一種魚紅細胞氧化應激模型的建立方法

2023-05-27 19:05:56

專利名稱：一種魚紅細胞氧化應激模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種魚紅細胞氧化應激模型的建立方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
自由基(單態氧、超氧陰離子、羥自由基)所造成的氧化損傷是魚體健康水平下降和多種疾病的誘因。同時自由基能直接對肌肉組織的生物大分子如核酸，蛋白質、脂類造成損傷，降低魚產品品質。因此，研究魚類氧化損傷和抗氧化機制，提高魚體抗氧化能力，對魚類健康養殖，保證魚產品品質非常重要。紅細胞具有維持內環境穩定、運輸、調節、防禦等重要功能。但紅細胞所處的環境經常與自由基接觸。紅細胞富含不飽和脂類及鐵，其中鐵離子是自由基反應的催化劑。因此，紅細胞極易受到自由基損傷。一方面損傷膜上的酶和受體，另ー方面破壞膜結構，造成功能酶的有序排列紊亂。紅細胞氧化損傷會導致其形態上出現棘形、球形等變化，並最終發生細胞破裂、溶血。紅細胞的抗氧化系統可以有效保護紅細胞免受自由基損傷，保證紅細胞的結構和功能正常。由於紅細胞的這ー些特性以及紅細胞易於獲取和製備，使之成為研究氧化損傷的最佳模型。現有技術中，目前還未見關於魚類紅細胞氧化應激模型建立方法的研究報導。因此根據魚類紅細胞的生理生化特點，摸索建立魚類紅細胞氧化應激模型，對於研究魚類的抗氧化機制，篩選有效的生物抗氧化物質，提高魚類的抗氧化能力非常必要。但直接使用現有的陸生動物紅細胞氧化應激模型的技術和方法來建立魚類紅細胞氧化應激模型，面臨下列難題(1)離心是從血液中分離紅細胞的主要方法，但現有方法主要用於的陸生恆溫動物，如鼠、豬等，對於魚類等水生變溫動物並不完全適用。首先，魚類紅細胞結構與陸生動物相比存在明顯差異，魚類紅細胞與白細胞一祥都具有細胞核，細胞較大，而陸生動物紅細胞沒有細胞核，較白細胞小。因此，現有的離心參數不適用於魚類紅細胞的分離。需要篩選適用於魚類紅細胞分離的離心參數。其次，魚類的血液PH和滲透壓與陸生動物相比，存在差異。因此，分離魚類紅細胞所用生理鹽水的PH和滲透壓須調整。(2)現有技術經常用建立細胞氧化應激模型。H2O2除了自身具有氧化作用外， 也可導致· OH大量形成，加劇蛋白質及脂質的氧化損傷，模擬氧化環境。但H2O2在細胞培養液中代謝較快，濃度不穩定，造模效果的可控性較差。利用I^eSO4和1 反應模擬體內產生較穩定的· OH濃度，可提高氧化模型的可控性。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種簡便有效的魚類紅細胞氧化應激模型建立方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種魚紅細胞氧化應激模型建立方法，依次包括以下步驟
Al、按常規方法將體重相近的3尾鯉魚尾部消毒，用注射器從每尾魚尾部抽取約1 毫升血液。A2、將血液放入6毫升含肝素鈉(40IU/ml)的鯉魚生理鹽水中，血樣在900g，4°C下離心10分鐘，棄去上清液。A3、紅細胞沉澱懸浮在6毫升鯉魚生理鹽水中，然後在900g，4°C下離心10分鐘。A4、用鯉魚生理鹽水重新懸浮紅細胞沉澱，按步驟A3洗滌2次後，細胞沉澱懸浮在 6毫升鯉魚生理鹽水中，4°C保存備用。A5、取適量的紅細胞懸液，加入等體積的1 2+/ 混合溶液，其終濃度為 40yM/20yM，37°C孵育 8-10 小時。Α6、樣品在1000g，4°C條件下離心3分鐘，細胞樣用流式細胞儀和瓊脂糖凝膠電泳測定凋亡情況。優選的，所述的方法，所述步驟A2和A4中，所述鯉魚生理鹽水(mmolじ1)組成如下=NaCl, 141. 1 ；KCl, 1. 43 ；CaCl2,0. 99 ；NaHCO3, 2. 64 ；glucose, 6. 16 ；滲透壓為 280mos mol じ1，pH 為 7. 9。優選的，所述的方法，所述步驟A5，氧化應激的最適孵育時間為9小吋。與現有技術相比，本發明的魚紅細胞氧化應激凋亡模型建立方法具有以下明顯的優點1、本發明首次使用1 2+/ 混合溶液為自由基· OH的來源，建立紅細胞氧化應激模型。2、本發明根據魚類紅細胞特點確定了離心分離的關鍵參數。3、Fe2VH2O2混合溶液的最佳使用濃度和適宜孵育時間。4、本發明所述的培養條件和方法，能夠幫助初次進行紅細胞分離和氧化應激的研究人員，比較順利的完成魚類紅細胞分離和氧化應激模型的建立。


圖1不同劑量1 2+/ 使培養液產生· OH的濃度。1 2+/ 混合液可以穩定產生· OH0圖2不同濃度1 2+/ 誘導的鯉魚紅細胞凋亡。Fe2VH2O2濃度為40 μ Μ/20 μ M時， 紅細胞的凋亡率達到最大。圖3不同時間40 μ Μ/20 μ M Fe2VH2O2溶液誘導鯉魚紅細胞凋亡的DNA碎片裂分折。結果表明孵育時間為9小時時，紅細胞的凋亡率達到最大。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。以下實施例中所用鯉魚生理鹽水具體配方為(molじ1) =NaCl, 141. 1 ；KCl, 1. 43 ； CaCl2,0. 99 ；NaHCO3, 2. 64 ；glucose, 6. 16。滲透壓為 280mos mol じ1，pH 為 7. 9。試劑雙氧水H2O2(30% ),硫酸亞鐵FeSO4(分析純)。實施例1 一種魚紅細胞氧化應激模型的建立方法，依次進行以下步驟1、將體重150克左右鯉魚3尾，按常規方法將尾部消毒，用注射器從每尾魚尾部抽取約1毫升血液。2、將血液放入6毫升含40IU/ml肝素鈉的鯉魚生理鹽水中，血樣在900g，4°C下離心10分鐘，棄去上清液。3、紅細胞沉澱懸浮在6毫升鯉魚生理鹽水中，然後在900g，4°C下離心10分鐘。4、用鯉魚生理鹽水重新懸浮紅細胞沉澱，按步驟3洗滌2次後，細胞沉澱懸浮在6 毫升鯉魚生理鹽水中，4°C保存備用。5、取適量的紅細胞懸液，加入等體積的1 2+/ 混合溶液，其終濃度分別為0/0、 10 μ Μ/5 μ Μ、20 μ Μ/10 μ Μ、30 μ Μ/15 μ Μ、40 μ Μ/20 μ M禾ロ 50 μ Μ/25 μ Μ, 370CIP W 8 小時。樣品在1000g，4°C條件下離心3分鐘，細胞樣用流式儀測定凋亡情況。不同1 2+/ 濃度所引起紅細胞凋亡的結果如表1、圖1和圖2所示。表1不同濃度1 2+/ 混合溶液，產生· OH的濃度，誘導紅細胞凋亡的比例(％ )
權利要求
1.一種魚紅細胞氧化應激模型建立的方法，其特徵在幹，依次包括以下步驟Al、按常規方法將體重相近的3尾鯉魚尾部消毒，用注射器從每尾魚尾部抽取約1毫升血液；A2、將血液放入6毫升含肝素鈉40IU/ml的鯉魚生理鹽水中，血樣在900g，4°C下離心 10分鐘，棄去上清液；A3、紅細胞沉澱懸浮在6毫升鯉魚生理鹽水中，然後在900g，4°C下離心10分鐘； A4、用鯉魚生理鹽水重新懸浮紅細胞沉澱，按步驟A3洗滌2次後，細胞沉澱懸浮在6毫升鯉魚生理鹽水中，4°C保存備用；A5、取適量的紅細胞懸液，加入等體積的1 2+/ 混合溶液，其終濃度為40 μ Μ/20 μ Μ, 37°C孵育8-10小時；A6、樣品在1000g，4°C條件下離心3分鐘，細胞樣用流式細胞儀和瓊脂糖凝膠電泳測定凋亡情況。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在幹，所述步驟A2和A4中，所述鯉魚生理鹽水(PCS, mmol じ1)組成如下=NaCl, 141. 1 ；KCl, 1. 43 ；CaCl2,0. 99 ；NaHCO3, 2. 64 ；glucose, 6. 16 ；滲透壓為 280mos mol じ1，pH 為 7. 9。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在幹，所述步驟A5，氧化應激的最適孵育時間為 9小時。
全文摘要
本發明公開了一種魚紅細胞氧化應激模型建立方法，將鯉魚尾部消毒，從每尾魚尾部抽取約1毫升血液。將血液放入6毫升含肝素鈉的鯉魚生理鹽水中，血樣在900g，4℃下離心10分鐘，棄去上清液。紅細胞沉澱懸浮在6毫升鯉魚生理鹽水中，然後在900g，4℃下離心10分鐘。用鯉魚生理鹽水重新懸浮紅細胞沉澱，洗滌2次後，細胞沉澱懸浮在6毫升鯉魚生理鹽水中，4℃保存備用。取適量的紅細胞懸液，加入等體積的Fe2+/H2O2混合溶液，其終濃度為40μM/20μM，37℃孵育8-10小時。樣品在1000g，4℃條件下離心3分鐘，細胞樣用流式細胞儀和瓊脂糖凝膠電泳測定凋亡情況。本發明首次使用Fe2+/H2O2混合溶液為自由基·OH的來源，建立紅細胞氧化應激模型。
文檔編號C12N5/078GK102559592SQ20111043922
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者馮琳, 劉揚, 周小秋, 姜俊, 姜維丹, 李華濤 申請人:四川農業大學