對多種病害顯示抗性的植物及其製造方法

2023-05-28 14:24:46 1

專利名稱：對多種病害顯示抗性的植物及其製造方法
技術領域：
本發明涉及通過將2種以上針對病原菌的抗性基因組合導入植物中來將針對2種以上病原菌的抗性賦予植物的方法，以及通過該方法製造的轉化植物體、其部分或繁殖材料。
背景技術：
據說全世界由病害造成的農業生產災害為10 20%，這等於8億人的糧食。由於全世界的飢餓人口估計為8億人，因而防止病害可以說是在糧食的穩定供給中最為重要的課題。引起植物發生疾病的原因有傳染性的生物病原(病原體)和非傳染性的環境病原。 植物的感染病中80%以上是由絲狀真菌(黴菌類)引起的，其餘是由細菌、病毒、類病毒、植原體、立克次氏體樣微生物、線蟲、原蟲等引起的。植物通常受到這些病原體攻擊，通過特有的生物體防禦反應來保護自身免受病原體感染。例如，十字花科蔬菜類炭疽病的病原是屬於刺盤孢屬(Colletotrichum)的絲狀真菌(希金斯刺盤孢(Colletotrichum higginsianum))，感染小松菜、白菜、蘿蔔等十字花科作物，是造成災害的疾病，但近年來，發現了多種對該病原菌顯示抗性的擬南芥生態型 (ecotype)(非專利文獻1)。而且，本發明者們發現，在抗性生態型Ws_0中，存在於第5號染色體上的特定區域的基因具有賦予擬南芥以針對十字花科蔬菜類炭疽病菌的抗性的功能。另外，對於主要感染茄科植物的具有無毒基因MiEnM的番茄細菌性葉斑病菌 (病原細菌丁香假單胞菌番茄致病變種O3SeudomonaS syringa印v. tomato))，擬南芥中也發現了抗性基因(非專利文獻2)。而且，對於作為感染以茄科和十字花科植物為代表的200種以上的植物、帶來使其枯死的農業上的重大災害的病害的青枯病(青枯雷爾氏菌 (Ralstoniasolanacearum))，擬南芥中也發現了抗性基因(非專利文獻3 5)。根據Flor所倡導的基因對基因學說(非專利文獻6)，認為這種植物的生物體防禦反應是由於植物方面的抗性基因產物識別來源於菌的激發物(elicitor)(無毒基因產物)，從而表現針對病原菌的一系列抵抗反應。而且，在該學說中，1種抗性基因針對1種病原菌1對1地發揮作用。然而，地球上存在十萬種的絲狀真菌，但其中大多數不感染植物，僅有約8000種是植物病原菌，其中，會對1種植物引發病害的不到10種。即，植物對大部分病原體顯示抗性。儘管如此，擬南芥的基因組上僅存在約150種(非專利文獻7)抗性基因，稻基因組上僅存在約600種(非專利文獻8)抗性基因。因此，現狀是植物針對多樣的病原體的抗性的機制僅用基因對基因學說不能說明，其詳細尚未闡明。1 :Y. Narusaka ^X, Molecular Plant-Microbe Interactions, 17 749-762(2004)非專利文獻2 :ff. Gassmann 等人，Plant J. 20 :265-277 (1999)__ 專禾Ij 文獻 3 Deslandes 等人，Molecular Plant-Microbe Interactions, 11(7) :659-667(1998)
非專禾Ij文獻 4 :L. Deslandes 等人，Proc Natl Acad Sci USA. , 99 (4) 2404-2409(2002)非專利文獻5 :L. Deslandes 等人，Proc Natl Acad Sci USA. , 24 8024-8029(2003)非專利文獻6 :H. Flor.，Annu. Rev. Phytopathol. 9 :275-296(1971)非專利文獻7 =Meyers, B. C.等人，Plant Cell, 15 :809-834(2003)非專利文獻8 =Goff, S. Α.等人，Science, 296 :92-100 (2002)非專利文獻9 土屋等，植物防疫M =87-92(2000)非專利文獻10 :Clark 等人，Science, 317 :338-342(2007)非專利文獻11 =Fedoroff NV.和 Smith D.，Plant J. 3 :273-289(1993)非專利文獻12 =Noutoshi 等人，Plant J. ,43 :873-888(2005)

發明內容
發明要解決的課題本發明是鑑於這樣的狀況而做出的，其目的是闡明植物針對多樣的病原體的抗性的機制，並利用該機制製造針對多樣的病原體顯示抗性的植物。用於解決課題的方法本發明者們在世界上首次搞清楚了十字花科蔬菜類炭疽病菌(希金斯刺盤孢 (Colletotrichum higginsianum))感染擬南芥的生態型Col-Ο，從而建立了植物免疫研究中的模型實驗系統(非專利文獻1)。對於100種以上的擬南芥的生態型進行了感染生理學和遺傳學分析，結果獲得了對該病原菌顯示抗性的11種生態型。而且，弄清楚了其中顯示特別強的抗性的Eil-O的抗性是優勢且單基因支配的，該基因存在於擬南芥的5條染色體中的第4號染色體上(非專利文獻1)。該基因(座)很可能是抗性基因(E-基因，植物方面識別病原體的受體)，將其命名為RCHl (用於希金斯刺盤孢的識別(Eecognition of C. higginsianum))。因為暗示了在其他抗性生態型中，在與Eil-O不同的基因座上存在抗性基因，所以本發明者們對該基因進行了分析，弄清楚了生態型Ws-O中的抗性基因存在於第5號染色體上。生態型Ws-O中的抗性基因的詳細圖譜的結果是，目標基因位於十幾個抗性基因形成了簇(cluster)的區域(MRC-J-區域)。接著，本發明者們通過使用在生態型Ws-O中插入了 T-DNA的突變體文庫(3萬個體)的反求遺傳學分析，篩選出了發生了針對炭疽病菌由抗性向敏感性的表型變化的突變體。對於得到的8個突變體進行了 T-DNA插入部位和突變部位分析，弄清楚了敏感性突變體在Ws-At5g45250(由Gassmann命名為EEM)或Ws_At5g45260 基因(由本發明者們侖名為RCH2)中發生了突變。對於RPS4和RCH2與針對病原菌的抗性的關係，到目前為止有幾個報告例。例如， Gassmann等已經將擬南芥生態型Col-O和Ler-O的EEM鑑定為針對番茄細菌性葉斑病菌 (病原細菌丁香假單胞菌番茄致病變種)的抗性基因(非專利文獻幻。另一方面，Gassmarm 等認定存在於RPS4附近的RCH2(在文獻中稱為RSH4)與番茄細菌性葉斑病菌無關(非專利文獻2)。另外，與feissmarm等不同的另一研究小組將擬南芥生態型Nd-I和Ct-I的RCH2(在t獻中稱為RRS1-R)鑑定為針對感染茄科和十字花科植物的青枯病菌(作為土壤病原細菌的青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum))的抗性基因(非專利文獻3 5)。 另一方面，該研究小組認定EEM與針對青枯病菌的抗性無關(非專利文獻4)。這樣，對於RPS4和RCH2,—盲以來被鑑定為與炭疽病菌不同的病原體的抗件基因，但本發明者們弄清楚了其作為針對炭疽病菌的抗性基因發揮功能。而且，本發明者們分析了各種生態型中抗性、敏感性與兩基因的關係，結果弄清楚了，為了誘導針對炭疽病菌、番茄細菌性葉斑病菌、青枯病菌的抗性，EEM和￡￡H2兩者都是必須的。該結果顛覆了 EEM和_分別與青枯病菌和番茄細菌性葉斑病菌無關的一直以來的報告，並且改變了一直以來關於植物對病原體的抵抗反應的機制的看法。S卩，根據Flor所主張的基因對基因學說，認為植物對病原體的抵抗反應是由植物的抗性基因和對應的病原體的無毒基因(Διχ-基因)的ι對ι的組合所決定的(非專利文獻6)，但本發明者們在世界上首次發現了，擬南芥的基因組上相鄰的2種不同的抗性基因識別3種不同的病原體的攻擊而引發抵抗反應。根據本發明，弄清楚了植物的免疫系統也與動物同樣地，通過少數基因的組合來識別多樣的病原體，從而啟動防禦體系。S卩，本發明是基於植物對病原體的抵抗反應中的新機制的發現而做出的，更詳細地說，本發明如下。賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性的方法，其特徵在於，將2種以上基因的組合導入植物中，所述基因單獨不賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性，但通過上述組合來賦予植物以針對這些病原菌的抗性。根據所述的方法，其中，病原菌是十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌，基因的組合是EEM基因和m基因的組合。根據所述的方法，其中，EEM基因和_基因來源於選自Ws-o、No-O, Nd-UAa-O>Ei1-0>Rrs_7、Sha>Tamm-2>Tsu_l、Fei_0、Ts_l、Bsch_0、Br_0、Est_l、Rrs_10、 Van-O、Nfa_8、Bay-O中的擬南芥生態型。根據或所述的方法，其中，病原菌還包含青枯病菌。被賦予了針對2種以上病原菌的抗性的轉化植物體，該轉化植物體如下獲得 將2種以上基因的組合導入植物中，所述基因單獨不賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性，但通過上述組合來賦予植物以針對這些病原菌的抗性。根據所述的轉化植物體，其中，病原菌是十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌，基因的組合是EEM基因和m基因的組合。根據所述的轉化植物體，其中，EEM基因和_基因來源於選自Ws-o、 No-O> Nd-U Aa-O> Eil_0、Rrs_7、Sha> Tamm-2> Tsu-U Fei_0、Ts-U Bsch_0、Br-O> Est-U Rrs-10、Van-O、Nfa_8、Bay-O 中的擬南芥生態型。根據或所述的轉化植物體，其還具有針對青枯病菌的抗性。轉化植物體，其是 的任一項所述的轉化植物體的後代或克隆。 的任一項所述的轉化植物體的部分或繁殖材料。發明的效果根據本發明，可以通過將多種不同抗性基因的組合導入植物中，從而使植物識別多種不同病原體的攻擊，引發抵抗反應。如果利用本發明者們發現的植物中的抗病性的機制，則可以製成對廣泛的病害顯示抗性的植物。例如，可以通過將抗病件基因RPS4和RCH2 同時導入植物，從而賦予植物以針對十字花科蔬菜類炭疽病菌、細菌性葉斑病菌、青枯病菌的抗性。由此，可以保護作物免受由十字花科蔬菜類炭疽病菌、細菌性葉斑病菌、青枯病菌造成的病害，提高十字花科作物和/或茄科作物等的生產效率。另外，已經報告了一般如果單獨導入抗病性基因則植物矮小化的事例，但根據本發明，通過多種基因的組合，可以避免這種抗性植物製造中的植物矮小化的問題。


圖1是通過SSLP (簡單序列長度多態性(simple sequence Iengthpolymorphism))分析來顯示抗性基因存在區域的壓縮後的圖。在擬南芥生態型(Ws-O)中，抗性基因 At5g45250 和 At5g45260 相鄰存在。CIW9、N01-K9E15、ngal29、 NOl-MLNU N01-K17022.N01-K11I1 表示 SSLP 標記。圖2是顯示擬南芥生態型Ws-0、Col-0、來源於!^doroff氏的No-O的突變體的圖。圖3是顯示擬南芥生態型Ws-O與Col-O中的At5g45260的胺基酸序列的比較的圖。Col-O的At5g45260相對於Ws_0，圖中的箭頭部分的序列的83個胺基酸缺失。圖4A是顯示At5g45260中的突變與針對細菌性葉斑病的抗性的關係的分析結果的圖，顯示炭疽病菌抗性的生態型Ws-O中的At5g45260 (RCH2)被破壞的影響。圖中，Ws-0、Col-0、RLD-O 分別表示野生型。另外，「rch2_2」( Δ At5g45260_2)和 "rch2-l」 (AAt5g45260-l)表示 Ws 中的 At5g45260 的破壞體(2 例)。圖4B是顯示At5g45250中的突變與針對細菌性葉斑病的抗性的關係的分析結果的圖，顯示炭疽病菌抗性的生態型Ws-O中At5g45250 (EEM)被破壞的影響和生態型RLD中導入了 At5g45250的影響。圖中，Ws_0、Col_0、RLD-O分別表示野生型。另外，「rps4-21」(AAt5g45250-21)表示 Ws_At5g45250 的破壞體，「rps4-21_C9」 和 「rps4-21-Cll」表示在Ws-At5g45250的破壞體中再導入Ws_At5g45250而得的回覆體O 例)，「RLD/RPS4-Ws-2」 和 「RLD/RPS4-Ws_3」 表示在 RLD-0 中導入了 1Ws-AtSgASZSO 的轉化體O例)。圖5A 圖5G是顯示At5g45250和At5g45^0中的突變與針對青枯病的抗性的關係的分析結果的照片(生物的形態)。圖中，Nd-I (抗性)、Ws-0 (中度抗性)、No-0 (抗性)、 Col-O (敏感性)表示野生型。rps4-31(AAt5g45250-31)表示來源於!^edoroff氏的No-O 中At5g45250被破壞了的突變體，對青枯病菌是敏感性的。rps4-21 ( Δ At5g45250_21)表示 Ws-O中At5g45250被破壞了的突變體，對青枯病菌是敏感性的。rch2_l ( Δ At5g45^0_l) 表示Ws-O中At5g45260被破壞了的突變體，對青枯病菌是敏感性的。圖6A 圖6D是顯示在擬南芥的炭疽病菌敏感性的生態型Col-0、RLD_0中導入了抗性基因的結果的照片(生物的形態)。Ws-At5g45250/Col-0是在野生型Col-O中導入了抗性基因Ws-At5g45250的轉化體。Ws_At5g45250/RLD是在野生型RLD-O中導入了抗性基因·\ν8-Α 5β45250的轉化體。No-0_At5g45260/Col-0是在野生型Col-O中導入了抗性基因來源於!^edoroff氏的No-0_At5g45260的轉化體。圖7顯示利用本發明者們所分析的數據和擬南芥的SNP分析數據(非專利文獻10)進行At5g45250和At5g45260的胺基酸序列的系統樹分析的結果。圖8是接著圖7的圖。圖9顯示EEM(At5g45250)中各生態型之間的胺基酸序列的比較。圖中顯示了在各生態型之間不保守的胺基酸。在對十字花科蔬菜類炭疽病、細菌性葉斑病和青枯病全部為敏感性的RLD-O中，第950位的酪氨酸被置換成組氨酸。圖10顯示_(At5g45260)中各生態型之間的胺基酸序列的比較。在第1_1290 位的胺基酸區域中，以Col-O的胺基酸序列為基準，顯示了在各生態型之間不保守的胺基酸。在第U91-1379位的胺基酸區域中，顯示了在各生態型之間不保守的胺基酸。在對炭疽病菌為敏感性的生態型(Ler-1，Lov-5, C24)中，第775位的酪氨酸被置換成天冬醯胺。 從Col-O的WRKY結構域到C末端側約有80-90個胺基酸缺失(圖幻。對炭疽病菌為敏感性的生態型Cvi-0、Bur-O也與Col-At5g45260同樣地在C末端側被確認了缺失。圖11是接著圖10的圖。圖12是顯示在擬南芥中的炭疽病菌敏感性的生態型Col-O中導入抗性基因的結果的照片(生物的形態)。Ws-At5g45250/Col-0是在野生型Col-O中導入了抗性基因 Ws-At5g45250 的轉化體。Ws_At5g45250 · At5g45260/Col_0 是在 Ws-At5g45250/Col_0 中導入了抗性基因Ws-At5g45260的轉化體。圖13是顯示對圖12所示的Ws-At5g45250 ·Α 5δ45260/0ο1-0噴霧接種炭疽病菌 6天後的病徵的照片(生物的形態)。圖14是顯示在十字花科作物小松菜中的炭疽病菌敏感性品種「杉 力」中導入抗性基因的結果的照片(生物的形態)。Ws-At5g45260/小松菜是在野生型小松菜中導入了擬南芥的抗性基因Ws-At5g45260的轉化體。Ws_At5g45250 · At5g45260/小松菜是在野生型小松菜中同時導入了擬南芥的抗性基因Ws-At5g45250和Ws_At5g45260的轉化體。圖中表示對野生型小松菜和轉化小松菜噴霧接種炭疽病菌6天後的病斑。
具體實施例方式本發明是基於通過多種不同抗性基因的組合，來識別多種不同病原體的攻擊，引發抵抗反應這樣的對於植物針對病原體的抵抗反應的全新見解而做出的。因此，本發明的方法是賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性的方法，其特徵在於，將2種以上基因的組合導入植物中，所述基因單獨不賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性，但通過上述組合來賦予植物以針對這些病原菌的抗性。作為本發明中的「賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性的基因的組合」，只要是通過上述機制來引發植物針對病原體的抵抗反應的組合即可，不特別限制。例如，在病原菌是十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌的情況下，可列舉RPS4基因和RCH2 基因的組合。這裡所謂「十字花科蔬菜類炭疽病」，是指以希金斯刺盤孢(Colletotrichum higginsianum)等黴菌(絲狀真菌)為病原而引發的疾病，是在小松菜、蕪青、白菜、蘿
卜等十字花科作物中發生的疾病。另外，所謂「番茄細菌性葉斑病」，是指以丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv. tomato)等細菌為病原而引發的疾病，是主要在茄科植物和擬南芥中發生的疾病。作為通過利用RPS4基因和RCH2基因的組合來賦予植物以抗性的對象的病原菌，還可列舉青枯病菌。「青枯病」是以青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)等細菌為病原而引發的疾病，主要使茄子、番茄等茄科作物、蘿蔔等十字花科作物、草莓等200餘種植物受到感染、災害。在日本，到目前為止已知20科38 種植物發生本病(非專利文獻9)。作為本發明中使用的EEM基因和_基因，只要是來源於對十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌為抗性的生態型植物的基因即可，不特別限制。例如，作為 RPS4基因和RCH2基因的來源的優詵擬南芥牛傑型，可列舉Ws-O、No-O、Nd-I、Aa-O、Ei 1-0、 Rrs-7、Sha、Tamm_2、Tsu-U Fei_0、Ts-U Bsch-0、Br-O> Est-U Rrs-10、Van-O> Nfa_8、 Bay-0(參照圖7 圖11)。擬南芥的EEM基因和_基因分別被賦予了 At5g45250和 At5g45260的AGI代碼，關於它們的具體序列可以從非專利文獻10或P0LYM0LPH的網址 "http //polymorph, weigelworld. org/」提取。此外，關於EEM基因，將來源於擬南芥生態型Ws-O的DNA的鹼基序列示於序列號1，將其蛋白質的胺基酸序列示於序列號2，將來源於擬南芥生態型No-O O^edoroff氏非專利文獻11)的DNA的鹼基序列示於序列號5，將其蛋白質的胺基酸序列示於序列號6，將來源於擬南芥生態型Nd-I的DNA的鹼基序列示於序列號9，將其蛋白質的胺基酸序列示於序列號10。關於_基因，將來源於擬南芥生態型 Ws-O的DNA的鹼基序列示於序列號3，將其蛋白質的胺基酸序列示於序列號4，將來源於擬南芥生態型No-O O^edoroff氏非專利文獻11)的DNA的鹼基序列示於序列號7，將其蛋白質的胺基酸序列示於序列號8，將來源於擬南芥生態型Nd-I的DNA的鹼基序列示於序列號11，將其蛋白質的胺基酸序列示於序列號12。在賦予植物以針對青枯病的抗性的情況下，特別優選使用來源於擬南芥的抗性生態型Nd-I、No-0 (Fedoroff氏非專利文獻11)、和中度抗性的Ws-O的RPS4基因和RCH2基因的組合。而且，本發明中還可以使用編碼與由這些來源於擬南芥的RPS4基因或RCH2基因所編碼的蛋白質在結構上類似的蛋白質的DNA(例如，上述RPS4基因和RCH2基因的突變體或除擬南芥以外的植物中的同源基因)。編碼與由RPS4基因或RCH2基因所編碼的蛋白質在結構上類似的蛋白質的DNA包含下述DNA (i)編碼下述蛋白質的DNA，所述蛋白質具有在由上述來源於對十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌為抗性的生態型的擬南芥品種的RPS4基因或RCH2基因所編碼的蛋白質的胺基酸序列中，替換、缺失、插入和/ 或添加1個或多個胺基酸而得的胺基酸序列；(ii)與包含上述來源於對十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌為抗性的生態型擬南芥品種的RPS4基因或RCH2基因的鹼基序列的DNA在嚴格條件下雜交的DNA ； (iii)編碼下述蛋白質的DNA，所述蛋白質包含與由上述來源於對十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌為抗性的生態型擬南芥品種的RPS4基因或RCH2基因所編碼的蛋白質的胺基酸序列具有90%以上的同源性的胺基酸序列。對於EEM基因或編碼與由該基因所編碼的蛋白質在結構上類似的蛋白質的DNA、和 _基因或編碼與由該基因所編碼的蛋白質在結構上類似的蛋白質的DNA的組合，只要能夠通過對植物導入該組合來至少賦予植物以針對十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌的抗性即可，不特別限制。這裡進行替換等的「多個胺基酸」通常為1 30個胺基酸以內，優選為1 10個胺基酸以內，更優選為1 5個胺基酸以內，更優選為1 3個胺基酸以內。對於能夠替換、 缺失、添加和/或插入胺基酸的區域，只要能夠維持上述抗性即可，不特別限定。所謂「嚴格
8條件」，是指鈉濃度為25 500mM、優選為25 300mM，且溫度為42 68°C、優選為42 650C ο例如，5XSSC(83mM NaCl、83mM檸檬酸鈉)、溫度為42°C。所謂「90%以上的同源性」， 是指胺基酸序列整體的90%以上、優選為95%以上(例如，96%以上、97%以上、98%以上、 99%以上)的序列的同源性。胺基酸序列、鹼基序列的同源性使用Karlin和Altschul開發的算法 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87, 2264-2268.、Karlin, S. & Altschul， SF.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90, 5873.)來確定。還開發了基於 BLAST 算法的被稱為 BLASTN、BLASTX 的程序(Altschul, SF.等人，J Mol Biol, 1990，215，403.)。在使用 BLASTN分析鹼基序列時，參數例如得分(score) = 100、字長(wordlength) = 12。另外，在使用BLASTX分析胺基酸序列時，參數例如為得分=50、字長=3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認參數。這些分析方法的具體方法是公知的(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/) 0上述編碼與由EEM因或_因所編碼的蛋白質在結構上類似的蛋白質的DNA， 可以通過本領域技術人員公知的方法來調製，所述方法例如，雜交技術(Southern，EM.，J Mol Biol，1975，98，503·)、聚合酶鏈反應(PCR)技術(Saiki，RK.等人，Science，1985，230， 1350.、Saiki, RK.等人，kience，1988，239，487.)、或對該 DNA 通過定點誘變法(Kramer, W. &Fritz, HJ. , Methods Enzymol，1987，154，350.)引入突變的方法。另外，在自然界也會發生由於鹼基序列的突變而引起所編碼的蛋白質的胺基酸序列的突變。這些DNA的形態包括基因組DNA、cDNA和化學合成DNA，可以利用常用方法來製備。關於由此製備的DNA的組合是否能賦予植物以針對病原菌的抗性，可以如下評價製作導入了這些DNA的組合的轉化植物體，研究該轉化植物體在暴露於病害脅迫的狀態下是否能抑制疾病發生。可以如下製作轉化體植物體例如，將本發明的DNA的組合插入到能保證在植物內表達的載體中，利用該載體在植物體內表達本發明的DNA的組合。作為載體中所用的啟動子，不限於在天然狀態下控制本發明的DNA的表達的固有啟動子。例如，可以使用在植物中被廣泛應用的來源於花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子。轉化對象可以是整個植物體， 還可以是植物器官(例如種子、葉、花瓣、莖、根等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質部、維管束等)或植物培養細胞。作為轉化中所用的植物，從本發明的目的出發， 對十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌為敏感性的植物(生態型)是適合的。 作為植物種類，可列舉例如，擬南芥(Arabidopsis thaliana)、白菜、小松菜、蕪青(以上為 Brassica rapa)、捲心菜(Brassica oleracea)、油菜軒(Brassica napus)、蘿蔔(Raphanus sativus)等十字花禾鬥植物，番(Solanum lycopersicum L.)、爺子(Solanummelongena)、 棉子椒(Capsicum annuum cv. Grossum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、菸草(Nicotiana tabacum)等禾鬥植物，菊禾鬥的菊(Chrysanthemum morifolium)、色蕉禾鬥的香蕉(Musa spp.、 Musa acuminata、Musa balbisiana)、薔蔽禾鬥的草莓(Fragaria ananassa)、葫聲禾鬥的蔓蕩枝(苦瓜)(Momordica charantia L. var. pavel Crantz)等，但不限於這些例示出的植物。上述表達載體可以通過常規的轉化方法，例如電穿孔法、農桿菌法、基因槍法、 PEG法等導入植物中。例如，在使用電穿孔法時，利用具備脈衝控制儀的電穿孔裝置，在電壓500 1600V、25 1000 μ F,20 30msec的條件下進行處理，從而將基因導入宿主中。另外，在使用基因槍法時，可以直接使用植物體、植物器官、植物組織本身，也可以製備切片然後使用，還可以製備原生質體來使用。可以使用基因導入裝置(例如Bio-Rad社的PDS-1000/He等)處理這樣製備的樣品。處理條件根據植物或樣品不同而不同，通常以 1000 1800psi左右的壓力、5 6cm左右的距離進行。另外，可以通過利用植物病毒作為載體，從而將本發明的DNA導入植物體中。作為可利用的植物病毒，可列舉例如花椰菜花葉病毒。即，首先，將病毒基因組插入來源於大腸桿菌的載體等中來製備重組體，然後在病毒的基因組中插入這些目標DNA。可以將這樣被修飾後的病毒基因組用限制性酶從重組體上切下，接種到植物宿主中，從而將目標DNA導入植物宿主中。在利用農桿菌的Ti質粒的方法中，利用屬於農桿菌屬(Agrobacterium)的細菌一旦感染植物，就會使其所具有的質粒DNA的一部分轉移到植物基因組中這樣的性質，可以將目標DNA導入植物宿主中。屬於農桿菌屬的細菌中的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物形成被稱為冠癭的腫瘤，另外，髮根農桿菌(Agrobacteriumu rhizogenes)感染植物產生毛狀根。這是由於，這些農桿菌在感染時，被稱為Ti質粒或Ri 質粒的各細菌中所存在的質粒上的被稱為T-DNA區域(轉移DNACTransferredDNA))的區域轉移到植物中，並整合到植物的基因組中的緣故。只要在Ti或Ri質粒上的T-DNA區域中插入想要整合到植物基因組中的DNA，就可以在農桿菌屬細菌感染植物宿主時將目標DNA 整合到植物基因組中。轉化獲得的腫瘤組織和/或幼芽、毛狀根等可直接用於細胞培養、組織培養或器官培養，還可以使用現有公知的植物組織培養法，通過加入適當濃度的植物激素(植物生長素、細胞分裂素、赤黴素、脫落酸、乙烯、芸苔素內酯(brassinolide)等)等，從而使其再生成植物體。作為由上述轉化植物細胞等再生出轉化植物體的再生方法，可採用例如，將愈傷組織狀的轉化細胞轉移到改變了激素的種類、濃度的培養基中培養，使其形成不定胚，從而獲得完整的植物體的方法。作為所使用的培養基，可例示LS培養基、MS培養基等。作為本發明中的轉化植物體的製造工序，包括將插入有本發明的DNA的植物表達載體導入宿主細胞而獲得轉化植物細胞，再由該轉化植物細胞再生出轉化植物體的工序。另外，導入有本發明的DNA的轉化植物體還可以通過雜交來製造。即，通過使保持本發明的DNA(抗性型基因)的植物、和可與該植物雜交且未保持本發明的DNA的植物雜交，從而在未保持本發明的DNA的植物中導入本發明的DNA，賦予其針對病原菌的抗性。只要獲得了染色體內導入有本發明的DNA的轉化植物體，就可以由該植物體通過有性生殖或無性生殖獲得後代。另外，還可以由該植物體和/或其後代或克隆獲得種子等， 以它們為基礎來大量生產該植物體。另外，對於本發明的轉化植物體的部分，例如，可以製成農作物供給食用等。本發明包括本發明的轉化植物體的「部分或繁殖材料」，例如，植物器官(例如種子、葉、花瓣、 莖、根等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質部、維管束等)或植物培養細胞。為了從轉化植物體獲得植物種子，例如，從髮根培養基中採摘轉化植物體，移栽到加入了含水的土壤的盆中，使其在一定溫度下生長，開花，並最終形成種子。另外，為了由種子生產植物體，例如，在轉化植物體上所形成的種子成熟之後，將種子分離並播種到含水的土壤中，使其在一定溫度、照度下生長，從而生產植物體。這樣育種而得的植物通過表達所導入的DNA的組合，而成為獲得了針對多種病原菌的抗性的病害脅迫耐性植物。實施例以下，使用實施例更詳細地說明本發明，但本發明的技術範圍不限於以下實施例。〔實施例1〕通過SSLP(簡單序列長度多態性(simplesequence lengthpolymorphism))分析來探索抗性基因使對十字花科蔬菜類炭疽病菌(希金斯刺盤孢(Colletotrichumhigginsianum)) 為抗性的擬南芥生態型Wassilewskiia(Ws-O)、與敏感性的Columbia(Col-O)雜交，從而得到Fl種子。再使Fl個體自花受粉而獲得F2種子。對播種後栽培4周的擬南芥Fl植物 (22°C、12小時光周期/12小時暗周期的循環)噴霧接種切105個/ml的炭疽病菌孢子懸浮液，6天後進行鑑定，結果全部顯示抗性。接著，對同樣栽培的F2植物噴霧接種切105個/ml 的炭疽病菌孢子懸浮液，結果抗性個體數與敏感性個體數以3 1分離，由此判明了抗性是顯性的，且該抗性由單基因支配或由相鄰的多個基因支配。因此，可預想，在從上述F2組中篩選出具有對病原菌為敏感性的表型的個體時，該個體以純合的方式具有對應於Ws-O的目標基因座的Col-O的基因(等位基因)。因此，還可以預想，在用多態性標記研究根據表型篩選出的大量F2個體的染色體結構時，在基因型顯示純合的Col型的頻率最高的區域附近存在目標基因的等位基因。基於該預想，為了鑑定目標基因而進行了 SSLP分析，結果成功地將目標基因的存在區域壓縮至多態性標記N01-K11I1與N01-K17022所夾的區域(圖 1)。〔實施例2〕EEM基因(At5g45250)和M位基因(At5g45260)中的突變與對炭疽病菌的抗性的關係的分析在實施例1的方法中，無法製作能夠用於進一步壓縮目標基因的存在區域的多態性標記，因SSLP分析存在界限。因此，使用抗性生態型Ws-O的T-DNA插入文庫，對約3萬個系進行篩選，結果獲得了 8個針對炭疽病為敏感性的T-DNA插入突變體。對這些突變體的 Ws-At5g45250和Ws-At5g45260的鹼基序列進行分析，結果發現了在這些基因中引入了突變的突變體。在At5g45250中有5個鹼基缺失的突變體Δ At5g45250_21、以及在At5g45^0 中插入了 T-DNA標籤的突變體AAt5g45^0-l和ΔAt5g45^0_2對炭疽病菌顯示敏感性 (圖2 "Ws-O突變體」)。對於Ws-At5g45250，已由本發明者們闡明其為抗性基因(特願2007-86343)，對於 At5g45^0，猜想其可能為抗性基因。因此，比較了對炭疽病菌為抗性的生態型Ws-O與敏感性的生態型Col-O中的At5g45^0的胺基酸序列(圖3)。在Col_At5g45260中，從WRKY結構域到C末端側約有80 90個胺基酸缺失。與Col-At5g45260同樣地在C末端側被確認了缺失的生態型Cvi-0、Bur-0也對炭疽病菌顯示敏感性。由此可判明，At5g45260也與對炭疽病菌的抗性有關，為了獲得該抗性，至少從At5g45^0WRKY結構域到C末端側的約80 90胺基酸的存在是重要的。而且，在對炭疽病菌為敏感性的生態型(Ler-l、LoV-5、C24)中，第775位的酪氨酸被替換成了天冬醯胺。這顯示該胺基酸對抗性是重要的(圖10 圖11)。〔實施例3〕At5g45250和At5g45260中的突變與對具有avrRps4基因的細菌性葉斑病菌的抗性的關係的分析使用已知也會感染擬南芥的具有avrRPS4基因的番茄細菌性葉斑病菌(丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv. tomato))來研究針對植物病原菌的抗性。 將細菌性葉斑病菌在添加了卡那黴素(25 μ g/ml)和利福平(25 μ g/ml)的金氏B(King』 s B)液體培養基中振蕩培養過夜。將菌體懸浮液製成IX IO5(cfu)/ml，將該菌液接種到播種後栽培7周的擬南芥(22°C、8小時光周期/16小時暗周期的循環)的蓮座葉的背面，該接種是通過擠壓無針的Iml注射器來施加壓力，將菌液注入葉中，從而接種病原菌。在接種後第3天用打孔器剜下接種葉，在IOmM MgSO4溶液中破碎，將菌體懸浮液接種到固體培養基上，計數2天後出現的菌落數，從而測定出每單位葉面積的菌的增殖量。將接種了番茄細菌性葉斑病菌的植物(野生株、過表達體、基因破壞體)的敏感度(病原細菌的增殖)的結果示於圖4A和圖4B。(l)At5g45260與對細菌性葉斑病的敏感度的關係(圖4A)At5g45260被破壞的突變體與Ws_0野生型相比，菌的增殖較多，對細菌性葉斑病的敏感度提高。(2)At5g45250與對細菌性葉斑病的敏感度的關係(圖4B)At5g45250被破壞的突變體與Ws-O野生型相比，菌的增殖也較多，細菌性葉斑病的敏感度也提高。另外，在At5g45250被破壞的突變體中轉化包含約21Λ的啟動子區域的約61Λ的Ws-At5g45250基因而得的回覆體與Ws-O野生型同樣地顯示抗性。另外，在對炭疽病菌和細菌性葉斑病為敏感性的生態型RLD中導入了包含約21Λ的啟動子區域的約61Λ 的Ws-At5g45250基因的轉化體對細菌性葉斑病顯示強的抗性。由以上結果可判明，在對細菌性葉斑病的抗性表達中At5g45250和At5g45260 兩者也都是必須的。到目前為止報告了僅At5g45250與對細菌性葉斑病的抗性表達相關(非專利文獻幻，但本結果顯示，At5g45260也與對細菌性葉斑病的抗性表達相關。特別是，由於在作為在已報告的擬南芥生態型中唯一的敏感性生態型的RLD-O中，通過導入 Ws-At5g45250而獲得了對細菌性葉斑病和炭疽病菌的抗性，因此明確了其本來具有對這些病原菌為抗性的At5g45^0，敏感性的原因在於At5g45250。〔實施例4〕擬南芥生態型No-O和Ws-O的At5g45250和At5g45260中的突變與對炭疽病菌和青枯病菌的抗性的關係的分析首先，對於已報告對青枯病菌為抗性的來源於i^edoroff氏的No-O (非專利文獻 12)，研究其對炭疽病菌、細菌性葉斑病的抗性。其結果是，該生態型對這兩種病原菌顯示抗性。因此，使用No-O中的轉座子突變體，研究了 At5g45250和At5g45^0中的突變與對這些病原菌的抗性的關係(圖2 「來源於狗(101~#€氏的No-O轉座子突變體」)。其結果是，在At5g45250中插入有轉座子標籤的突變體AAt5g45250-31(rps4-31)對炭疽病菌顯示敏感性。另外，在At5g45250的啟動子區域和At5g45^0中插入有轉座子標籤的突變體 Δ At5g45250-60-l也對炭疽病菌顯示敏感性。在擬南芥生態型No-O (來源於!^doroff氏) 中，At5g45250和At5g45260也與對炭疽病菌的抗性相關。製備IXlO8(Cfu)/ml的青枯病菌懸浮液。對播種後在石棉上栽培了 7周的擬南芥(22°C、8小時光周期/16小時暗周期的循環)連同石棉將根切斷，將20ml以上上述菌液灌注入斷根部分。接種後第7天鑑定發病。接種了青枯病菌的植物(野生株、基因破壞體) 的敏感度的結果示於圖5A 圖5G。生態型Nd-I、No-0, Ws-O對青枯病為抗性(圖5A 圖5C)、Col-O為敏感性(圖5D)。AAt5g45250-60-l被報告對青枯病菌為敏感性(非專利文獻12)。根據本發明，證明了在來源於Fedoroff氏的No-O的At5g45250中插入有標籤的突變體 AAt5g45250-31(rps4-31)對青枯病菌為敏感性(圖5E)。在生態型Ws-O的At5g45250中有5個鹼基缺失的突變體AAt5g45250-21(rps4-21)、以及在At5g45260中插入有T-DNA標籤的突變體AAt5g45260-l (rch2_l)對青枯病菌顯示強的敏感性(圖5F 圖5G)。由以上結果顯示，如果將來源於Fedoroff氏的No-O和Ws-O的At5g45250和At5g45260轉化到對這些病原菌為敏感性的植物中，則可以製作對炭疽病菌、細菌性葉斑病和青枯病菌為抗性的植物。〔實施例5〕在擬南芥的炭疽病菌敏感性的生態型Col-0、RLD-O中導入抗性基因、 以及其效果在擬南芥中的炭疽病菌敏感性的生態型Col-0、RLD-O中導入炭疽病菌抗性的生態型Ws-O的At5g45250或At5g45260，研究是否獲得了對炭疽病菌的抗性(圖6A 圖6D)。 其結果是，在野生型Col-O中導入抗性基因Ws-At5g45250而得的轉化體對該菌顯示抗性， 但植物發生了矮小化(圖6B)。另外，在野生型RLD中導入抗性基因Ws-At5g45250而得的轉化體正常生長，並且對該菌顯示抗性(圖6C)。在野生型Col-O中導入作為抗性基因的來源於Fedoroff氏的NO-0_At5g45260而得的轉化體正常生長，並且對該菌顯示抗性(圖 6D)。由以上結果可判明，野生型Col-O即使導入了炭疽病菌抗性型的Ws-At5g45250，也不能穩定維持，但導入了炭疽病菌抗性型的來源於Fedoroff氏的No-0_At5g45260的轉化體能夠在植物體內穩定維持，並對炭疽病菌顯示抗性。RLD-O本來具有抗性型的At5g45260， 通過導入抗性型的Ws-At5g45250，從而能在植物體內穩定維持，並對炭疽病菌顯示抗性。這樣通過導入2種不同的抗性基因，可以製作對炭疽病菌顯示抗性的植物。此外，本領域技術人員容易理解導入了來源於Fedoroff氏的No-0_At5g45260的 Col-O具有對細菌性葉斑病為抗性的At5g45250和對青枯病為抗性的At5g45260，因此對細菌性葉斑病和青枯病也顯示抗性。〔實施例6〕各種擬南芥生態型中對炭疽病的敏感度與At5g45250和At5g45260的胺基酸序列的關係對於擬南芥生態型，研究對炭疽病的敏感度(圖7 圖8)。對於這些生態型，利用擬南芥的SNP分析數據(非專利文獻10)，進行At5g45250和At5g45260的胺基酸序列的系統樹分析(圖7 圖8)。對於At5g45250，對炭疽病為敏感性和抗性的生態型混合存在而被分類。將具有At5g45250的各生態型的胺基酸序列進行比較，結果是在對十字花科蔬菜類炭疽病、細菌性葉斑病和青枯病全部為敏感性的RLD-O中，第950位的酪氨酸被替換成組氨酸(圖9)。因此，製作將對炭疽病為抗性的Ws-O中的Ws-At5g45250的第950位酪氨酸替換成組氨酸的構建體，並導入以Ws-O為背景的Ws-At5g45250破壞體 AAt5g45250-21(rps4-21)中，結果該轉化體對炭疽病顯示敏感性，不能回復抗性。因此， 顯示出本胺基酸對抗性是重要的。另一方面，At5g45260的胺基酸序列的系統樹分析的結果是，關於At5g45260，敏感性的生態型被分類為1個小組(圖7)。該小組(Ler-ULov-5, C24)如實施例2所記載的那樣，第775位的酪氨酸被替換為天冬醯胺。顯示出本胺基酸對抗性是重要的(圖10 圖11)。〔實施例7〕在擬南芥中的炭疽病菌敏感性的生態型Col-O中導入來源於生態型
13Ws-O 的 At5g45250 和 At5g45260、以及其效果由實施例2 6中的結果顯示，在植物對炭疽病菌的抗性中，At5g45250和 At5g45260這2種基因是必須的，通過將這2種基因導入炭疽病菌敏感性的生態型的植物中，可以將該植物轉換成炭疽病菌抗性的生態型。本發明者們為了在此確認該事實，在擬南芥中的炭疽病菌敏感性的生態型Col-O中導入了炭疽病菌抗性的生態型Ws-O的At5g45250 和At5g45260，研究了是否能獲得對炭疽病菌的抗性。其結果正如實施例5(圖6B)已經證明的那樣，在野生型Col-O中導入抗性基因 Ws-At5g45250而得的轉化體對該菌顯示抗性，但植物發生了矮小化(圖12左)。在該矮小化後的轉化體中導入來源於炭疽病菌抗性型的生態型Ws-O的Ws-At5g45260而得的轉化體在植物體內穩定維持，迴避了矮小化而正常生長(圖12右)，並且獲得了對炭疽病菌的抗性(圖13)。以上再次確認了可以通過導入2種不同的抗性基因，來製成對炭疽病菌顯示抗性的植物。另外，雖然已經報告了一般如果單獨導入抗病性基因則植物矮小化的事例，但再次確認了可以通過組合導入多種基因，從而迴避這樣的抗性植物製造中的植物矮小化的問題。此外，本領域技術人員容易理解同時導入了來源於Ws-O的Ws_At5g45250和 Ws-At5g45260的Col-O具有對細菌性葉斑病為抗性的Ws-At5g45250和對青枯病為抗性的 Ws-At5g45260，因此對細菌性葉斑病和青枯病也顯示抗性。〔實施例8〕在小松菜中的炭疽病菌敏感性的品種「杉 ^ 」中導入來源於擬南芥生態型Ws-O的At5g45250和At5g45260、以及其效果由實施例2 6中的結果顯示，在植物對炭疽病菌的抗性中，At5g45250和 At5g45260這2種基因是必須的，通過將這2種基因導入炭疽病菌敏感性的生態型的植物中，可以將該植物轉換成炭疽病菌抗性的生態型。本發明者們為了再次確認該事實，在小松菜中的炭疽病菌敏感性的品種「Β 力」中導入了炭疽病菌抗性的擬南芥生態型Ws-O的 At5g45250和At5g45260，研究了是否能獲得對炭疽病菌的抗性。其結果是，在野生型小松菜中導入Ws-At5g45250而得的轉化體大多數發生了矮小化，不能維持個體，好不容易生長出的個體也發生了植物矮小化。另外，在野生型小松菜中導入抗性基因Ws-At5g45260而得的轉化體不能夠穩定地獲得對炭疽病菌的抗性(圖14 右)。另一方面，在野生型小松菜中同時導入擬南芥生態型Ws-O的At5g45250和At5g45260 而得的轉化體在植物體內穩定維持，植物也正常生長，並且變成對炭疽病菌為抗性(圖14 左)。以上結果再次確認了可以通過導入2種不同的抗性基因，來製成對炭疽病菌顯示抗性的植物。另外，雖然已經報告了一般如果單獨導入抗病性基因則植物矮小化的事例，但再次確認了可以通過組合導入多種基因，從而迴避這樣的抗性植物製造中的植物矮小化的問題。此外，本領域技術人員容易理解導入了來源於Ws-O的Ws_At5g45250和 Ws-At5g45260的小松菜具有對細菌性葉斑病為抗性的Ws_At5g45250和對青枯病為抗性的 Ws-At5g45260，因此對細菌性葉斑病和青枯病也顯示抗性。產業可利用性本發明適合用於例如白菜、小松菜、蕪青、捲心菜、油菜籽、蘿蔔等十字花科作物和 /或番茄、茄子、柿子椒、馬鈴薯等茄科植物的育種領域，通過利用本發明，可以保護這些作物免受由十字花科蔬菜類炭疽病菌、斑細菌病菌和青枯病菌造成的病害，從而可以提高其生產效率。
權利要求
1.賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性的方法，其特徵在於，將2種以上基因的組合導入植物中，所述基因單獨不賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性，但通過上述組合來賦予植物以針對這些病原菌的抗性。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，病原菌是十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌，基因的組合是EEM基因和_基因的組合。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，EEM基因和m基因來源於選自Ws-0、No-O, Nd-UAa-O>Ei1-0>Rrs_7、Sha>Tamm-2>Tsu_l、Fei_0、Ts_l、Bsch_0、Br_0、Est_l、Rrs_10、 Van-O、Nfa_8、Bay-O中的擬南芥生態型。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其中，病原菌還包含青枯病菌。
5.被賦予了針對2種以上病原菌的抗性的轉化植物體，該轉化植物體如下獲得將2 種以上基因的組合導入植物中，所述基因單獨不賦予植物以針對2種以上病原菌的抗性， 但通過上述組合來賦予植物以針對這些病原菌的抗性。
6.根據權利要求5所述的轉化植物體，其中，病原菌是十字花科蔬菜類炭疽病菌和番茄細菌性葉斑病菌，基因的組合是EEM基因和RCH2基因的組合。
7.根據權利要求6所沭的轉化棺物體,其中，RPS4基因和RCH2基因來源於詵自Ws_0、 No-O> Nd-U Aa-O> Eil_0、Rrs_7、Sha> Tamm-2> Tsu-U Fei_0、Ts-U Bsch_0、Br-O> Est-U Rrs-10、Van-O、Nfa_8、Bay-O 中的擬南芥生態型。
8.根據權利要求6或7所述的轉化植物體，其還具有針對青枯病菌的抗性。
9.轉化植物體，其是權利要求5 8的任一項所述的轉化植物體的後代或克隆。
10.權利要求5 9的任一項所述的轉化植物體的部分或繁殖材料。
全文摘要
發現了擬南芥的基因組上相鄰的多種不同抗性基因識別多種不同病原體的攻擊而引發抵抗反應。可以通過將多種不同抗性基因組合導入植物中，從而賦予植物以針對多種不同病原體的抗性。
文檔編號A01H5/00GK102215667SQ20098013837
公開日2011年10月12日 申請日期2009年7月29日 優先權日2008年7月31日
發明者白須賢, 鳴坂義弘, 鳴坂真理 申請人:獨立行政法人理化學研究所