的條帶為目的重組蛋白，分子量約27kDa;
圖5為Rspol重組蛋白的SDS-PAGE檢測，箭頭所示為目的重組蛋白條帶；
圖6為Rspol重組蛋白對相關性別調控基因在mRNA轉錄水平上的表達調節；A表示Rspol重組蛋白對Cypl9a表達的影響；B表示Rspol重組蛋白對Sox9表達的影響；圖中T表示用Rspol重組蛋白處理的實驗組,Treat的縮寫；(3表示不加Rspol重組蛋白的對照組，Control的縮寫。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發明採用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規市購的試劑、設備和常規使用的方法。
[0020]實施例1一、Rspol重組蛋白的製備
1、斜帶石斑魚RNA的提取
取健康斜帶石斑魚全魚，以冰浴麻醉約2 min後，殺魚取樣，分離卵巢組織，採用Trizol試劑法抽提獲得斜帶石斑魚卵巢組織總RNA。
[0021]2、/&/7o7基因的克隆第一鏈cDNA的合成:
1)取出保存的斜帶石斑魚RNAWL，加入1PL的Oligo (dT) 16 (10禮)，混勻後置於70 °C中水浴5 min ；
2)冰上放置5min後，於冰上向EP管中先後加入dNTP Mixture (10 mM) 2yL、5XRT Buffer 4 μ L、Rnase 抑制劑 1 μ L (10 U/ μ L)、Rnase-free ddH20 8 μ L、ReverTraAce 1 μ L ；
3)將EP 管置於 PCR 儀中，按 30DC 10 min，42°C 60 min，99°C 5 min，4°C 5 min 程序後瞬時離心，反轉錄得到第一鏈的單鏈cDNA，於-20°C冰箱保存備用。
[0022]以cDNA為模板的Rspol基因克隆:
根據生物信息學中相關 的序列比對和結構分析結果，在基因Rspol的cDNA序列(如SEQID N0:2所示，其編碼的蛋白質序列如SEQ ID NO: 1所示)中去除編碼19個胺基酸的信號肽的序列，以剩下的序列在兩端設計特異性引物，如下:
Rspol-RT-F:5』 - CGCGGATCCGATGTTCTCAAGCTCTC -3』 (SEQ ID NO:5)(下劃線標記部分為內切酶Bam HI的識別序列)；
Rspol-RT-R:5』 - CGGGGTACCTTAGCTGACAGAGCTGG -3』 (SEQ ID NO:6)(下劃線標記部分為內切酶Κρη 1的識別序列)。
[0023]以第一鏈cDNA為模板，採用上遊引物Rspol-RT-F和Rspol-RT-R進行PCR擴增，獲得不含信息肽的Rspol基因，擴增片段大小為699bp，如圖1所示，擴增序列為如SEQ IDN0:4所示，其編碼的蛋白質序列如SEQ ID N0:3所示。電泳分離DNA片段，切膠回收目的產物。將純化後的目的產物連接至PTZ57R/T載體，轉化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆測序，測序結果經BLAST比對分析，比對結果表明目的產物確為基因Rspol。
[0024]3、基因T&/707原核表達載體的構建
提取含有基因/&/707的PTZ57R/T質粒，分別經過內切酶BamHl和Kpnl的酶切，獲得目的片段，將目的片段連接到經BamHl和Kpnl雙酶切過的pQE30質粒載體，pQE30為帶有His標籤的原核表達載體。連接過程中採有連接酶T4 DNA Ligase，溫度37°C，連接反應12~16h0
[0025]將上述連接產物轉化進入擴增宿主-大腸桿菌DH5a的感受態細胞，篩選培養，將獲得的陽性單克隆菌落進行菌液PCR驗證，PCR擴增的片段大小與目的片段大小相似，約699bp，並將該陽性單菌落進行測序驗證，測序結果與目片段的序列一致，說明成功構建了Rspol的原核重組表達載體:pQE30-Rspol。
[0026]4、基因T&/707的原核表達及純化轉化表達宿主:
提取3中構建好的重組表達載體質粒(pQE30-Rspol )，將質粒轉化進入表達宿主-大腸桿菌M15的感受態細胞,用含氨節黴素(Amp)和卡那黴素(Kana)的培養基,進行篩選培養，挑取陽性單克隆菌落，進行菌液PCR驗證(如圖2所示)，PCR擴增的片段大小與目的片段大小相似，約699bp。驗證正確後，以含Amp的培養基過夜擴大培養該陽性菌落，取菌液加入甘油，按8%甘油終濃度保存在-80度冰箱中，進行菌種保存。
[0027]重組蛋白的誘導表達:
將含有重組表達載體(pQE30-Rspol)的大腸桿菌M15先經過LB培養基的擴大培養，再經過2xYT培養基的二級擴大培養，當菌液0D_值介於0.4~0.6之間時，取少量誘導前的菌液，作為後續實驗的對照。剩下的菌液加入IPTG進行誘導培養，誘導培養後收集菌液，離心獲得菌體，加入lxN1-NTA結合緩衝液重懸菌體，此時取20μ?菌體重懸液，作為後續實驗對照。將剩下的菌體重懸液超聲波破碎，離心，將上清和沉澱分開。 [0028]分別將誘導前和誘導後的總菌體、上清和沉澱加入蛋白Loading buffer,混勻，沸水浴中煮5分鐘,分別取ΙΟμ?進行Western blotting檢測,檢測結果如圖3所示。從圖3的western blotting檢測結果中，可看出Rspol重組蛋白在菌體的上清和沉澱中都存在。
[0029]上述2xYT培養基配方為:胰蛋白腖(Tryptone)16g,酵母提取物(Yeast Extract)10g，氯化鈉5g，加水至1L，120°C高壓滅菌20分鐘。
[0030]重組蛋白的純化、脫鹽及凍幹:
將誘導表達後的菌體超聲破碎，離心，棄沉澱，將上清經孔徑0.45微米的濾膜過濾備用。
[0031]鎳柱準備,往柱子內加入2mL的N1-NTA His-Bind (Novagen,貨號:70666),再加10mL水過柱；再加入10mL的lxN1-NTA結合緩衝液平衡柱子。
[0032]掛柱，往50mL離心管中加入結合緩衝液，再加入菌體上清液，蓋上蓋子，封口膜封口，置於冰上，緩慢搖勻、親和吸附1小時。將搖勻的融合液過鎳柱，收集穿過液，再重複過鎳柱兩次。
[0033]漂洗和洗脫，重組蛋白掛柱後，先用lxN1-NTA漂洗液漂洗，再分別以50mM、100mM150mM、200mM、250mM濃度的咪唑洗脫液洗脫，對不同濃度咪唑洗脫液洗脫下來的物質進行SDS-PAGE檢測，檢測結果顯示重組蛋白能被濃度為150~200mM的咪唑洗脫下來，其中咪唑濃度為200mM時，洗脫的條帶單一(如圖4所示)，故選用200mM的咪唑洗脫液用於洗脫獲得
純化重組蛋白。
[0034]基於上述探索出的最優的誘導培養條件、最適濃度的咪唑洗脫液等，再進行大量表達、純後獲得大量重組蛋白，並結合SDS-PAGE進行檢測，檢測結果如圖5所示。Rspol重組蛋白的分子量約為27kDa,如圖5中的箭頭所示。
[0035]將純化後的重組蛋白進行脫鹽，先用0.02M的PB緩衝液進行清洗和平衡柱子。加入樣品，收集穿過液。待樣品完全進入下端柱子後，再加入PB緩衝液洗脫，收集洗脫液，即為脫鹽後的重組蛋白。
[0036]將脫鹽的重組蛋白進行凍存:將含有目的蛋白的收集液置於合適大小的乾淨管子中，用封口膜封好，在膜上扎幾個針眼，以便凍存時水分的散失。管子豎直放於-20度冰箱約2小時以上，待全部凍成冰狀，迅速放於-80度冰箱。第二天，將-80度保存的管子置於調試完好的凍存機掛瓶內，開始凍存。凍存時間視水分散失快慢而定，一般8小時以上或者過夜。將凍存完成的、含有目的蛋白的管子取下迅速放於-80度冰箱保存，以便下一步的實驗。[0037]二、Rspol重組蛋白調節性別調控基因的表達
以斜帶石斑魚為研究對象，以高表達基因Rspol的卵巢組織為材料，用Rspol重組蛋白離體孵育卵巢碎片，研究Rspol重組蛋白對相關性別調控基因Cypl9a、FoX12、Sox9、Wnt4a在mRNA轉錄水平表達的調節情況。
[0038]分別以濃度100、1000、10000 μ g/μ L的Rspol重組蛋白孵育卵巢碎片8h，然後分別檢測性別調控基因Cypl9a、Foxl2、Sox9、Wnt4a在mRNA轉錄水平上的表達情況。檢測結果如圖6所示。
[0039]從圖6的檢測結果可獲知，Rspol重組蛋白對其它幾種性別調控因子起不同作用。其中，三種不同濃度(100、1000、10000ng/ml )Rspol對Cypl9a都有著上調作用；對Foxl2在1000ng/ml濃度時起著明顯下調作用；對Sox9在1000和10000ng/ml時有著下調作用，在1000ng/ml時作用最明顯；而Rspol對Wnt4a的作用卻不明顯。可見，Rspol重組蛋白能夠促進雌性調苄基因(Cypl9a)，而抑制雄性調苄基因(Sox9)的表達，從而可能促進雌性的發生、發育和成熟。說明，Rspol蛋白可能具有上調雌性激素合成的作用，從而引起雌性性別發生和卵巢發育，同 時抑制雄性特徵，進而可能引發魚類從雄性到雌性的性逆轉。
【權利要求】
1.斜帶石斑魚性別調控基因Rspol的編碼蛋白，其胺基酸序列如SEQID NO: 1所示。
2.編碼權利要求1所述的斜帶石斑魚性別調控基因Rspol蛋白的核酸序列。
3.根據權利2所述的核酸序列，其特徵在於:該核酸序列為基因Rspol的cDNA，全長756bp，其序列如SEQ ID N0:2所示。
4.斜帶石斑魚性別調控基因Rspol的重組蛋白，其特徵在於:該重組蛋白含有如SEQID NO:3所示的胺基酸序列。
5.編碼權利要求4所述的斜帶石斑魚性別調控基因Rspol的重組蛋白的核酸序列。
6.根據權利5所述的核酸序列，其特徵在於:其含有如SEQID N0:4所示的核酸序列。
7.Rspol的編碼蛋白或重組蛋白在製備魚類性別催熟劑中的應用。
8.Rspol的編碼蛋白或重組蛋白在製備魚類性別轉換劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK103724415SQ201310753282
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】劉曉春, 王升鵬, 林浩然, 張勇 申請人:中山大學