一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法
2023-05-28 10:44:06 2
專利名稱：一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法
技術領域：
一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，本發明涉及ー種以陰離子交換層析為主要手段的重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，屬於生物製品分離純化技術領域。
背景技術：
氨肽酶(aminopeptidases,——APs,EC 3. 4. 11)是ー類能夠水解蛋白質和多肽N端胺基酸的外切蛋白水解酶，廣泛存在於動植物以及微生物中。氨肽酶根據最易反應底物的不同可以分為亮氨酸氨肽酶、賴氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脫苦和蛋白質的深度水解中有著重要作用，目前主要用於食品エ業中，包括魚肉類加工エ業、植物類加工エ業以及以微生物為原料的加工エ業等，它可以増加游離胺基酸的量，改善風味，提高營養價值，還可以作為醬油醬料等調味品的添加剤。 目前國內的氨肽酶產品生產尚屬空白，所用氨肽酶基本為國際產品，純度較高，價格也較為昂貴，而本發明g在開發出ー種從分泌表達亮氨酸氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌發酵液中分離純化出高純度、高得率的電泳級氨肽酶的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法。本發明的具體步驟如下I)將發酵液離心去除菌體，收集發酵上清液；2)將發酵上清液經過硫酸銨分級沉澱，收集的蛋白沉澱溶解後進行透析；3)將透析後的酶液加入到用Tris-HCl緩衝液A(含50mmol/L Tris, pH 8. 5)平衡好的DEAE陰離子交換柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow中，用Tris-HCl緩衝液B(含50mmol/L Tris, lmol/L NaCl』pH 8. 5)梯度(0-60% )洗脫4個柱體積,流速為 2. 5ml/min,收集各個出峰蛋白；4)分光光度法檢測亮氨酸氨肽酶酶活，確定活性蛋白部分。本發明所述發酵液是指出發菌株為重組枯草芽孢桿菌(含連接了來源於枯草芽抱桿菌Zj016氨妝酶基因全序列的PMA5質粒，宿主菌為Bacillus subtilis WB600)。TB發酵培養基，發酵條件37°C，200rpm培養32h。所述枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶基因全序列中開放閱讀框序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο本發明的詳細的步驟為(I)將重組枯草芽孢桿菌(含連接了來源於枯草芽孢桿菌ZjOie氨肽酶基因全序列的PMA5質粒，宿主菌為Bacillus subtilis WB600)發酵，誘導表達條件為37°C，200rpm培養32h ；(2)將發酵液離心去除菌體，收集發酵上清液；(3)硫酸銨沉澱
向發酵上清液中加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，至飽和度為60%，緩慢攪拌至其完全溶解。調節PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時後10000 Xg低溫離心IOminJg溫離心去除蛋白沉澱收集上清液。再向上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為70%，緩慢攪拌至其完全溶解。調節PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時後10000 Xg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉澱。將沉澱溶解在Tris-HCl緩衝液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)中並且4°C透析數小時；(4) DEAE離子交換層析將透析後的酶液加入到用Tris-HCl緩衝液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)平衡好的 DEAE 陰離子交換柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow 中，用 Tris-HCl 緩衝液B(含 50mmol/L Tris, lmol/L NaCl，pH 8. 5)進行梯度洗脫，0-60%洗脫4個柱體積，流速為2. 5ml/min，收集各個出峰蛋白；(5)分光光度計法檢測出峰蛋白酶活
酶活測定條件以L-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，在50mM pH 8. 5的Tris-HCl緩衝液中加入稀釋一定倍數的酶液和底物(lmM)，50°C水浴反應lOmin，在405nm下測定吸光度；酶活定義在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生ΙμΜ對硝基苯胺所需的酶量為ー個酶活單位(IU)。本發明的有益效果本發明提供了一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，該方法エ藝簡單，得率高，能得到純度較高的重組亮氨酸氨肽酶。
圖I. DEAE離子交換層析色譜圖；圖2.重組亮氨酸氨肽酶表達SDS-PAGE圖(I、蛋白分子量標準；2、發酵上清液；3、分離純化的重組亮氨酸氨肽酶)。
具體實施例方式材料和檢測方法重組枯草芽孢桿菌(含連接了來源於枯草芽孢桿菌ZjOie氨肽酶基因全序列的ΡΜΑ5 質粒,宿主菌為 Bacillus subtilis WB600)。表達培養基I. 2%胰蛋白腖，2. 4%酵母提取物，O. 4%甘油，17mM KH2P04,72mMK2HP04。氨肽酶酶活測定方法以硝基苯胺為標準品作標準曲線。恆溫水浴鍋調到50°C，將底物(L-leucine-p-nitroanilide, 4mmol/L) lmL、適當稀釋的待測樣品 ImL 和 2mLTris-HCl緩衝液(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)混合,放入水浴鍋計時IOmin後,在405nm下用分光光度計測定吸光度。酶活力単位定義在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生I μ M對硝基苯胺所需的酶量為ー個酶活單位(IU)。實施例I重組枯草芽孢桿菌(含連接了來源於枯草芽孢桿菌ZjOie氨肽酶基因全序列的ΡΜΑ5質粒，宿主菌為Bacillus subtilis WB600)種子液按照I %的接種量轉接至表達培養基中，37°C，200rpm 培養 32h。實施例2
(I)將發酵液離心去除菌體，收集發酵上清液；(2)硫酸銨沉澱向發酵上清液中加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，至飽和度為60 %，緩慢攪拌至其完全溶解。調節PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時後10000 Xg低溫離心IOminJg溫離心去除蛋白沉澱收集上清液。再向上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為70%，緩慢攪拌至其完全溶解。調節PH值，使酶液的pH保持在8. 5，靜置ー小時後10000 Xg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉澱。將沉 澱溶解在Tris-HCl緩衝液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)中並且4°C透析數小時；(3) DEAE離子交換層析將透析後的酶液加入到用Tris-HCl緩衝液A(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)平衡好的 DEAE 陰離子交換柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow 中，用 Tris-HCl 緩衝液B(含 50mmol/L Tris, lmol/L NaCl, pH 8. 5)進行梯度洗脫，0-60%洗脫4個柱體積，流速為2. 5ml/min,收集各個出峰蛋白；(4)分光光度計法檢測出峰蛋白酶活恆溫水浴鍋調到50°C,將底物(L-leucine-p-nitroanilide,4mmol/L) lmL、適當稀釋的待測樣品ImL和2mL Tris-HCl緩衝液(含50mmol/L Tris,pH 8. 5)混勻，放入水浴鍋計時IOmin後,在405nm下用分光光度計測定吸光度,並計算酶活。
權利要求
1.一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，是採用陰離子交換柱分離純化重組亮氨酸氨肽酶。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述陰離子交換柱是HiprepDEAE16/10Fast Flowο
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述亮氨酸氨肽酶由重組枯草芽孢桿菌分泌表達。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述重組枯草芽孢桿菌構建方法將編碼成熟氨肽酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. I連接大腸-枯草穿梭載體PMA5後轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在幹，所述重組枯草芽孢桿菌的表達培養基為I.2%胰蛋白腖，2. 4%酵母提取物，O. 4%甘油，17mM KH2P04,72mM K2HP04。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述重組枯草芽孢桿菌表達條件為37°C，200rpm 培養 32h。
7.權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟如下1)將發酵液離心去除菌體，收集發酵上清液；2)將發酵上清液經過硫酸銨分級沉澱，收集的蛋白沉澱溶解後進行透析；3)將透析後的酶液加入到用pH8. 5的Tris-HCl緩衝液平衡好的陰離子交換柱Hipr印DEAE 16/10Fast Flow中，用含氯化鈉pH 8. 5的Tris-HCl緩衝液線性梯度洗脫，收集活性部分。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述用於洗脫的含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液，流速2. 5ml/min，線性範圍為0-0. 6mol/L，洗脫柱體積為4個。
全文摘要
本發明公開了一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，是採用陰離子交換層析純化重組亮氨酸氨肽酶，屬於生物製品分離純化技術領域。本發明方法工藝簡單，得率高，能得到純度較高的重組亮氨酸氨肽酶。
文檔編號C12N9/48GK102827822SQ201210345248
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者周哲敏, 高新星, 田亞平, 崔文璟, 周麗, 丁寧 申請人:江南大學