基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑的製作方法

2023-05-27 21:36:26

專利名稱：基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及果實採後病害防治技術領域，更具體的是涉及一種用於防治柑橘果實病害的生物防腐保鮮技術。
背景技術：
柑橘是產量最大的水果之一，栽培歷史悠久。但柑橘產區一般均地處亞熱帶地區， 溫溼度均較適合果實病原菌的生長，每年由於病理性腐爛導致的採後損失巨大。目前，化學殺菌劑是控制果實採後腐爛的主要和最有效方法。但是，隨著國家經濟發展和消費水平的提高，人們對食品安全和環境保護意識的增強，化學類殺菌劑的使用範圍越來越受限制。 此外由於長期使用殺菌劑，病原菌能進化產生了大量抗藥性菌種。因此從可持續發展的角度出發，開發新型、高效且安全的有機、綠色的保鮮劑具有重大的社會意義和廣闊的應用前
旦
ο近年來利用安全且有拮抗病原菌活性的酵母防治果實病害的研究受到了國內外廣泛的重視，被認為是最有希望的替代化學殺菌劑的方法之一。但現有生防酵母的對病害的控制效力與化學殺菌劑相比仍有較大差距，例如即使是美國的已經商業化生產的產品(Aspire，基於酵母Candida oleophila的商業化產品)也只有在與低劑量殺菌劑 (thiabendazole, TBZ)聯合使用時才能達到對柑橘或葡萄等果實主要病害的完全控制。酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum Fell&Tallman 是一株從海洋中分離得到的新型果實病害生防酵母。中國發明授權專利《一株水果蔬菜的生物保鮮劑及其製備方法》，專利號200610155209. 0，公開了一種基於紅冬孢酵母和尼泊金乙酯鈉或尼泊金丁酯鈉製備水果蔬菜的生物殺菌劑的方法。中國發明授權專利《用於果蔬採後病害生物防治的海洋酵母及其製備方法和用途》，專利號ZL 200610155062. 5，公開了一種用海洋酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum i^ell&Tallman抑制鏈格孢、灰葡萄孢、擴展青黴、指狀青黴、多毛孢等多種果蔬採後主要真菌病害的生物防治方法。中國發明授權專利《一種海洋酵母的用途和相應微生物燃料電池及製備方法》。授權公告號CN101552340B，公開了一種利用紅冬孢酵母製備微生物燃料電池的方法。中國發明申請專利《一種防治果蔬病害的生物保鮮劑及其製備方法》，申請號200910095643. 8，公開了一種基於紅冬孢酵母和羧甲基纖維素鈉等物質防治果蔬病害的生物保鮮方法。中國發明申請專利《海洋酵母Miodosporidum paludigenum Fell&Tallman的專用甘蔗糖蜜培養基》，申請號2010101485270，公開了一種海洋酵母I^hodosporidum paludigenum i^ell&Tallman液體培養的方法。中國發明申請專利《海洋酵母I^hodosporidum paludigenum Fell&Tallman的真空冷凍乾燥制》，申請號 2010101400817，公開了一種紅冬孢酵母活性乾粉製備的方法。中國發明申請專利《一種誘導提高海洋紅冬孢酵母對果實病害防治效力的方法》，申請號2010105517M. 8，公開了一種利用幾丁質物質誘導提高紅冬孢酵母生防效力的方法。在現有的公開文獻中，均認為在酵母懸浮液中必須同時配合使用氯化鈣和殼聚糖，才能發揮最佳的防腐保鮮效果，即，氯化鈣和殼聚糖必須配合使用才能發揮協同效果；例如在申請號為201010152108. 4的發明《桃果實病害生物防腐保鮮劑及用途和所用羅倫隱球酵母》中和申請號為201010202937. 9的《防治果實青黴病的生物防腐保鮮劑》中均有類似告知。而且眾所周知，殼聚糖的價格遠遠高於氯化鈣(約為氯化鈣的60倍)，在生物防腐保鮮中使用殼聚糖，勢必會增加生物防腐保鮮劑的成本。因此尋求一種能針對柑橘具有優良的防腐保鮮效果、又低價的生物防腐保鮮劑，成了本行業迫切希望解決的問題。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種在不使用化學殺菌劑前提下能有效控制柑橘果實採後病害的生物防腐保鮮劑。為了解決上述技術問題，本發明提供一種基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，該保鮮劑由紅冬孢酵母懸浮液、氯化鈣和水組成，每IL保鮮劑中含有 IXlO10 IX IO12個紅冬孢酵母細胞和19. 5 20. 5g的氯化鈣，其餘為水；紅冬孢酵母是保藏號為 IMI394084 的海洋酵母 Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman。作為本發明的基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑的改進每IL 保鮮劑中含有ι χ 101°個紅冬孢酵母細胞和19. 5 20. 5g的氯化鈣。作為本發明的基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑的進一步改進 每IL保鮮劑中含有IXIOki個紅冬孢酵母細胞和20g的氯化鈣。本發明所選用的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman)被保藏於英國國際真菌研究所國際農業與生物中心基因資源保藏中心(International Mycological Institute, CABI Genetic Resource Collection)，保藏地址英國 TW20 9TY 薩裡郡艾格鎮貝克漢姆路國際農業與生物中心英國中心，保藏日期2006. 4. 19，保藏編號 IMI 394084。該菌株已經在申請號為200610155209. O的專利中被公開。本發明的生物防腐保鮮劑，是將果實用紅冬孢酵母(miodosporidiumpaludigenum i^ell&Tallman，英國國際真菌研究所國際農業與生物中心基因資源保藏中心保藏編號 IMI394084〕懸浮液和病害控制增效劑(氯化鈣)複合進行處理而得；其可以進行常溫或低溫貯藏。本發明的生物防腐保鮮劑只有在確保酵母活性的基礎上才能發揮最佳的防腐效應，因此所用的紅冬孢酵母懸浮液是指經過菌種活化、並配製成的具有抑菌效果且濃度適宜的酵母菌懸液，其有效濃度為IXIO7細胞/毫升 IX IO9細胞/毫升。紅冬孢酵母和病害控制增效劑的複合處理是指將病害控制增效成分直接添加到酵母菌菌懸液中而製成的生物防腐保鮮劑。病害控制增效劑是指氯化鈣，其有效濃度為每 IL保鮮劑中含有19. 5 20. 5g的氯化鈣。本發明所設定的病害控制增效劑的有效濃度是指其使用量確保不抑制拮抗酵母的生長和繁殖，並能發揮氯化鈣特定生理功能的濃度。本發明的生物防腐保鮮劑有效整合了生防酵母、氯化鈣的活性，從而能顯著抑制柑橘果實病害的發生和發展；由於能根據具體情況大幅度降低拮抗酵母的使用量，從而顯著降低成本。本發明的生物防腐保鮮劑具有安全高效、環境友好、病害防治效果突出等優點。使用本發明的生物防腐保鮮劑，能轉變長期以來依賴化學殺菌劑為主的果實真菌病害控制方法，對確保食品安全、環境保護和農業增效、農民增收和經濟社會可持續的發展等具有重要
眉、ο實際使用時，可任選以下任意一種處理方式對果實進行處理處理方式一選擇無機械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質基本一致的果實，用自來水衝洗、並在室溫(25°C左右)下放幹。將果實在本發明的生物防腐保鮮劑中浸泡3分鐘後，取出放幹，然後放入保鮮薄膜袋中在室溫(25°C左右)下保持20 24小時，接著將果實從薄膜袋中取出，裝箱貯藏。處理方式二 採前採用噴壺噴灑的處理方法，將本發明的生物防腐保鮮劑溶液噴在果實表面(溼潤即可)，待幹後取下果實放入保鮮薄膜袋中在室溫(25°C左右)下保持 20 M小時，再將果實從薄膜袋中取出，裝箱貯藏。
具體實施例方式以下實施例中的果實為正常商業成熟度的柑橘(Citrus unshiu Marc.)果實， 試驗品種為早桔。選擇無機械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質基本一致的果實， 用0.1% (質量濃度)的次氯酸鈉溶液浸泡消毒1-2分鐘後，用自來水衝洗，在室溫下 (20-25°C )放幹後備用。拮抗酵母為紅冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell&TalIman)；病原菌為指狀青黴(Penecillium digitatum)。氯化鈣為分析純無水氯化鈣。紅冬孢酵母懸浮液的製備方法如下以下所用的NYDA培養基為牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，瓊脂20克，水定容至1000ml，高壓(1 kg/cm2) 121°C滅菌30分鐘。NYDB種子培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，高壓 (1 kg/cm2) 121°C 滅菌 30 分鐘。紅冬孢酵母IMI 394084在低溫)下保存在NYDA培養基中。培養程序依次為①、活化紅冬孢酵母IMI 394084先在NYDA培養基中培養48小時，然後重複傳代培養2次(每次均為在NYDA培養基中培養48小時)；將上述重複傳代培養2次所得的活化好的酵母用接種環接到NYDB種子培養基中， 下培養M小時；然後在相同條件下重複培養1次(即將NYDB種子培養基中培養而得
的酵母再次用接種環接到NYDB種子培養基中，28°C下培養M小時)；②、液體培養用步驟①活化所得的酵母按照5% (重量比)的接種量接到NYDB種子培養基中，在200rpmJ8°C條件下培養M小時；③、離心分離將步驟②液體培養後的所得物在3000rpm條件下，離心10分鐘，並用滅菌蒸餾水洗2次，以去除培養介質；④、懸浮和確定濃度用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細胞，用血球記數板的方法確定酵母的濃度，並用無菌蒸餾水調整到試驗所需要的濃度。實施例1、生物防腐保鮮劑在濃度為5X IO7個細胞/ml、體積為2升的紅冬孢酵母IMI 394084懸浮液中緩慢加入濃度為10% (w/v)的氯化鈣溶液2升，氯化鈣溶液加入完畢後繼續攪拌混勻5分鐘， 加水稀釋到10升備用。該最終所得的每L生物防腐保鮮劑中含有IX 101°個紅冬孢酵母 IMI394084細胞、20g氯化鈣，其餘為水。實施例2、生物防腐保鮮劑將實施例1中的氯化鈣溶液的用量改成1. 95升，其餘同實施例1。該最終所得的每L生物防腐保鮮劑中含有1 X 101°個紅冬孢酵母IMI 394084細胞、19. 5g氯化鈣，其餘為水。實施例3、生物防腐保鮮劑將實施例1中的氯化鈣溶液的用量改成2. 05升，其餘同實施例1。該最終所得的每L生物防腐保鮮劑中含有1 X 101°個紅冬孢酵母IMI 394084細胞、20. 5g氯化鈣，其餘為水。為了獲得本發明的生物防腐保鮮劑及確定其保鮮效果，發明人進行了如下實驗實驗、柑橘生物防腐保鮮劑的效果實驗用消過毒的打孔器在每個果實表面形成統一大小和的深度的傷口。將紅冬孢酵母 IMI394084細胞懸浮在含有各種不同成分及含量的病害控制物中，從而獲得不同的組合試劑；各取50μ 1不同的組合試劑分別添加到不同的果實傷口處。病原菌接種在以上處理2 小時後，即在每個傷口加入等量(30μ 1)的病原菌孢子懸浮液(Penecillium digitatum濃度為104spores/ml)。處理完畢後在常溫QO 25°C )下貯藏，並用PE塑料膜密封作保溼處理。每個處理每重複12個果實，每處理重複3次。具體處理安排如下處理1:水，即對照。處理2 處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107cellS/ml，氯化鈣2% (w/v,即每ml中含有0. 02g的氯化鈣)。即本發明的實施例1。處理3、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107Cells/ml，氯化鈣1.95% (w/v) 0即本發明的實施例2。處理4、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107(^118/1111，氯化鈣2.05% (w/v) 0即本發明的實施例3。處理5、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107cells/ml，氯化鈣 2. 2% (w/v)。處理6、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107cells/ml，氯化鈣 1. 8% (w/v)。處理7、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107cells/ml，氯化鈣 2% (w/v)和殼聚糖 0.05% (w/v)。處理8、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107cells/ml，氯化鈣 2% (w/v)和殼聚糖 0.1% (w/v)。處理9、處理液所含成分濃度分別為紅冬孢酵母IMI 394084細胞懸浮液濃度為 107cells/ml，氯化鈣 2% (w/v)和殼聚糖 0.5% (w/v)。處理10 對照，處理液所含成分濃度分別為108ells/ml中濃度酵母單獨使用。表1、試驗結果
權利要求
1.基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，其特徵是所述保鮮劑由紅冬孢酵母懸浮液、氯化鈣和水組成，每IL保鮮劑中含有IXlOici IXlO12個紅冬孢酵母細胞和19. 5 20. 5g的氯化鈣，其餘為水；所述紅冬孢酵母是保藏號為IMI 394084的海洋酵母 Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman。
2.根據權利要求1所述的基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，其特徵是所述每IL保鮮劑中含有1 X 101°個紅冬孢酵母細胞和19. 5 20. 5g的氯化鈣。
3.根據權利要求1所述的基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，其特徵是所述每IL保鮮劑中含有IXIOki個紅冬孢酵母細胞和20g的氯化鈣。
全文摘要
本發明公開了一種基於海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，該保鮮劑由紅冬孢酵母懸浮液、氯化鈣和水組成，每1L保鮮劑中含有1×1010~1×1012個紅冬孢酵母細胞和19.5~20.5g的氯化鈣，其餘為水；紅冬孢酵母是保藏號為IMI394084的海洋酵母RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman。該生物防腐保鮮劑能在不使用化學殺菌劑的前提下有效控制柑橘果實採後病害狀況。
文檔編號A23B7/157GK102228078SQ20111011121
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月2日 優先權日2011年5月2日
發明者餘挺, 努爾哈音, 盧黃娉, 朱瑞瑜, 路來風, 鄭曉冬, 郭峻 申請人:浙江大學