釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌的篩選方法及其應用與流程
2023-05-28 00:34:26
本發明屬於促植物生長
技術領域：
，具體涉及釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌的篩選方法及其應用。
背景技術：
：植物體是由多細胞構成的有機體，構成植物體的各器官間在生長上表現出相互依賴和相互制約的相關性。植物的地上部分和地下部分有維管束的聯絡，存在著營養物質與信息物質的大量交換。地上部分的生長和活動需要根系提供水分、礦物質元素、氮素以及根中合成的植物激素、胺基酸等。促進植物快速生長有利於植物將無機碳轉化為有機碳，在有限的時間內提高植物代謝物和農產品的產量。植物的快速生長受遺傳因子和環境條件影響。為了保證植物正常生長，植物提供適宜的陽光、水份、溫度和土壤。為了使促進植物快速生長，通常人為的提供植物生長的營養元素，通常將營養元素施加到土壤中，利於根部吸收，還可以通過葉面噴施營養液，達到快速吸收的目的。除了遺傳因子和環境條件對植物生長有影響外，植物生長激素的調節和控制也能夠促進植物生長。例如，吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄基氨基嘌呤等生長激素能促進植物生根，乙烯利和萘乙酸等促進花芽形成，2,4-D具有促進果實膨大、早熟的作用。植物生長調節劑的施用方法有溶液噴灑法、浸泡法、塗抹法、土壤澆灌法等。目前，沒有關於釀酒葡萄根內生菌有促進植物生長的報導。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於提供釀酒葡萄根內生菌的篩選方法及其應用，所述釀酒葡萄根內生菌具有促進植物生長的作用。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的篩選方法，包括以下步驟：1)將釀酒葡萄根段接種到分離培養基上，培養長出菌落；2)將所述步驟1)長出的菌落轉接到新鮮的分離培養基上，分離至純種。優選的，所述步驟1)中培養的溫度為25～30℃，所述培養的時間為2～5d。優選的，所述菌落形態為菌落呈乳白色，羽狀、有凸起，易挑起。優選的，分離培養基包括營養肉湯培養基。本發明提供的所述釀酒葡萄根內生菌或者所述篩選方法得到的釀酒葡萄根內生菌在促進釀酒葡萄植物生長中的應用。優選的，所述促進釀酒葡萄植物生長包括通過釀酒葡萄根內生菌分泌吲哚乙酸到釀酒葡萄根際的土壤中。優選的，所述促進釀酒葡萄植物生長還包括通過降解磷來達到促進植物生長的目的。所述降解磷的種類包括有機磷和無機磷。優選的，所述釀酒葡萄根的葡萄樹的種類為包括紅葡萄品種和白葡萄品種。優選的，所述紅葡萄品種包括A03山葡萄、N08梅鹿輒、Q02左優紅、H07北冰紅或E05赤霞珠；所述白葡萄品種包括F01霞多麗、J02威代爾、F06威代爾、F02貴人香或F07白玉霓。本發明提供了釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的篩選方法，包括以下步驟：1)將釀酒葡萄根段接種到分離培養基上，培養長出菌落；2)將所述步驟1)長出的菌落轉接到新鮮的分離培養基上，分離至純種。本發明提供的篩選方法，步驟簡單，重複性好，成本低，菌種易得。本發明提供的根癌土壤桿菌為革蘭氏陽性菌，是從釀酒葡萄根中分離純化得到的內生菌，菌落乳白色，羽狀、有凸起，易挑起，可分解色素；經16SrDNA序列測定及系統發育分析所述根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)分類學上為α-變形菌綱土壤桿菌屬。生理生化實驗表明能分解葡萄糖產酸和分解明膠，但無法分解澱粉，吲哚實驗均為陰性。本發明提供的所述篩選方法得到的釀酒葡萄根內生菌釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)在促進釀酒葡萄植物生長中的應用。通過所述釀酒葡萄根內生菌釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)XZ11菌株與植物聯合作用，實現了所述釀酒葡萄根內生菌實現促進釀酒葡萄植物生長。進一步的，本發明提供的所述應用，通過篩選得到的釀酒葡萄根內生菌菌株具有產吲哚乙酸活性兼具解磷特性，能夠將植株難以吸收利用的P轉化為可利用形態，提高植株對P的利用率，同時內生菌分泌的吲哚乙酸被植物吸收利用，促進植物快速生長，且對植物具有較好的定殖和適應力，更為後續的定植機制、生物學特性、生態學和資源調查以及微生物菌肥的開發應用等一系列工作奠定基礎。具體實施方式本發明提供了釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的篩選方法，包括以下步驟：1)將釀酒葡萄根段接種到分離培養基上，培養長出菌落；2)將所述步驟1)長出的菌落轉接到新鮮的分離培養基上，分離至純種。本發明中，所述釀酒葡萄根段優選從釀酒葡萄根。所述釀酒葡萄根的來源優選從甘肅省蘭州市紫軒葡萄園區採集，得到釀酒葡萄根。所述釀酒葡萄根的葡萄樹的種類優選為包括紅葡萄品種和白葡萄品種。本發明中，所述紅葡萄品種優選包括A03山葡萄、N08梅鹿輒、Q02左優紅、H07北冰紅或E05赤霞珠；所述白葡萄品種優選包括F01霞多麗、J02威代爾、F06威代爾、F02貴人香或F07白玉霓。其中A03山葡萄為8年份，J02威代爾為6年份，其餘品種均為3年份。所述釀酒葡萄根的採集時間為釀酒葡萄成熟期。本發明中，所述釀酒葡萄根在切段前優選採用70～75％乙醇溶液進行浸泡1～2min後，用有效氯含量為2～3％的NaClO溶液處理2～3min，再用無菌水清洗3～5次。本發明中，所述釀酒葡萄根段的長度優選為1～2cm。本發明中，所述釀酒葡萄根段優選採用無菌解剖刀切斷。本發明中，所述接種優選將釀酒葡萄根段的切面向下。本發明中，所述分離培養基包括營養肉湯培養基。所述營養肉湯培養基的配方優選為牛肉膏3g/L蛋白腖10g/LNaCl5g/L瓊脂20g/L。本發明中，所述培養的溫度為25～30℃，更優選為27℃；所述培養的時間為2～5d；更優選為3～4d。本發明中，為了確保釀酒葡萄根表面消毒徹底，設置對照實驗。所述對照實驗具體為取最後一次清洗用水1塗布於PDA培養基上，28℃培養，若無菌生長則說明釀酒葡萄根表面消毒徹底，能夠用於後續實驗，若有菌落生長，說明消毒不徹底，繼續消毒後再次塗布，直至得到消毒徹底的釀酒葡萄根。得到長出菌落後，本發明將長出的菌落接種到新鮮的分離培養基上，分離至純種。本發明中，所述接種的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的接種的技術方案即可。本發明中，所述接種到新鮮的分離培養基上的菌落優選根據菌落的形態選擇接種。所述菌落的形態優選為菌落乳白色，羽狀、有凸起，易挑起，可分解色素。本發明中，所述分離至純種的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的分離至純種的技術方案即可。本發明提供的根癌土壤桿菌為革蘭氏陽性菌，經16SrDNA序列測定及系統發育分析所述根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)分類學上為α-變形菌綱土壤桿菌屬。生理生化實驗表明能分解葡萄糖產酸和分解明膠，但無法分解澱粉，吲哚實驗均為陰性。本發明中，所述釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)優選進行生理生化實驗。所述生理生化實驗包括甲基紅實驗，澱粉實驗，明膠液化實驗和吲哚實驗。本發明中，所述釀酒葡萄根內生菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)優選採用16SrDNA序列進行分子鑑定。本發明中，所述分子鑑定的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的分子鑑定的技術方案即可。本發明提供的所述的釀酒葡萄根內生菌的篩選方法，所述篩選方法操作簡單，步驟簡潔，重複性好。本發明提供的所述釀酒葡萄根內生菌或者所述篩選方法得到的釀酒葡萄根內生菌在促進釀酒葡萄植物生長中的應用。本發明中，所述促進釀酒葡萄植物生長優選包括通過釀酒葡萄根內生菌分泌吲哚乙酸到釀酒葡萄根際的土壤中。本發明中，所述促進釀酒葡萄植物生長優選還包括通過降解磷來達到促進植物生長的目的。本發明中，所述磷包括有機磷和無級磷。下面結合實施例對本發明提供的釀酒葡萄根內生菌及其篩選方法和應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。實施例1篩選方法從甘肅省蘭州市紫軒葡萄園區中採集成熟期釀酒葡萄根。先用自來水將採集的葡萄根表面衝洗乾淨，於無菌環境下晾乾水分。取釀酒葡萄根，在70％乙醇中浸泡1min後，用有效氯含量為3％的NaClO溶液處理2min，再用無菌水清洗3-4次。為確保釀酒葡萄根表面消毒徹底，取最後一次清洗水1mL塗布於PDA培養基上，28℃培養，無菌生長，則將清洗的根段用於後續實驗。用無菌解剖刀將根切成約2cm長段，切面向下，將每個部位的組織塊分別置於NB培養基、改良高氏一號和馬丁氏-孟加拉紅培養基上，3次重複，28℃培養5d。培養期間，長出了菌落乳白色，羽狀、有凸起，易挑起，可分解色素的菌落。將長出的菌落轉接到新鮮的分離培養基上，並劃線分離至純種。將從不同分離培養基上獲得的菌種轉移至PDA斜面培養基上，28℃，2d後，4℃保存。得到的篩選菌命名為XZ11-1菌株。實施例2篩選方法從甘肅省蘭州市紫軒葡萄園區中採集成熟期釀酒葡萄根。先用自來水將採集的葡萄根表面衝洗乾淨，於無菌環境下晾乾水分。取釀酒葡萄根，在75％乙醇中浸泡1.5min後，用有效氯含量為2.5％的NaClO溶液處理1.5min，再用無菌水清洗4次。為確保釀酒葡萄根表面消毒徹底，取最後一次清洗水1mL塗布於PDA培養基上，27℃培養，無菌生長，則將清洗的根段用於後續實驗。用無菌解剖刀將根切成約1cm長段，切面向下，將每個部位的組織塊分別置於NB培養基、改良高氏一號和馬丁氏-孟加拉紅培養基上，4次重複，30℃培養2d。培養期間，長出了菌落乳白色，羽狀、有凸起，易挑起，可分解色素的菌落。將長出的菌落轉接到新鮮的分離培養基上，並劃線分離至純種。將從不同分離培養基上獲得的菌種轉移至PDA斜面培養基上，28℃，5d後，4℃保存。得到的篩選菌命名為XZ11-2菌株。實施例3篩選方法從甘肅省蘭州市紫軒葡萄園區中採集成熟期釀酒葡萄根。先用自來水將採集的葡萄根表面衝洗乾淨，於無菌環境下晾乾水分。取釀酒葡萄根，在75％乙醇中浸泡2min後，用有效氯含量為3％的NaClO溶液處理1min，再用無菌水清洗5次。為確保釀酒葡萄根表面消毒徹底，取最後一次清洗水1mL塗布於PDA培養基上，27℃培養，無菌生長，則將清洗的根段用於後續實驗。用無菌解剖刀將根切成約1.5cm長段，切面向下，將每個部位的組織塊分別置於NB培養基、改良高氏一號和馬丁氏-孟加拉紅培養基上，4次重複，30℃培養3d。培養期間，長出了菌落乳白色，羽狀、有凸起，易挑起，可分解色素的菌落。將長出的菌落轉接到新鮮的分離培養基上，並劃線分離至純種。將從不同分離培養基上獲得的菌種轉移至PDA斜面培養基上，28℃，3d後，4℃保存。得到的篩選菌命名為XZ11-3菌株。實施例4～6將實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別進行培養得到三株篩選菌，分別用AxyPrep細菌DNA製備試劑盒(AXYGEN)提取得到的三株篩選菌DNA。並將其作為PCR反應模板。利用引物27F和1492R擴增待測菌株的16SrDNA基因序列(引物信息見表1)，並進行DNA測序。表116SrDNA基因引物信息表PCR擴增反應體系：PCR反應參數：94℃預變性5min；94℃，30s，58℃，45s，72℃，80s，共35個循環；72℃×7min；4℃保存。檢測：PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序：送至甘肅金博研生物科技有限公司測定。將測序結果進行正反向拼接，得到的序列採用MAGE5.0比對，發現三條序列完全相同，如SEQIDNo.1序列所示，通過將SEQIDNo.1序列在NCBI中進行blast比對，結果發現所述SEQIDNo.1序列與Agrobacteriumtumefaciens相似度100％，因此可以確定三株篩選菌分類學上為α-變形菌綱，土壤桿菌屬，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。實施例7～9將實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別進行澱粉實驗分別得到實施例7～9檢測結果。具體為將菌株接種在澱粉瓊脂培養基中，所述澱粉瓊脂培養的配方為3g牛肉膏，10g蛋白腖，5gNaCl，20g可溶性澱粉，20g瓊脂，pH7.2-7.4，1×105Pa滅菌20min。30℃，48h後，滴加少量碘液於平板上並鋪滿，所述的碘液為1.0g碘，2.0g碘化鉀和300.0mL蒸餾水配製而成，若菌落周圍出現透明圈，說明能分解澱粉，為陽性，用「+」表示，反之，用「—」表示。實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株澱粉實驗結果見表2。實施例10～12將實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別進行明膠液化實驗得到實施例10～12檢測結果。將XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株穿刺分別接種在明膠培養基中，明膠培養基的配方為5g蛋白腖，120g明膠，pH7.2-7.4，1×105Pa滅菌20min。在30℃條件進行180r/min培養，24h後，置於冰水中觀察固化情況，若液化則不再凝固為陽性，用「+」表示，反之，用「—」表示。實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株澱粉實驗結果見表2。實施例13～15將實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別進行吲哚實驗得到實施例13～15檢測結果。將XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別接種於10mL的蛋白腖水培養液中，30℃，180r/min，24-48h後，加入1mL乙醚，充分振蕩，靜置至乙醚層浮於培養液上，加入10滴吲哚試劑，乙醚層變玫瑰紅，表明有吲哚存在為陽性，用「+」表示，反之，用「—」表示。實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株吲哚實驗結果見表2。實施例16～18將實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別進行甲基紅實驗得到實施例16～18檢測結果。將XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分別接種於10mL的葡萄糖蛋白腖培養液中，所述的葡萄糖蛋白腖培養液的配方為3g牛肉膏，10g蛋白腖，5gNaCl，20g可溶性澱粉，20g瓊脂，pH7.2-7.4，1×105Pa滅菌20min。30℃，180r/min，36h後，滴加3～4滴甲基紅試劑，若培養液變紅，判定菌株能分解葡萄糖產酸為陽性，用「+」表示，反之，用「—」表示。實施例1～3篩選得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株甲基紅實驗結果見表2。表2XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株生理生化實驗結果實施例澱粉實驗明膠液化實驗吲哚實驗甲基紅實驗實施例7—---實施例8—---實施例9—---實施例10-+--實施例11-+--實施例12-+--實施例13--—-實施例14--—-實施例15--—-實施例16---+實施例17---+實施例18---+註：陰性用「—」表示，陽性用「+」表示，為參與反應部分用「-」表示。實施例19～21磷降解實驗包括有機磷降解實驗和無機磷降解實驗。採用溶磷圈法進行定性測試：將實施例1～3分離獲得的內生菌點接種於有機磷篩選培養基上，30℃，7d後，觀察是否存在溶P透明圈，有則說明該菌株具有溶有機磷能力，若觀察不存在溶P透明圈則說明該菌株不具有溶有機磷能力。有機磷篩選培養基按照如下配方進行配製：10g蔗糖，0.3gNaCl，0.3gMgSO4·7H2O，0.03gFeSO4·7H2O，5gCaCO3，0.3gKCl，0.5g(NH4)2SO4，0.6g卵磷脂，0.03gMnSO4·4H2O，20g瓊脂，pH7-7.2，1×105Pa滅菌20min。採用修改後的平板溶磷圈法進行定性測試：將實施例1～3分離獲得的分離得到的內生菌點接種到無機磷篩選培養基上，30℃，7d後，觀察是否存在溶P透明圈，有則說明該菌株具有溶無機磷能力，若觀察不存在溶P透明圈則說明該菌株不具有溶無機磷能力。無機磷篩選培養基按照如下配方進行配製：10g葡萄糖，0.3gNaCl，0.3gKCl，0.03gFeSO4·7H2O，5gCa3(PO4)2，0.3gMgSO4·7H2O，0.5g(NH4)2SO4，0.03gMnSO4·4H2O，20g瓊脂，pH7，1×105Pa滅菌20min。結果表明實施例1～3分離獲得的分離得到的內生菌對有機磷降解和無機磷降解結果均存在溶P透明圈，說明實施例1～3分離獲得的分離得到的內生菌均有溶無機磷的能力，同時也具有溶有機磷能力。實施例22～24吲哚乙酸分泌菌株定性篩選實驗將實施例1～3分離得到的內生菌接種到含有100mg/LL-色氨酸的LB培養基中，30℃，180r/min，48h後，取2mL菌液於白色陶瓷杯中，以2mL50mg/LIAA標準液為陽性對照，再加2mLSalkowski顯色液，搖勻，室溫避光反應30min，若顏色變紅表示該菌株能分泌IAA吲哚乙酸，否則表示該菌株不能分泌IAA吲哚乙酸。通過以IAA標準液作為陽性對照，與Salkowski顯色液進行定性試驗，確定實施例1-3分離得到的三個菌株均能利用L-色氨酸分泌IAA，說明實施例1-3分離得到的三個菌株為分泌吲哚乙酸的菌株。由以上實施例可知，從甘肅省蘭州市紫軒葡萄園區中採集得到的成熟期釀酒葡萄根，從釀酒葡萄根中分離篩選得到的內生菌為根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。本發明提供的所述釀酒葡萄根內生菌或者所述篩選方法得到的釀酒葡萄根內生菌通過釀酒葡萄根際內生菌分泌吲哚乙酸到釀酒葡萄根際的土壤中和降解磷在促進釀酒葡萄植物生長中的應用。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3