一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法
2023-05-28 12:04:11 1
專利名稱：一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法
技術領域：
本發明屬於丙酮丁醇生物發酵技術領域，特別涉及一種強化菌種發酵五碳糖製備 丁醇的方法。
背景技術：
丙酮、丁醇是重要的有機試劑和化工原料，在化工、能源以及食品等工業中有著廣 泛用途。傳統的發酵法生產丙酮、丁醇是以玉米為澱粉質或糖蜜等為原料發酵生產，其工藝 複雜，成本高，致使化學合成法逐漸取代了發酵法。現在隨著石油資源的日趨減少和環境問 題的不斷惡化，利用可再生資源微生物發酵生產丙酮丁醇引起了世界各國的普遍關注。以 玉米類糧食為原料發酵丙酮丁醇，不僅生產成本高，而且也違背了糧食安全戰略，因此，以 可再生資源為原料，開發新型的丙酮丁醇發酵工藝具有重要意義。秸稈是價格低廉，來源 廣泛的可再生資源。其酶解產物中包含葡萄糖、木糖和半乳糖等多種糖類，都能夠被丙酮 丁醇梭菌利用發酵。以秸稈為原料進行丙酮丁醇發酵的研究已經有很多，如Ropars等利 用汽爆玉米芯酶解液製取丙酮丁醇(Ropars，et al，Bioresource Technology, 1992,42 197-204)，陳守文等利用稻草酶解液製取丙酮丁醇(陳守文等，工業微生物，1998，28 (4) 30-34)。目前，常用的丙酮丁醇生產菌主要有丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)和 拜氏梭菌(C. beijerinckii)。C. acetobutylicum是在穩定生長期開始產丁醇，而 C.beijerinckii則在快速生長期開始產丁醇。在這兩種菌的基礎上，各國的研究者採用了 多種方法來強化和獲得高活性發酵菌株，提高產物中丁醇比例。通過誘變或基因改造以得 到溶劑高產的菌株的研究報導較多，發明專利ZL 95111733.5 「高丁醇比丙酮丁醇梭菌及 其培養方法與應用」提供一種丙酮丁醇梭菌突變菌株EA 2018，具有發酵生產溶劑中丁醇比 高達67 72%的特性，發明專利200810239560. 7 「重組丙酮丁醇梭菌及其構建方法與應 用」利用基因重組方法構建了丙酮丁醇梭菌重組菌，其最高丁醇產率可達到13. 7g/L ；發明 專利200610147876. 4「一種生物法生產高丁醇的丙酮丁醇的方法」採用含澱粉物質為原料， 輔以酶法前處理和培養基C/N比優化處理，使丁醇的比例高達78%。但是由於木質纖維原料，尤其是農作物秸稈組成不均一性，使其水解產生的水解 液組成也非常複雜。因此，即使通過以上基因或者誘變方法獲得的高丁醇比菌種在產業化 運用時，還是難以實現穩定高效的丁醇生產。另一方面，秸稈水解產物中同時存在著木糖和 葡萄糖等多種糖，現有菌種利用木糖發酵丁醇的能力，與葡萄糖(六碳糖)利用相比，菌株 的木糖利用率低、木糖發酵時間長，在葡萄糖與木糖共存的情況下，菌株總是優先利用葡萄 糖，木糖的利用滯後。因此提高菌種對混合糖(玉米粉和纖維素水解液)的利用率，使菌種 在利用六碳糖的同時盡最大量利用五碳糖並縮短發酵時間。但是，目前還沒有見到強化菌 種發酵五碳糖能力的菌種改造等方面的發明專利。
發明內容
本發明的目的本發明涉及一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法。本發明的 目的一方面在於提高菌種以五碳糖為原料發酵丁醇的耐受力，另一方面在於強化菌種利用 五碳糖發酵丁醇的能力和效率。本發明的構思為了利用農作物秸稈發酵丁醇，首先要採用適當的預處理方法使 其產生可供微生物發酵的糖。目前常用的方法有化學稀酸水解法、物理蒸汽爆破法、生物酶 法等，所產生的水解液產物組成複雜，並且可能存在一些影響菌種生長和產物代謝的物質， 即使是通過基因或者誘變方法獲得的高丁醇比菌種也難以實現穩定高效的丁醇生產。因 此，必須強化微生物的耐受性。另外，利用農作物秸稈進行丁醇發酵，是五碳糖和葡萄糖的 混合糖發酵過程，菌株總是優先利用葡萄糖，五碳糖的利用滯後，也導致了發酵時間較長。 因此，必須強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的能力。基於此，本專利提出了一種強化菌種發酵 五碳糖製備丁醇的方法。本發明技術方案本發明所述的一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法，其特徵在於採用菌種馴 化的方法提高菌株發酵五碳糖的能力。本發明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現1)取甘油管菌種，接種於7%的玉米培養基中，待醪蓋全部浮起後轉接到一定濃 度的試管木糖培養基中。37°C恆溫培養，培養中不斷產生氣泡。在37°C下培養48-56h，取 少量醪液塗布在固體平板上，平板置於真空乾燥器中，抽真空，37°C恆溫培養3-4d，平板表 面出現單菌落，並作記號。2)產溶劑菌株的篩選將固體平板培養基上長出的菌落接入一定濃度的試管木 糖培養基中(15X 150mm)，每支試管裝料10ml，37 °C恆溫培養，待醪液生長至對數期時， 轉接入較高濃度的試管木糖培養基(15X 150mm)中，每支試管裝料IOml ；37°C恆溫培養 48-72h，然後進行色譜分析，比較各菌株的溶劑總量和丙酮、丁醇、乙醇三種成分的相對比 例。經多次發酵篩選，確定最優的產溶劑出發菌株。3)產溶劑菌株的馴化以確定的最優產溶劑出發菌株進行五碳糖發酵性能的馴 化。以秸稈稀酸水解液和玉米粉按照不同比例混合物作為丁醇發酵馴化培養基。隨著馴化 的進行逐漸提高秸稈稀酸水解液的濃度，並減少玉米粉的濃度，以強化菌株發酵五碳糖產 丁醇的能力。首先以起始比例的秸稈酸水解液與玉米粉水溶液混合培養基進行馴化，培養條件 同步驟2)，發酵結束後，進行色譜分析，若在此比例下菌株發酵五碳糖產丁醇濃度有所提 高，則梯級提高秸稈酸水解液的濃度，依次按照其與7%玉米粉水溶液比例(ν/ν)為2 1， 3 1，4 1……的比例進行梯度馴化。每馴化一個梯度，反覆進行5次馴化。若經過多次 馴化，菌株仍然難以生長且發酵產物中丁醇比無明顯提高，則確定上一個梯度作為丁醇發 酵的最終培養基濃度。本發明所採用的菌種馴化培養基，其特徵在於，是以農作物秸稈酸水解液與7% (w/v)玉米粉水溶液按照不同比例混合而成的，兩者的比例為1 1 1 9(v/v)。本發明所採用的利用木糖產丁醇的菌種來自丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)、 巴氏芽抱梭菌(C. pasteurianum)、拜氏梭菌(C. bei jerinckii)。
經過本發明強化菌種可以進一步通過馴化提高發酵五碳糖的性能。本發明的優點在於，本發明以農作物秸稈酸水解液與玉米粉水溶液的混合溶液 直接進行產五碳糖菌株的馴化，顯著強化了微生物對秸稈水解液的耐受性，並提高了菌株 發酵五碳糖的能力，為充分利用農作物秸稈五碳糖進行丁醇生物發酵提供了一種有效的方 法。也有助於降低微生物發酵丁醇的成本。
具體實施方式實施例1取甘油管丙酮丁醇梭菌CGMCC 1. 135(C. acetobutylicum)l支，接種於7%的玉米 培養基中，待醪蓋全部浮起後轉接到6%試管木糖培養基中。37°C恆溫培養，培養中不斷產 生氣泡。37°C培養48h，取少量醪液塗布在固體平板上，平板置於真空乾燥器中，抽真空， 37°C恆溫培養3-4d，平板表面出現單菌落，將各單菌落進行編號。選取平板上的單菌落，將其接入6%的試管五碳糖(15X150mm)培養基中，每支試管 裝料10ml，37°C恆溫培養，待醪液生長至對數期時接入6%的試管五碳糖(15X150mm)培養基 中，每支試管裝料10ml。37°C恆溫培養48h後進行色譜分析，比較各菌株的溶劑總量和丙酮、 丁醇、乙醇三種成分的相對比例。經多次發酵篩選，從中選取出較優的3個菌株1號、5號、11 號。進一步發酵篩選證明U號菌株總溶劑較高，殘糖較低。即以U號菌為馴化的出發菌。表1 :1號、5號、11號菌株的溶劑產量(g/100ml)
權利要求
一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法，其特徵包括以下步驟1)菌種活化；2)產丁醇菌株的篩選；3)產丁醇菌株的馴化。
2.根據權利要求1所述的一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法，其特徵在於， 產丁醇菌株的馴化是以農作物秸稈酸水解液與7% (w/v)玉米粉水溶液按照1 1 1 9 (ν/ν)的比例混合作為培養基。
3.根據權利要求1所述的一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法，其特徵在於，適 用於強化丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)、巴氏芽孢梭菌(C. pasteurianum)、拜氏梭菌 (C.beijerinckii)發酵木糖產丁醇。
4.根據權利要求2所述的農作物秸稈酸水解液，其特徵在於，農作物秸稈包括玉米秸 稈、小麥秸稈、稻草秸稈。
全文摘要
本發明涉及一種強化菌種發酵五碳糖製備丁醇的方法。本發明的目的在於提高菌種對木糖的耐受力，強化菌種利用五碳糖發酵丁醇的能力和效率。本發明以五碳糖溶液為培養基篩選產丁醇菌株，以農作物秸稈酸水解液與玉米粉水溶液按照不同比例配製的混合溶液作為產五碳糖菌株馴化培養基，馴化後的菌株結合誘變處理，獲得高效利用五碳糖發酵丁醇的菌種。採用本發明提供的方法，可以強化丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌等產丁醇菌種利用五碳糖的性能，為充分利用農作物秸稈五碳糖進行丁醇生物發酵提供了一種有效的方法。
文檔編號C12P7/16GK101942483SQ20091008809
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月6日 優先權日2009年7月6日 公開號200910088097.發明者生曉東, 邱衛華, 陳洪章, 馬保華 申請人:中國科學院過程工程研究所;香港來禾生物科技有限公司