用於預防或治療過敏原引起的氣道疾病的疫苗的製作方法

2023-05-27 18:51:06

專利名稱：用於預防或治療過敏原引起的氣道疾病的疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於預防或治療過敏原引起的氣道疾病的疫苗。
背景技術：
過敏性哮喘的發病機理還不清楚，然而目前的認識包括⑶4+Th2細胞的擴增，以及對其他無害的環境過敏原耐受的破壞(Romagnani等人J Allergy ClinImmunol 2004 ； 113(3) :395-400)。與環境影響關聯的遺傳易感性似乎影響Th2介導的應答的正常抑制。 已推測在胎兒和新生兒發育期間肺成熟的異常可引起氣道更易感於環境過敏原，從而有利於向Th2表型的極化並因此使個體傾向於特異反應性和哮喘。過敏原引起IL-4、IL-5和 IL-3的產生是典型的過敏性病理以及這種Th2細胞因子的分泌啟動B細胞向IgE的同種型類別轉換，增加粘液產生和嗜曙紅細胞向氣道的募集。因為⑶4+Th2細胞在一些過敏症中代表協調細胞(co-ordinating cell)類型，所以這提示對反平衡響應(counterbalancing response)的誘導可防止特應性疾症的後續發展。根據Mrachan』 s衛生假說(hygiene hypothesis) WS-^M (Romagnani 等 Int Arch Allergy Immunol 1992 ；98 (4) 279-85)，接觸微生物可激活改變Thl、Th2和Treg應答的先天免疫途徑。這導致T輔助細胞2細胞擴增的抑制，以及後續的向IgE的同種型轉換的抑制。然而，幾項研究已經表明病毒和細菌感染在呼吸道疾病的惡化方面有作用。例如，呼吸道合胞體病毒和Thl誘導惡性百日咳桿菌(Bordetella pertussis)感染(Ennis 等人 Clin Exp Allergy 2004 ；34(9) 1488-97)使動物模型中的過敏性炎症惡化。革蘭氏陰性百日咳桿菌引起百日咳，一種在全世界範圍內造成重大的幼兒發病率和死亡率的嚴重呼吸道疾病。儘管通過死的全細胞疫苗(Pw)或更新近的非細胞亞單位疫苗(Pa)的免疫已經成功了，但已報導該疾病在年輕成年人中再度出現(Das P. Lancet Infect Dis 2002 ；2 (6) :322)。通常，百日咳桿菌不會急性感染該年齡組；然而被感染的成年人可起到儲主的作用並增加幼兒在接種疫苗前感染該疾病的可能性。最新近的疫苗接種方案要求接種三次，在出生後的2個月開始，是6個月達到最佳保護所需要的。因此，需要一種誘導強烈保護新生兒對抗百日咳桿菌的疫苗。儘管誘導了 Thl免疫，惡性百日咳桿菌感染在過敏原引起的炎症的鼠科模型中惡化氣道病理(Ennis 等人 Clin Exp Allergy 2004 ；34 (9) :1488-97)。Th2 誘導的 Pa 疫苗對抗百日咳桿菌誘導的過敏性哮喘的惡化，但在全身或局部水平都誘導IL-13(Ermis等人 Clin Diagn Lab Immunol 2005 ； 12 (3) :409-17)。相反，利用 Thl 誘導 Pw 的全身免疫抑制過敏性氣道反應性(Mills等人DevBiol Stand. 1998 ；95 :31-41)，表明過敏原引起的疾病的保護並不是簡單的Thl/Th2應答的調節，但與激發時氣道損傷的程度有關，以至於在氣道上皮間充葉單位的破壞過程中經呼吸道氣道的過敏原激發可能是比Thl/Th2/Treg極化更重要的因素。最近，已經開發了一種抗百日咳桿菌的遺傳減毒活疫苗BPZEl作為對抗百日咳的候選新生兒疫苗(Mielcarek等人PLoS Pahog 2006 ；2 (7) :e65)。這種活的重組百日咳桿菌菌株在鼻內給藥時誘導強烈的局部和全身免疫應答。通過鼻途徑給藥模擬自然感染並預期在1個月齡以上的孩子中產生長效免疫(Mascart等人，J Immunology 2003 ；170(1) 1504-9)。三種毒性因子已經被確定為減毒的目標百日咳毒素、氣管細胞毒素和皮壞死毒素。利用等位基因交換，編碼這些毒素的基因被缺失或用遺傳滅活的類似物替換以誘導保護，而沒有與野生型感染相關的嚴重病理。然而，施用BPZEl對第三方過敏原激發和過敏原誘導的病理的影響還是未知的。

發明內容
本發明涉及一種用於預防或治療過敏原引起的氣道疾病的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其是氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮壞死毒素(DNT)缺陷的。本發明涉及一種用於預防或治療受試者中過敏原引起的氣道疾病的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其中所述活的減毒百日咳桿菌疫苗是氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮壞死毒素(DNT)缺陷的。本發明還涉及活的減毒百日咳桿菌疫苗在製備用於預防或治療過敏原引起的氣道疾病的藥物中的用途，該疫苗是氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮壞死毒素 (DNT)缺陷的。本發明的詳細說明過敏原引起的氣道疾病的例子是過敏性哮喘、枯草熱、間質性肺病(包括肺纖維化)。間質性肺病(包括肺纖維化)可以由職業的或環境的暴露而引起。不受限於理論， TCT、PTX和DNT缺陷的活的減毒百日咳桿菌疫苗會在環境暴露(暴露於引發間質性肺疾病的試劑)期間降低氣道損傷和重建(remodelling)並還對抗毒性百日咳桿菌的肺纖維化惡化。「受試者」是指人。通常受試者是新生兒、幼兒或成人。氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮壞死毒素(DNT)缺陷的活的減毒百日咳桿菌疫苗已經記載在 W02007/104451 和 Mielcarek 等人(PLoS Pathog 2006 ；2 (7) :e65)中。最近在分子水平上對百日咳桿菌毒性的認識上的進步已經使得能夠合理地設計通過消除或改變在百日咳病理發生中涉及的基因進行減毒的策略。三種毒性因子被遺傳靶定氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTC)和皮壞死毒素(DNT)。TCT引起對受感染宿主氣管中的纖毛細胞的破壞並因此可以涉及到咳嗽症狀。TCT 是革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖的降解產物，其一般通過AmpG轉運蛋白內化到細胞溶質中以在細胞壁生物合成過程中被再利用。百日咳桿菌AmpG在肽聚糖降解產物的內化中是無效的。百日咳ampG基因可被大腸桿菌ampG基因替代。得到的菌株表達低於1 %的殘留TCT活性。任何來自革蘭氏陰性細菌(其釋放非常少量的肽聚糖碎片到培養基中)的異源ampG基因可用於本發明中。適合的異源ampG基因的例子包括但不限於來自大腸桿菌 (Escherichia coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、腸桿菌禾鬥(enterobacteriaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、莫拉克斯氏菌屬(Molaxella)、螺桿菌屬(Helicobacter)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、軍團菌屬(Legionella)的 ampG 基因。
PTX是引起百日咳桿菌感染的全身效應的主要毒性因子並由酶促激活的部分(稱為Si)和負責與靶細胞受體結合的部分構成。它也是主要的保護性抗原之一。天然PtX基因可被編碼酶促失活毒素的突變形式替換。這可通過在Sl中分別地Arg-9被Lys置換和 G1U-U9被Gly置換來實現，它們是兩個參與底物結合和催化作用的關鍵殘基。可使用等位基因交換來首先刪除Ptx操縱子，然後插入突變形式。

百日咳桿菌培養上清液中相關毒素的存在可通過免疫印記分析檢測。也可進行其他突變如美國專利6，713，072中記載的那些，以及能夠將毒素活性降低到不可檢測的水平的任何已知的或其他突變。等位基因交換還可用於移除dnt基因。儘管DNT在百日咳桿菌毒性中的作用還不確定，但它已在緊密相關的物種支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)中被確認為重要的毒素並在微量注射時顯示致死活性。在優選的實施方式中，活的減毒百日咳桿菌疫苗是BPZEl菌株。該BPZEl菌株已於2006年3月9日以編號CNCM 1_；3585保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15，FRANCE)。通常，本發明的活的減毒百日咳桿菌疫苗還可帶有異種抗原。該活的減毒百日咳桿菌疫苗可用作載體，以攜帶至少另外一種編碼目標蛋白質的異源核酸序列。通常，由至少另外一種異源核酸序列編碼的蛋白質是希望在呼吸道中表達的蛋白質。通常，目標蛋白質可以是針對希望的免疫反應的抗原(如病毒或細菌抗原)。攜帶異種抗原的活的減毒百日咳桿菌疫苗的例子例如已經被Si Ying Ho等人(Infection and Immunity, 2008, 76 (1), 111-119)公開。本發明的疫苗的製劑可利用本領域公認的方法完成。施用於受試者的本發明疫苗的量和施用的方案可根據藥物和獸醫領域的技術人員熟知的標準技術在考慮如輔劑(如果存在)、特定受試者的年齡、性別、體重、人種和身體狀況以及施用途徑的因素的情況下確定。該疫苗的施用常常是單劑的。或者，本發明的疫苗的施用利用該疫苗通過首次(初始接種)接著回憶接種至少一次進行。通常，該疫苗可通過鼻給藥或吸入方式施用。這種施用方式成本低而且能夠使本發明的活的減毒百日咳桿菌疫苗在呼吸道定殖。鼻給藥可以利用液體溶液、懸浮液、乳液形式的活的減毒百日咳桿菌疫苗完成。溶液和懸浮液以液滴施用。溶液也可以作為來自鼻噴霧瓶或來自鼻吸入器的細霧施用。凝膠體分配在含有一次施用所需劑量的小注射器中。吸入可以通過溶液、懸浮液和粉末形式的活的減毒百日咳桿菌疫苗完成；這些製劑通過氣溶膠、小滴或乾粉吸入器施用。粉末可通過吹藥器或吹氣器施用。以下，通過如下實施例和


本發明。

圖1.減毒的百日咳桿菌BPZEl降低由致敏的過敏原引起的氣道病理的嚴重性。第 38天時來自㈧非致敏的，(B)OVA致敏的，(C)OVA致敏的和百日咳桿菌感染的，(D) OVA致敏的和用BPZEl免疫的肺細支氣管橫切片的典型形態變化。氣道炎症利用固定的肺切片的蘇木精和曙紅(H&E)染色來檢測。原始放大倍率為A、C、E和GX 100，B、F和HX400。
圖2.減毒的百日咳桿菌疫苗BP^l降低針對致敏過敏原的粘液增生(mucus hyperplasia)的嚴重性。第37天時來自(A)非致敏的，(B)OVA致敏的，(C) OVA致敏的和百曰咳桿菌感染的，(D)OVA致敏的和用BPZEl免疫的細支氣管橫切片中的典型形態變化。 氣道炎症利用肺切片上的Discombes/阿爾新藍(Alcian blue)/PAS複合染色來檢測。原始放大倍率為X 400。圖3.減毒的百日咳桿菌疫苗BPZEl減少BAL液的細胞浸潤。在最終OVA暴露M 小時後，毒性BPSM感染、減毒BPZEl激發和/或OVA致敏對BAL組成的效應。陰性對照是用鹽水進行的假感染/致敏。檢驗BAL液的總細胞數(A)，或嗜中性粒細胞(B)、嗜曙紅細胞(C)或淋巴細胞(D)的存在。結果表示為細胞數的平均士S. Ε. M.。乍< 0. 05。圖4.減毒的百日咳桿菌疫苗BPZEl減少過敏原誘導的IgE。血清中的OVA特異性IgE應答於OVA致敏和/或毒性(BPSM)或減毒的(BPZEl)百日咳桿菌激發而誘生。在第38天收集血清並通過ELISA測定OVA特異性血清IgE水平。低於100pg/ml的濃度被認為是陰性的。結果表示為平均抗體濃度士S. E.M。P <0.05。圖5.脾細胞對OVA的細胞介導免疫應答通過先暴露於減毒(BPZEl)或毒性 (BPSM)百日咳桿菌感染10天後的OVA致敏誘發。負號表示用PBS的假致敏或激發。對於 (A)IL-5、(B)IL-IO、(C) IL-13和(D)IFN-Y顯示來自所分析的類似培養物的細胞因子應答。在減去典型地2000-4000cPm的背景後，T細胞增殖(E)表示針對200 μ g/ml的OVA的脾增殖的Acpm。結果表示為平均值士S. Ε. Μ。表1.百日咳桿菌/過敏原致敏的病理特徵的總結在非致敏的(對照)、OVA致敏的(OVA)、BPZEl免疫的致敏小鼠(ZeOVA)或BPSM 感染的致敏小鼠(SmOVA)中的氣道炎症的特徵。
權利要求
1.一種活的減毒百日咳桿菌疫苗，其用於預防法或治療過敏原引起的氣道疾病，所述減活百日咳疫苗是氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮壞死毒素(DNT)缺陷的。
2.如權利要求1所述的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其中，所述過敏原引起的氣道疾病選自過敏性哮喘、枯草熱和間質性肺疾病。
3.如權利要求1或2所述的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其中，受試者是嬰兒或幼兒。
4.如權利要求1-3任一所述的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其中，所述活的減毒百日咳桿菌疫苗是BPZEl菌株。
5.如權利要求1-4任一所述的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其中，所述活的減毒百日咳桿菌疫苗帶有異種抗原。
6.如權利要求1-5任一所述的活的減毒百日咳桿菌疫苗，其中，所述活的減毒百日咳桿菌疫苗通過經鼻給藥或通過吸入施用。
全文摘要
本發明涉及一種氣管細胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮壞死毒素(DNT)缺陷的減活百日咳桿菌疫苗，其用於預防法或治療過敏原引起的氣道疾病。
文檔編號A61K39/10GK102448490SQ201080019636
公開日2012年5月9日 申請日期2010年4月26日 優先權日2009年4月28日
發明者伯納德·馬洪, 卡米爾·洛赫特, 希瑟·卡瓦納 申請人:國家健康與醫學研究院, 愛爾蘭國立梅努斯大學, 裡爾巴斯德研究所