基於短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液及其製備和應用方法

2023-05-28 02:41:16

專利名稱：基於短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液及其製備和應用方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因輸送技術領域的轉染介質及其製備和應用方法，具體是一種基於短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液及其製備和應用方法。
背景技術：
基因治療是通過基因水平的操縱和幹預來預防或抑制疾病的發生和發展過程。目前已經有多種類型的基因藥物，如表達治療基因的質粒DNA或病毒載體、DNA疫苗、反義核酸、核酶、小幹擾RNA等都已被廣泛用於基因治療的研究。相關的體內外研究都取得了很好的結果，顯示這些基因治療策略有望成為遺傳疾病、腫瘤、病毒感染等疾病的有效治療手段。不過，應用基因進行基礎研究和疾病治療的主要障礙是缺乏有效的基因輸送方法和載體。目前常用的載體可以分為病毒載體和非病毒載體兩類，病毒載體是非常有效的轉基因載體，但是病毒載體的容量有限，可能會導致免疫反應或細胞毒性，另外還可能會產生致病的缺損型病毒或整合到宿主基因組中引起致癌反應，而且重複使用病毒載體也會因誘導的免疫反應而削弱轉基因的表達效果，考慮到這些局限性，對非病毒載體的研究愈來愈引起人們的關注。目前研究常用的非病毒載體包括脂質體、陽離子聚合物、殼聚糖、微球等。 相對於病毒載體，這些非病毒載體具有大的裝載容量，低免疫原性等特點，但較低的轉染效果同樣也限制了它們的使用。目前最簡單的方法是將基因直接導入靶細胞內，特別在一些組織如肌肉，注射裸DNA質粒並結合其他的方法如基因槍、電穿孔、聲致孔等則取得了很好的效果。電穿孔是一種採用機械方法將極性分子通過細胞膜引入宿主細胞的方法，由於它高效率、快速、易於執行、組織特異性好、價格便宜等優點，該技術已經成為相當有效的非病毒基因轉移技術，並在生物學研究和醫療領域廣泛使用。這種基於電脈衝的高效DNA導入可能與電脈衝導致的細胞膜通透性提高和DNA電泳效果有關，因此轉染相關的參數如電脈衝強度和持續時間、電極類型和插入方式、DNA的濃度、轉染緩衝液的成分及濃度等都會影響基因電轉染的效果，對這些參數的優化有助於提高基因電轉染的效果，減小毒副作用，提高其在基礎研究和臨床應用中的可行性。經過對現有技術的檢索發現，F.Nicol，M. Wong，F. C. MacLaughlin，J. Perrard, E.Wilson, J. L. Nordstrom, L.C.Smith, Poly-L-glutamate, an anionic polymer, enhancestransgene expression for plasmids delivered by intramuscular injection with in vivoelectroporation, Gene Ther, 0002) 1351—1358一種陰離子聚合物 聚-L-穀氨酸，提高了質粒在骨骼肌內電穿孔轉基因表達中記載了在DNA的電轉染溶液中添加一種陰離子聚合物聚穀氨酸可以明顯提高外源基因電轉染後在相應組織裡的表達量。但是該技術使用的聚穀氨酸需要化學合成或發酵製備，臨床使用對其聚合度的控制和純度都有很高的要求。另外，其對組織和細胞的毒性及在體內的降解清除都需要考慮。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基於短鏈核酸片段(short sequenceDNA, ssDNA)的基因電轉染緩衝液及其製備和應用方法，通過在電轉染過程中使用該電轉染緩衝液，促進外源基因進入細胞及在細胞內的表達，提高在目標細胞的基因電轉染效果並消除毒副作用，通過這種作用一方面可以直接提高基因的電轉染輸送效果，另一方面可以減少外源基因的使用量或使用相對較低的電壓達到同樣的基因輸送效果。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過首先將鮭魚精DNA經超聲處理後回收DNA片段，再用生理鹽水配製成短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液；然後將需要轉染的外源基因溶解於短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液中配製成基因電轉染液，用於目標細胞的電轉染輸送。所述的鮭魚精DNA的濃度為lmg/mL。所述的回收DNA片段是指採用瓊脂糖凝膠進行電泳，根據電泳標籤割膠回收 300-500bp 的 DNA 片段。所述的生理鹽水是指經過滅菌的0. 9%氯化鈉溶液，用量為0. OlmL-lmL。所述的短鏈核酸片段為單鏈或雙鏈的DNA或RNA片段；為通過合成、生物提取、或通過對其它核酸的擴增、酶切、超聲或其它方法製備得到；其長度為從二十個鹼基或鹼基對到兩千個鹼基或鹼基對。所述的外源基因包括動物、植物和微生物的細胞基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA 或RNA、核酶、反義核酸、小幹擾RNA或其它類型的核酸及其載體，該外源基因為從生物中直接分離得到或通過化學合成或採用分子克隆等技術製備得到。所述的短鏈核酸片段與外源基因的比例為0.2 1到8 1。所述的目標細胞包括體外培養的植物細胞、動物細胞、微生物及動植物體內組織細胞。本發明涉及上述方法製備得到的基於短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液，其組分含量為每毫升緩衝液含9mg氯化鈉、0. 4μ g-40mg短鏈核酸片段，餘量為無菌去離子水。本發明將短鏈核酸片段應用到基因電轉染過程中，明顯提高了基因電轉染的效果。其優點在於短鏈核酸片段可以明顯提高基因電轉染的效率，其基因為各種類型和結構的核酸序列及其載體；短鏈核酸片段來源廣泛、製備簡單，不同來源、不同形態和長度的核酸片段對基因電轉染效果都有促進作用；短鏈核酸片段本身作為生命體遺傳物質的組成成分，在體內或細胞內容易被核酸酶快速降解，沒有免疫原性和毒副作用；短鏈核酸片段對體外培養的植物細胞、動物細胞、微生物以及體內組織細胞的電轉染效果都具有促進作用。


圖1短鏈核酸片段在組織細胞中對螢光素酶報導基因電轉染效果的促進作用。圖2不同電場強度下短鏈核酸片段對螢光素酶報導基因電轉染效果的促進作用。圖3不同含量的短鏈核酸片段對螢光素酶報導基因電轉染效果的促進作用。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液(EP-buffer)的製備將lmg/mL 的鮭魚精 DNA (Promega)超聲(150W，40kHz, 25°C，) 20 分鐘後經 1 %瓊脂糖凝膠電泳(60V，lhr)分離，根據電泳對照條帶(marker)割取300_500bp片段處的凝膠， 用Qiagen公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化DNA片段，並用生理鹽水配製成lmg/mL 的短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液(EP-buffer)備用。生理鹽水滅菌的0. 9%氯化鈉溶液。報導基因螢光素酶(Iuciferase)質粒(pGL3_ControlVector)購買自 Promega 公司，將其轉化感受態細胞DH5 α後搖菌擴增，使用Qiagen公司的質粒提取試劑盒(Giga kit)進行抽提，用生理鹽水配製成lmg/mL的溶液備用。基因電轉染液的製備基因電轉染液1:將3μ1 lmg/mL螢光素酶質粒，3μ 1 lmg/mL的短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液和44 μ 1的生理鹽水混勻製備成總體積為50 μ 1的基因電轉染溶液 1(bufferl)。基因電轉染液2:將3μ1 lmg/mL螢光素酶質粒，6μ 1 lmg/mL的短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液和41 μ 1的生理鹽水混勻製備成總體積為50 μ 1的基因電轉染溶液 2(buffer2)。基因電轉染液3:將3μ1 lmg/mL螢光素酶質粒，12μ 1 lmg/mL的短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液和35 μ 1的生理鹽水混勻製備成總體積為50 μ 1的基因電轉染溶液 3(buffer3)。實驗動物使用的小鼠為6-8周的健康雄性BALB/c，購於上海實驗動物中心。電脈衝儀和電極針使用的電脈衝儀由上海TERESA科技公司提供。所用電極針為兩針電極，針間距3mm，針長5mm。 實驗過程包括如下步驟實驗進行前，用40mg/mL的水合氯醛(Chloral hydrate)按體重的1 %對小鼠進行腹腔注射麻醉，小鼠完全鎮定後，在小腿脛前肌部位注射準備好的基因電轉染液 (buffer) 50 μ L·注射結束1分鐘內，跨注射點插入兩針電極並釋放電脈衝，電脈衝參數為電壓60V或36V，脈衝個數6，脈衝持續時間50毫秒，脈衝間隔1秒。電轉染一天後取轉染組織並勻漿，10000rpm，4°C離心10分鐘後取上清使用螢光素酶檢測試劑盒(ftOmega)和 TD-20/20化學/生物發光檢測儀(Turner Designs)檢測螢光素酶的含量。試驗結果以及分析。在使用60V電壓(200V/cm)電轉染過程中結合使用含300_500bp短鏈核酸片段的電轉染緩衝液的實驗組(buffer 2)，其組織細胞內報導基因螢光素酶的表達水平達到 3500，而不使用短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液的對照組只有350，即使是轉染三倍劑量的報導基因(9 μ gpGL3-Control Vector)，如果不使用短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液，其表達值也只有1400 (圖1)，因此使用短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液，能夠使報導基因的電轉染效果提高9倍以上，其表達水平比三倍劑量報導基因的表達值也要提高2. 5倍左右，說明使用短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液能夠明顯提高基因的電轉染效果。採用一個相對較低的電壓36V(120V/cm)進行電轉染時，結果顯示未使用短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液組的報導基因表達約為100，而使用了短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液的轉染組，其報導基因在組織細胞裡的表達可以達到1700(圖2~)。實驗結果表明在較低的電壓下，短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液對基因電轉染效果的提高同樣有很好的作用。針對電轉染緩衝液中不同含量的短鏈核酸片段對基因電轉染效果的影響， 我們製備了三種電轉染液，其短鏈核酸片段對外源基因的比分別為1 l(bufferl)， 2 l(buffer2)和4 1 (buffer3)，實驗結果如圖3所示短鏈核酸片段對外源基因的比例為1 1，螢光素酶質粒的轉基因表達提高了約8倍，比例為2 1時的促進作用最好，達到15倍左右；比例為4 1時的作用雖然較1 1和2 1低，但螢光素酶的表達還是比對照組(不使用短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液)高5倍以上。該實驗結果說明我們製備的不同含量短鏈核酸片段的電轉染緩衝液都能夠很好的提高外源基因的電轉染效果及在細胞內的表達水平。
權利要求
1.一種加入短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液的製備方法，其特徵在於，加入短鏈核酸片段的濃度為0. 4 μ g-40mg/mL。
2.根據權利要求1所述的加入短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液的製備方法，其特徵是，所述的短鏈核酸片段為單鏈或雙鏈的DNA或RNA片段，該短鏈核酸片段通過合成、生物提取或對其它核酸的擴增、酶切、超聲製備得到，其長度為二十個鹼基或鹼基對到兩千個鹼基或鹼基對。
3.—種加入短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液，其特徵在於，含有經超聲處理後回收的鮭魚精DNA片段以及生理鹽水，且該緩衝液含有0. 4 μ g-40mg/mL的短鏈核酸片段。
4.一種提高基因電轉染效率的方法，其特徵在於，通過在緩衝液中加入短鏈核酸片段得以實現。
5.根據權利要求4所述的提高基因電轉染效率的方法，其特徵是，所述的電轉染的目標是體外培養的植物細胞、動物細胞以及微生物。
6.根據權利要求4所述的提高基因電轉染效率的方法，其特徵是，所述的電轉染的目標是體內組織細胞。
7.根據權利要求4或6所述的提高基因電轉染效率的方法，其特徵是，所述的電轉染的目標包括肌肉、腫瘤、肝臟、肺、皮膚、腦以及胚胎。
8.根據權利要求4所述的提高基因電轉染效率的方法，其特徵是，所述的電轉染的基因物質包括動物、植物和微生物的基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA或RNA、核酶、反義核酸和小幹擾RNA，該基因物質從生物中分離得到、通過化學合成或採用分子克隆技術製備得到。
全文摘要
一種基因輸送技術領域的基於短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液及其製備和應用方法，將鮭魚精DNA經超聲處理後回收DNA片段，再用生理鹽水配製成含短鏈核酸片段DNA的電轉染緩衝液；將外源基因溶解於短鏈核酸片段DNA電轉染緩衝液後製成基因電轉染液，用於目標細胞的電轉染輸送。本發明通過使用含短鏈核酸片段的基因電轉染緩衝液，能夠明顯提高外源基因在目標細胞的基因電轉染效果並消除毒副作用，通過這種作用一方面可以直接提高基因的電轉染輸送效果，另一方面可以減少外源基因的使用量或使用相對較低的電壓達到同樣的基因輸送效果。
文檔編號C12N15/87GK102206680SQ201110094160
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月14日 優先權日2011年4月14日
發明者彭金良, 徐宇虹, 趙勇剛 申請人:上海交通大學