豬囊尾蚴病重組基因、疫苗及其製備方法

2023-05-27 20:56:46

專利名稱：：豬囊尾蚴病重組基因、疫苗及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因、這種重組基因的製備方法、這種重組基因的用途，特別是採用這種重組基因製備的用於防治豬囊蟲病的口服疫苗和製備這種疫苗的製備方法。技術背景豬帶絛蟲病(rfle"/w^w//Wm)是一種世界性分布的人獸共患病，豬帶絛蟲的蟲卵六鉤蚴(o"co^/^w)被豬或野豬等中間宿主吞食後發育成豬帶絛蟲的幼蟲囊尾蚴(C少幼'c^r^ce/^/o")，人誤食感染囊尾呦的豬肉或接觸被囊尾呦汙染的物品後極易感染豬帶絛蟲病。因此，豬囊尾蚴病不僅對畜牧業造成經濟損失，嚴重影響肉品的質量，更重要的嚴重危害人類的健康，囊蟲病已引起了世界各國政府的普遍關注和高度重視，如何有效地控制和消滅囊蟲病是關注的焦點。目前關於囊蟲病的防治還沒有成熟的手段，幾種化學藥物對囊蟲病的治療曾起過重要作用，如苯硫咪唑、吡喹酮對囊蟲有很好的驅除和治療作用，但隨著人們長期反覆的使用，藥物治療引起的副作用和食品中藥物殘留對人休可能造成的危害已顯示出單獨藥物治療的局限性。分子生物學和免疫學的迅速發展及各種新技術的出現和應用極大地推動了新型疫苗的研究，研究新的疫苗載體、探討新的疫苗形式，以獲得安全、穩定、有效的新型疫苗成為人們關注的熱點。中國發明專利申請200410065671.2公開了一種用作預防豬囊蟲病的基因工程疫苗及其製備方法。該疫苗是以B肝病毒的核心蛋白或B肝病毒的核心蛋白基因為載體，在該載體的第1位胺基酸全第183位胺基酸之間的多個位置上用基因工程方法插入豬囊尾蚴保護性抗原，構成預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗；其製備方法是以B肝病毒核心蛋白為載體，在B肝病毒核心蛋白(HBe)基因的第1位胺基酸至第183位胺基酸之間的多個位置上插入豬囊尾蚴保護性抗原基因，克隆至原核表達質粒或真核表達質粒上，轉化宿主菌，經誘導目的基因表達、獲得目的蛋白或柱純化真核表達質粒DNA，即可得到預防豬囊蟲病的亞單位蛋白疫苗或核酸疫苗。
發明內容本發明的第一個目的是提供一種豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因，預期這種重組基因對對豬囊蟲病的預防與治療有積極的作用；本發明的第二個冃的是提供這種豬帶絛蟲六鉤呦重組基因的製備方法；本發明的第三個目的是提供一種利用本發明公開的豬帶滌蟲六鉤蚴重組基因製備用於治療或預防豬囊蟲病的藥物或疫苗，特別是一種可以口服使用的、有較好免疫作用的疫苗以及這種疫苗的製備方法。本發明的重組基因是將豬帶絛蟲六鉤蚴的TsoL18基因原始序列中的第1至第48位信號肽鹼基全部去除，並將截去信號肽的TsoL18基因序列中的第12位鹼基a突變為t、第333位鹼基a突變為c、第335位鹼基a突變為c、第336位鹼基a突變為t。本發明的豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因的一種製備方法是取豬帶緣蟲末端成熟的孕卵節片，從中取出孵化和激活的六鉤蚴，提取六鉤呦的總RNA，以六鉤蚴的總RNA為模板進行RT-PCR，製備TsoL18目的基因，採用的上、下遊引物分別是-上遊弓l物Pl:5，-ccggaattcgcagcggtgaccgtacattcgg-3，下遊弓l物P2:5，-acgc2tcgacctacgaacggcggaccttettgt-3，本發明的豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因可以用於製備防治囊蟲病的藥物或者用於製備防治囊蟲病的疫苗。其一個具體的實施例是製備一種可口服使用的防治囊蟲病的疫苗，這種疫苗是含前述的豬帶緣蟲六鉤蚴重組基因的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌細胞，其中所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌攜帶有豬帶絛蟲六鉤呦TsoL18重組基因，並且該基因能夠在減毒鼠傷寒沙門氏菌內和/或沙門氏菌寄生的免疫效應細胞內表達。上述的防治豬囊蟲病的口服疫苗的製備方法是將本發明的豬帶緣蟲六鉤蚴重組基因與沙門氏菌表達載體pYA3342連接構建重組表達載體pYA3342-TsoL18，電轉化大腸桿菌X6212，得到X6212(pYA3342-TsoL18)，從其提取重組質粒，CaCl2法轉化沙門氏菌中間宿主X3730，使重組質粒獲得鼠傷寒沙門菌的甲基化模式，再從X3730菌中分離重組質粒，電轉化終宿主疫苗株X4550，得到重組菌X4550(pYA3342-TsoL18)，即本發明的疫苗。鼠傷寒沙門氏菌(5b/mo"e〃aO^/2/wwn'MW)是一種可產生局部或全身感染的胞內病原體，通過基因工程方法減毒的沙門氏菌對宿主致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，對黏膜組織有很強嗜性。沙門氏菌活載體疫苗經口服免疫動物後可直接將攜帶外源基因的表達載體運送至抗原遞呈細胞內進行有效表達，誘導特異性的免疫應答反應，並且，減毒沙門氏菌的脂質體類物質、細菌DNA的未甲基化的基序(mo^/)和細菌CpG序列等還可以發揮免疫佐劑的作用，大大增強疫苗的免疫原性，能激發動物產生強大的體液、細胞和黏膜免疫反應。目前利用沙門氏菌作為疫苗活載體表達細菌、病毒和寄生蟲抗原在不同的動物模型上已得到實驗證明能產生有效的免疫應答。例如，減毒鼠傷寒沙門氏菌已被成功地應用在李斯特菌DNA疫苗的研究中，攜帶編碼李斯特菌溶血素基因的真核表達載體的S/y^"'附"""w以口服途徑感染小鼠後能誘導產生高效價的抗溶血素抗體，而且還能誘導CDs+和CD4+T細胞反應，T輔助細胞還可產生高水平的幹擾素y(IFN-Y)和白介素4(IL-4)，並且能抵禦致死劑量的李斯特菌攻擊；Darji等將lacZ基因置於CMV啟動子下遊，以S.0^/"VmWMm基因突變株為載體口服途徑免疫小鼠，可誘導產生特異性抗體、T細胞增殖以及CTL反應；Shata等研究發現以沙門氏菌為載體攜帶HIV-lgpl40基因DNA疫苗和直接肌肉注射裸DNA可以誘導同等強度的CD8+T細胞反應；paglia等直接注射編碼有綠色螢光蛋白(GFP)的質粒和以沙門氏菌為載體經口服途徑免疫後，經流式細胞儀計數發現，兩者脾臟中帶有GFP標誌的樹突狀細胞數目相近；Marcda等成功地用減毒鼠傷寒沙門氏菌缺失株CVD915(guaBA缺失株)攜帶編碼破傷風毒素C片段的質粒pTETnirl5通過鼻內接種小鼠，誘導小鼠產生了針對C片段的高滴度的IgGl、IgG2a和IgG2b抗體，同時也顯示了小鼠脾細胞針對鼠傷寒沙門氏菌和C片段的增殖反應和IL-2、IFN-y的產生；Doggett等將引起齲齒病的索布瑞鏈球菌I/II型抗原表面蛋白(SpaA)基因克隆入減毒鼠傷寒沙門氏菌X4072(pYA2905,cya,crp/asd)中，然後用這種細菌口服免疫小鼠，發現小鼠血清中抗SpaAIgG的滴度很高，而腸道中抗SpaAIgG的滴度也能檢測出來；Oscar應用I型溶血素(HlYi)分泌系統，使減毒鼠傷寒沙門氏菌SL3261和CVD908-htrA表達胞外分泌惡性疙原蟲子孢子表面蛋白2(SSP-2)，經鼻內免疫小鼠結果顯示，它能激發機體產生特異性細胞介導的免疫應答(如產生IFN-Y的細胞)，這些都為應用減毒沙門氏菌研製活載體疫苗奠定了堅實的基礎。豬帶絛蟲六鉤呦通過腸道入侵宿主，與六鉤呦的入侵有關的TsoL18(%embso//wwowco^/^rcl8)蛋白是六鉤呦階段的重要抗原分子，主要存在於六鉤蚴感染中間宿主後的早期，在不同地理分離株的豬帶絛蟲六鉤蚴中，TsoL18基因相當保守，這表明TsoL18在豬帶絛蟲六鉤呦的發育階段是至關重要的，並且，TsoL18抗原對宿主還具有很好的保護性，TsoL18重組抗原的免疫血清能在體外試驗中殺死六鉤呦，因此TsoL18抗原成為預防豬囊尾蚴病重要的疫苗候選抗原之一。在以往的研究中，TsoL18抗原在原核表達系統中多以包涵體形式表達，可溶性蛋白的表達量極低，儘管包涵體的形成對表達產物的純化非常有利，但TsoL18包涵體經變性、復性後的蛋白極不穩定，免疫效果也受到很大影響，並且蛋白純化工藝十分複雜，成本較高，因而大大影響了TsoL18重組蛋白的應用。研究發現，影響真核基因在原核系統中表達水平的因素很多，諸如不同的載體系統、菌種、誘導表達條件、以及目的基因本身的鹼基組成等等。在載體系統確定以後主要決定因素是目的基因的鹼基組成，其中稀有密碼子的多少是影響外源蛋白表達量的關鍵因素，尤其是起始密碼子附近的稀有密碼子對目的蛋白的表達量影響更大。研究證明緊接起始密碼子下遊的序列在翻譯起始過程中發揮重要作用，在轉錄本5'末端附近存在稀有密碼子將會影響翻譯效率，高度表達的基因比低表達的基因表現更大程度的密碼子偏好，通過用常用密碼子替換稀有密碼子或與"稀有"tRNA基因共表達可以提高外源基因在細菌中的表達水平，並且，細菌中基因表達對不偏愛的稀有密碼子(AGA、AGG)表達效果差，特別當有AGA-AGG連續序列存在時表達效率更低。另外研究還證明目的基因序列N端的分泌信號對真核基因在原核系統中表達產物的穩定性影響很大，Lightowler等研究證明當羊絛蟲45W基因缺失N端17個胺基酸信號肽時，表達蛋白的可溶性大量增加，重組抗原的穩定性也大大提高。沙門氏菌活載體疫苗作為一個新型疫苗的研究熱點，應用發展十分迅速，但利用減毒鼠傷寒沙門氏菌研製豬囊尾蚴口服活載體疫苗的研究尚未見報導。本發明的目的通過基因工程改造豬帶絛蟲六鉤蚴TsoL18基因，並將其連接到減毒鼠傷寒沙門氏菌表達載體，構建攜帶TsoL18基因的減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株，從而提供一種簡便、長效、全方位誘導免疫反應等特點的口服活載體疫苗。本發明的優點是-1、本發明的重組基因通過PCR擴增截去TsoL18基因N端的16個胺基酸的信號肽序列，並對截去TsoL18基因序列的第12(a突變為t)、333(a突變為c)、335(a突變為c)、336(a突變為t)位的四個細菌表達稀有密碼子進行了定點突變，將TsoL18基因起始密碼子附近的影響細菌表達的稀有密碼子突變為細菌表達偏愛密碼子，但不改變其胺基酸組成。這些改造增加了TsoL18基因在沙門氏菌中的可溶性表達，TsoL18蛋白的穩定性也有很大提高。2、本發明中利用的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體作為工程菌能直接在腸壁表達目的蛋白，表達的蛋白可通過腸壁微褶細胞靶向感染樹突狀細胞等專職抗原遞呈細胞(APC)，有效的避免目的蛋白的降解；六鉤蚴是通過腸道入侵宿主，口服攜帶TsoL18抗原的重組沙門氏菌活載體疫苗，可以阻斷六鉤蚴通過小腸黏膜入侵宿主，從而達到保護宿主的目的。3、本發明利用的減毒鼠傷寒沙門氏菌是一種侵襲性的腸道胞內寄生桿菌，作為載體攜帶並表達外源基因，經免疫後不僅誘導機體產生針對目的抗原的免疫應答，而且能產生針對載體本身的免疫應答，增加了疫苗的免疫範圍。4、本發明的活疫苗載體減毒鼠傷寒沙門氏菌的脂質體類物質、細菌DNA的未甲基化的基序(motif)和細菌CpG序列等還可以發揮免疫佐劑的作用，大大增強了疫苗的免疫原性。5、本發明中以減毒鼠傷寒沙門氏菌作載體的口服活疫苗可誘導Thl和Th2混合免疫應答模式，而豬在感染囊尾蚴的不同期內免疫應答型式是不同的，早期以Thl細胞佔優勢，在中後期以Th2細胞佔優勢，這樣本發明的活載體疫苗誘導的免疫類型與豬感染囊尾呦後激發的自身免疫應答類型相符合，能更好的發揮本疫苗的免疫效果。6、本發明的活疫苗載體減毒鼠傷寒沙門氏菌入侵宿主後，一段時間內能在宿主細胞內寄生和有限增殖，其表達的外源蛋白對宿主持續刺激，可省去反覆多次的加強免疫。7、本發明的疫苗所表達的靶抗原不需在體外表達、分離、純化和復性，可直接用於免疫保護，免去了蛋白質後處理的複雜工序，且其製備價格低廉，易於生產、儲存和運輸。8、本發明的疫苗菌株通過實驗證明能穩定的攜帶表達載體在體內外連續穩定的傳代，表達的蛋白具有免疫原性，並能誘導小鼠產生相應抗體，為豬囊尾蚴病的防治和豬囊尾呦疫苗的研究開闢了一個新的途徑。圖1是本發明中重組表達載體的構建流程及最終結構示意圖。圖2是本發明所涉及到的TsoL18目的基因PCR的凝膠電泳圖，圖中l為DNAMarkerDL2000;2為TsoLl8經PCR後的產物。圖3是本發明所涉及到的TsoL18目的基因的凝膠回收電泳圖，圖中1為TsoL18經PCR回收的產物；2為DNAMarkerDL2000。圖4是本發明所涉及到的重組表達質粒pYA3342-TsoL18的酶切鑑定圖，圖中1為DNAMarkerX-EcoT14Idigest;2為重組質粒pYA3342-TsoL18;3為重組質粒pYA3342-TsoL18ASalI;4為重組質粒pYA3342-TsoL18/￡coRI;5為重組質粒pYA3342-TsoLl8ASalI十五coRI;6為DNAMarkerDL2000。圖5是本發明所涉及到的X4550(pYA3342-TsoL18)和X4550(pYA3342)的尿素-SDS-PAGE結果圖，圖中1為X4550(pYA3342-TsoL18);2為ProteinMolecularWeightMarker;3為X4550(pYA3342)。圖6是本發明所涉及到的X4550(pYA3342-TsoL18)和X4550(pYA3342)的Western-blot結果圖，圖中1:ProteinMolecjilarWeightMarker;2:X4550(pYA3342-TsoL18);3:X4550(pYA3342)。圖7是本發明所涉及到的重組菌穩定性試驗中的連續傳代100代後隨機調取117株重組菌的培養生長情況圖。圖8是本發明所涉及到的重組菌的生長曲線圖。圖9是本發明所涉及到的不同組小鼠抗體水平變化圖。具體實施方式以下提供具體實施例方式1.本發明所使用的菌種和質粒大腸桿菌X6212(Aasd)(以下簡稱X6212)、沙門氏菌中間宿主X3730(Aasd,Tcs，Strr，AGal)(以下簡稱X3730)、沙門氏菌終末宿主X4550(Aasd，Acrp,Nar,Acya)(以下簡稱X4550)及沙門氏菌表達載體pYA3342(asd+表達載體,asd7asd+)。以上菌種公開於美國專利US6872547。2.TsoL18目的基因的製備1)豬帶絛蟲蟲卵的孵化和激活用炒熟的南瓜籽搗碎灌服絛蟲病患者，30min後服用濃縮的的檳榔汁驅蟲，以保證蟲體的完整性和蟲卵的活力。根據節片長度選擇豬帶絛蟲末端成熟的孕卵節片，生理鹽水衝洗數次後，置平皿中用眼科剪刀剪碎節片，並擠壓研磨使蟲卵完全釋放出來，用100目銅網過濾除去體壁碎片，收集的濾液用生理鹽水3000r/min離心漂洗3次至顯微鏡檢查蟲卵完全乾淨為止。用生理鹽水懸浮蟲卵，加入等量次氯酸鈉(NaClO)後迅速混勻，立即置顯微鏡下觀察待大多數蟲卵破殼後，迅速加入等量的0.2mol/L硫代硫酸鈉(NaS203)混勻以終止反應。3000r/min離心洗滌除去蟲卵碎片，用生理鹽水重新懸浮沉澱，加入含胰酶和豬膽汁的孵化激活液，37。C作用45min，每隔10min吹打混勻1min，3000rpm離心棄上清，沉澱即為孵化和激活的六鉤蚴，將其液氮凍存。2)六鉤呦總RNA的提取埃Promega公司SVTotalRNAisolationsystem說明操作如下①從液氮中取出凍存的己激活六鉤蚴，置於微型勻漿器中，在冰浴中迅速研磨；②每管加入175^SVRNA裂解緩衝液，顛倒混合均勻；③轉移至一滅菌的DEPC處理的eppendorf管中，加350|ilSVRNA稀釋緩衝液，顛倒混合3-4次，7(TC水浴3分鐘；④13000g,4。C離心10分鐘，將上清液轉至一新鮮離心管中，加入200(il無水乙醇(95%)，吹打混合3-4次；⑤轉移混合物至SpinColumn,13000g，4。C離心1分鐘，倒出收集管中的液體；在spincolumn上加入600pl乙醇稀釋的SVRNA洗滌緩衝液，13000g，4"C離心1分鐘；⑦加入50piDNase溫育混合物(含5DNaseI、5jil0.09MMnCl2)覆蓋在柱面上，20-25。C孵育15分鐘後，再加入200plDNase終止液，13000g離心1分鐘；⑧分別加入600pd、250plSVRNA洗滌液，13000g，1分鐘離心洗滌兩次；⑨換一新的無RNase的eppendorf管，用100|al無核酸酶水洗脫RNA，置-70'C保存。3)Tso18基因的RT-PCR擴力①引物的設計與合成根據Genbank登錄的豬帶絛蟲TsoL18基因序列，設計上下遊引物P1、P2，上遊引物P1含有五coRl酶切位點，下遊引物P2含有Sa11酶切位點，通過設計的引物RT-PCR擴增時截去TsoL18基因N端的16個胺基酸的信號肽序列；利用GraphicalCodonUsageAnalyser2.0軟體分析截去信號肽的TsoL18基因序列的5'和3'端在細菌表達中屬於稀有密碼子的鹼基並通過引物設計定點突變該基因的第12(a突變為t)、333(a突變為c)、335(a突變為c)、336(a突變為t)位的四個細菌表達稀有密碼子，但不改變其所編碼蛋白。上遊弓l物PI:5，-ccggaattcgcagcggtgaccgtacattcgg-3，下訪,弓i物P2:5，-acgcgtcgacctacgaacggcggaccttcttgt-3'②RT-PCR擴增在0.5ml的PCR反應管中加入如下溶液及試試劑進行反轉錄TotalRNA懸液lOplOligo(dT)l^il充分混勻後置75。C水浴預變性5min，迅速於冰浴冷卻3min，然後加入下列試劑5xAMVbuffer(緩衝液)4jal2.5mmoldNTPMixture1pl脂aseinhibitor(50u/|xl)0.5pi禽源反轉錄酶(AMV，10U/|al)lplDEPC水2|ilt離心機離心混勻後，42。C水浴反應1小時，65°C5min滅活反轉錄PCR擴增雙鏈cDNA，在PCR反應管中配製如下反應體系:反轉錄產物10|il1OxPCRbuffer(Mg2+free)5jil2.5mmol/LdNTPMixture4piPI和P2引物(50pmol/|il)各0.5^25mmol/LMgCl24(il滅菌無離子水26(il混勻後置PCR擴增儀中，95'C預變性5分鐘後,加入0.5pl(5U/|il)TaqDNA聚合酶，進行如下循環35個循環，最後72"C延伸IO分鐘。擴增完成後，取PCR產物5fi1，加入6xDNA上樣緩衝液，用1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5pg/ml溴化乙錠，EB)電泳觀察，結果顯示目的條帶與預期的大小吻合，約為350bp，參見圖2。③PCR產物的回收與純化按TaKaRa公司的DNA膠回收試劑盒操作說明進行，取PCR回收產物5^U,加入lpl6xDNA上樣緩衝液，用1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5|ig/ml溴化乙錠，EB)電泳觀察結果，參見圖3。3.pYA3342-TsoL18重組質粒載體的構建和鑑定瓊脂糖凝膠回收的PCR產物和質粒載體pYA3342分別進行￡coRI、SalI雙酶切4h，膠回收約350bp的PCR產物和2.7Kb的質粒載體酶切目的片斷，T4DNALigase進行連接，連接體系目的片段，6^1;質粒載體，2phT4DNALigase，1T4DNALigaseBuffer,1pl(目的片段和質粒載體摩爾比約為5:1);16。C連接16h。挑取的LB瓊脂(含DAP50嗎/ml和NA20(ig/ml)平板上X6212單菌落，在含DAP的LB液中振搖培養過夜，製備電轉感受態X6212。將連接產物電轉化X6212，電轉化條件電壓2500V，25uF電容，200Q電阻，2mm電轉杯，放電時間35ms，轉化的X6212菌液37。C140rpm/min振搖1h，4000rpm/min離心10min，菌體沉澱溶於100jilLB培養液後塗LB(含20(iig/mlNA)瓊脂平板，37。C培養2024h，LB平板上有15個直徑約0.40.5mm大小菌落生長，隨機挑取4個單菌落振搖過夜，抽提質粒後用五coRl、Sall單酶切和￡coRIASalI雙酶切後，1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到約350bp和2.7kb兩條帶(圖4)，與預期相符。將酶切鑑定正確的菌落送TaKaRa公司測序，TsoL18測序結果與Genbank登錄的豬帶絛蟲TsoL18基因序列的同源性為97%，胺基酸同源性為100%。本發明重組的TsoL18所測序列如下(序列表中加粗斜體鹼基為發生突變的鹼基)agcggtgaccgtacattcggcgacgatattttcgtgccataccttcgctg50cttcgcccttagcgctaccgaaattggggtgttttgggatgctggagaga100tggttggccatggcgtagaggagatca犯gtgaaagtagaaaaagcaata150cacccatacaagatctggaatgcaacagtcagcgcgaacaatggaaaagt200catcatcagagacttgsaggcgaagac3atttscagagtggacgtagacg25094。C56。C72。Cgttatcgaaacgaaatcatggtgtttggttcgcagcgtttcgcgacaaca300cttccgaaaaagcagatcaagccc"gaaggtccgaagatcgtag345GenBank上登錄的豬帶絛蟲六鉤蚴TsoL18基因(AF017788)序列如下(其中用加粗斜體表示的序列為N端的16個胺基酸的信號肽序列)"欲^t^te欲"&""cstc"c"《《t^cc^tc《""欲c卵g50cggtgaccgaacattcggcgacgatattttcgtgccataccttcgctgct100tcgcccttagcgctaccgaaattggggtgttttgggatgctggagagatg150gttggccatggcgtagaggagatcaaagtgaaagtagaaaaagcaataca200cccatacaagatctggastgcaacagtcagcgcgaacaatggaaaagtca250tcatcagagacttgaaggcgaagacaatttacagagtggacgtagacggt300tatcgaaacgaaatcatggtgtttggttcgcagcgtttxgcgacaacact350tccgaaaaagcagatcaagcacaagaaggtccgaagatcgtag3934.疫苗的製備與檢測4.1重組質粒轉化終宿主減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550從大腸桿菌X6212(pYA3342-TsoL18)中抽提重組質粒，CaCl2法轉化沙門氏菌中間宿主X3730，使重組質粒獲得鼠傷寒沙門菌的甲基化模式，再從X3730菌中分離重組質粒，電轉化終宿主疫苗株X4550，得到重組菌X4550(pYA3342-TsoL18)，即本發明的疫苗，其構建流程及最終結構參見圖1，其過程中的電轉化條件同上所述。同法構建空質粒菌X4550(pYA3342)作為空白對昭。4.2TsoL18基因的表達及Westrenblotting分析重組菌X4550(pYA3342-TsoL18)和空質粒菌X4550(pYA3342)經IPTG(終濃度lmmol/L)誘導6h後，離心收集菌體，加8M尿素溶液溶解作用半小時，加2倍的尿素膠上樣Buffer,煮沸5分鐘，進行尿素-SDS-PAGE。將上述尿素-SDS-PAGE凝膠電轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)，蛋白Marker置氨基黑染色液中浸染35min，取出後用漂洗液脫色，直至背景藍色脫盡；其餘NC膜用PBST漂洗三次後，用2%牛血清白蛋白37。C封閉1h後漂洗三次，加入兔抗TsoL18血清4。C過夜後，漂洗三次加羊抗兔IgG37。C結合1h，PBST漂洗三次，將NC膜轉移至底物溶液中，室溫避光輕搖3min觀察顯色情況，待出現條帶時立即轉入PBST緩衝液中室溫保存。尿素-SDS-PAGE電泳結果顯示分子量約為13ku的TsoL18目的蛋白在X4550中有較高的表達，與預期的蛋白分子量一致，參見圖5。Westernblot結果顯示，在約13ku位置上有相應的顯色條帶(圖6)。說明X4550(pYA3342-TsoL18)中表達的TsoL18抗原蛋白具有抗原性，能與抗TsoL18抗體反應。4.3重組菌X4550(pYA3342/TsoL18)的體外穩定性測試將37。C振蕩培養過夜的菌體按10%接種於含DAP的LB培養基中，繼續培養12h，將上述培養物再按10。/。量接種於含DAP的LB液體中培養12h，如此連續培養四次至50h後(相當於菌體傳代100代)，將培養物稀釋106倍，取100ul稀釋液塗含DAP的LB瓊脂平板，過夜培養後，隨機挑選100個單菌落，轉種在DAF的LB瓊脂平板上，如果質粒丟失，細菌不會在DAF的LB瓊脂平板上生長，以此測定重組質粒的穩定性。隨機挑取20個菌落進行抗原的表達，以確定TsoL18基因在減毒鼠傷寒沙門氏菌宿主內表達的穩定性。結果顯示重組菌X4550(pYA3342-TsoL18)在沒有選擇壓力的情況下連續傳代100代，隨機挑選117個菌落轉移至DAP'平板，所有菌株都能生長，參見圖7。隨機挑取的20個質粒進行誘導表達，均有目的抗原表達，表明重組質粒pYA3342-TsoL18能穩定存在減毒宿主菌X4550內。4.4重組菌的生長曲線的測定挑取X4550(pYA3342)和X4550(pYA3342-TsoL18)單克隆菌株，分別接種於LB液體培養基中，37。C過夜培養，從培養液中再取50)il接種於5mlLB液體培養基中，37。C振搖培養，每隔l小時測定OD,值(表一)，繪製測定菌生長曲線，參見圖8。從圖8可以看出各種菌的生長狀態基本一致，即表示重組陽性載體轉入減毒沙門氏菌中，不影響該菌的新陳代謝和生長。表lX4550(pYA3342)和X4550(pYA3342-TsoL18)培養不同時間的OD,值tableseeoriginaldocumentpage124.5重組菌(即疫苗株)的安全性實驗通過BALB/c小鼠口服不同劑量的重組菌來確定，小鼠先禁食12小時，禁水4小時，灌胃前30min每隻小鼠先用10%的碳酸氫鈉100pl灌胃以中和胃酸，然後將重組菌灌胃免疫，30min後再給小鼠提供水和食物，實驗結果見表二。結果顯示口服重組菌株X4550(pYA3342-TsoL18)2.0x1012cfu30天後，存活率仍為100%。而據已有研究報導C57BL/6小鼠口服野生株X3181lxl0"cfu後，在5天內全部死亡，這也證明本發明的重組菌株是安全的。表2小鼠口服不同劑量的重組鼠傷寒沙門氏菌後的存活率tableseeoriginaldocumentpage125小鼠免疫實驗1820gBALB/c小鼠30隻隨機分成三組，分別為X4550(pYA3342-TsoL18)免疫組、X4550(pYA3342)免疫對照組和空白對照組，各免疫二次，免疫間隔2周，1.92.5xl09菌株/次按上述方法灌胃，每次免疫前及二免後兩周、四周斷尾採血ELISA測定抗體水平。小鼠口服免疫後各組抗體水平統計分析結果見表三，圖9顯示X4550(pYA3342-TsoL18)免疫組抗體水平有明顯的升高，而X4550(pYA3342)免疫對照組和非免疫對照組的抗體水平沒有明顯的變化，證明X4550(pYA3342-TsoL18)疫苗株能誘導機體產生目的抗體，具有免疫效果。表3小鼠口服重組活載體疫苗後血清中抗體水平的測定結果""^->>><^抗體水平組i""^^^5±S一免前二免前二免後兩周二免後四周X4550(pYA3342-TsoL18)a0.021±0.0010.089±0.0070.277±0細0.645±0.025X4550(pYA3342)b0.021±0.0020.021±0.0010.024±0.0020.024±0.004非免疫對照組b0.022±0.0010.021±0.0020.024±0.0030.023±0.004註標注字母不同組，差異極顯著(P<0.01);標註字母相同組，差異不顯著(P〉0.05)。以上試驗表明，本發明通過對豬帶絛蟲六鉤呦TsoL18基因進行改造，使其更適應在沙門氏菌內表達；本發明的疫苗株能穩定的攜帶減毒鼠傷寒沙門氏菌表達載體在體內外連續傳代，表達的蛋白具有良好免疫原性，並能誘導小鼠產生目的抗體，為豬囊尾蚴病的防治和疫苗製備開闢了一個新的途徑。權利要求1、一種豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因，其特徵是將豬帶絛蟲六鉤蚴TsoL18基因原始序列中的第1至第48位鹼基(信號肽)全部去除，並將所剩基因序列中的第12位鹼基a突變為t、第333位鹼基a突變為c、第335位鹼基a突變為c、第336位鹼基a突變為t。2、權利要求l所述的豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因的製備方法，其特徵是以提取的豬帶絛蟲六鉤蚴RNA為目的物，根據所用的模板設計上、下遊引物，採用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)製備重組基因。3、根據權利要求2所述的豬帶絛蟲六鉤呦重組基因的製備方法，其特徵是取豬帶絛蟲末端成熟的孕卵節片，從中取出孵化和激活的六鉤呦，再提取六鉤呦的總RNA，以六鉤蚴的總RNA為模板進行RT-PCR，採用的上、下遊引物分別是上遊弓I物P1:5,-ccggaattcgcagcggtgaccgtacattcgg-3，下、遊弓1物P2:5，-acgcgtcgacctacgaacggcggaccttcttgt-3，4、權利要求1所述的豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因用於製備防治豬囊蟲病的藥物。5、權利要求1所述的豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因用於製備防治豬囊蟲病的疫苗。6、一種由權利要求1所述的豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因製備的防治豬囊蟲病的疫苗，其特徵是該疫苗以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體，重組減毒鼠傷寒沙門氏菌攜帶有豬帶絛蟲六鉤呦TsoL18重組基因，該基因能夠在減毒鼠傷寒沙門氏菌內和/或沙門氏菌寄生的免疫效應細胞內表達。7、權利要求6所述的防治豬囊蟲病的疫苗製備方法，其特徵是將權利要求1所述的豬帶絛蟲六鉤呦重組基因與沙門氏菌表達載體pYA3342連接構建重組表達載體pYA3342-TsoL18，電轉化大腸桿菌X6212，得到X6212(pYA3342-TsoL18)，從其提取重組質粒，CaCl2法轉化沙門氏菌中間宿主X3730,使重組質粒獲得鼠傷寒沙門氏菌的甲基化模式，再從X3730菌中分離重組質粒，電轉化終末宿主疫苗株X4550，得到重組菌X4550(pYA3342-TsoL18)。全文摘要本發明公開一種豬帶絛蟲六鉤蚴重組基因和這種重組基因的製備方法，以及這種重組基因的用途，特別是採用這種重組基因製備的用於防治豬囊蟲病的口服疫苗和製備這種疫苗的製備方法。本發明的重組基因是將豬帶絛蟲六鉤蚴的TsoL18基因原始序列中信號肽鹼基去除，並對部分鹼基進行突變。本發明的疫苗是重組減毒鼠傷寒沙門氏菌攜帶有前述豬帶絛蟲六鉤蚴TsoL18重組基因，並且該基因能夠在減毒鼠傷寒沙門氏菌內和/或沙門氏菌寄生的免疫效應細胞內表達。文檔編號C12N15/10GK101275140SQ20071030525公開日2008年10月1日申請日期2007年12月27日優先權日2007年12月27日發明者丁軍濤,才學鵬,景志忠,穎王,鄭亞東,陳曉宇,駱學農申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所