加壓式培養裝置的製作方法

2023-05-28 00:18:06 1

專利名稱:加壓式培養裝置的製作方法
本發明為加壓式培養裝置。詳言之為在體外高密度培養細胞或需氧微生物的加壓式培養裝置。
在體外高密度培養細胞或需氧微生物時，必須向培養槽內的培養液中供給充足的氧和排除培養液中產生的廢物，且需充分地進行培養液交換以補充營養成分。對前者來說，已知有添加血紅蛋白或添加作為氧載體的溶解氧相當於水20倍的氟化碳等(杉野幸夫編、「細胞培養技術」講談社，1985.P133)、在常壓下進行培養的裝置，以及在上述培養槽內的培養液上面或該液中設置可以通氣的氧氣導入管，在常壓下使氧氣和該培養液接觸或在該液中使之起泡的裝置等。對於後者，必須從培養液中分離出細胞，為此採用將含細胞的培養液直接過濾或利用細胞的比重比培養液大的細胞沉澱管方式(杉野幸夫編、「細胞培養技術」講談社，1985，P.148)。
但是，培養液中添加多餘的物質會導致從培養液中回收、分離精製生產物質時的操作變的複雜，而且在培養液上面通入氧氣，由於培養液攪拌速度的不同，其效率受到影響;向培養液中通氣雖然能提高效率，但存在使培養液發泡引起細胞破壞等各種問題。
另一方面，從上述培養液中分離細胞，直接過濾培養液時，很快會發生堵塞，因而不能長期使用;採用細胞沉澱管方式時如果周圍溫度不恆定，會在沉澱管內產生對流，則不能從培養液中分離出細胞，進而，由於能分離的培養液的量受到細胞沉澱速度的限制，以致在進行高密度培養時存在培養液不能充分交換等問題。
鑑於上述情況，本發明提供了能供給高密度培養所需要的足夠量的氧並能充分進行培養液交換的加壓式培養裝置。
本發明具備可將細胞或需氧微生物的培養液密閉貯存在內部的培養槽;連接該培養槽內上部空隙的從供氧部通過流量調節部能將氧送到上述培養槽內和供氧用管路;同樣接在上述培養槽上且通過排氣調節部能將上述培養槽內的氣體排出的排氣用管路;攪拌培養液中培養液的攪拌手段;檢測培養液中溶存氧濃度的溶存氧濃度檢測手段，以及根據該溶存氧濃度檢測手段的檢測輸出控制上述調節部、以便能保持培養槽內處於氧加壓狀態的控制部分。
提供的加壓式培養裝置還設有往培養槽補給培養基的培養基供給手段和培養液的循環通路，並在該循環通路的途中插設不透過細胞等的、但能透過培養液中溶解成分的過濾管路的培養液過濾手段。
本發明裝置的構成是根據培養液中溶存氧的濃度自動將培養槽內保持在氧加壓狀態，從而強制性地使氧溶解在培養液中，並且能充分地供給氧量。其特徵是在培養液的循環過程中將培養液中的溶解成分排到該循環流線外，還設置了向培養槽內供給新培養基且能有效地將培養液進行交換的培養液交換手段。
本發明裝置是以細胞和需氧微生物(以下稱細胞等)作為對象的高密度培養裝置。
用於本發明裝置的培養槽最好是由培養液貯存槽以及以能裝卸的形式安裝在該槽上且可以密封該槽的蓋體構成。因此，如下所述，安裝在培養槽上的規定部件及管路，最好安裝在上述的蓋體上。此時規定部件及管路的安裝應能保持上述密閉狀態。
用於本發明裝置的供氧管路的安裝應能在上述培養槽內的空隙中留有開口。上述供氧管路通過流量調節部分接到供氧部分。在該供氧部分用高壓氧氣瓶或根據需要用壓縮機，以便能按該供給部的供給氧壓將上述培養槽內保持在加壓狀態。上述流量調節部採用能密閉該管路或能調節該管路內氧氣流量的結構，例如電磁閥、針閥等。也可在該供氧管路上設置除菌過濾器。
用於本發明的排氣管路，其安裝應能在上述培養槽內的空隙中留有開口。在上述排氣管路上設有排氣調節部分。該排氣調節部採用能閉鎖管路或能調節排氣量的結構，例如電磁閥，針閥等。上述排氣管路也可以單獨延伸到下水道。
用於本發明裝置的攪拌手段，只要能使培養液的溶存氧濃度均勻，任何手段均可，但是從不破壞培養液中的細胞等且能將培養槽內的加壓狀態保持恆定的觀點來看，最好是使用磁性攪拌器、攪拌用攪拌槳等的機械裝置。
用於本發明裝置的溶存氧檢測手段，最好是溶存氧電極(DO傳感器)。該濃度檢測手段接在後述的控制部分上。
上述控制部分有能存儲規定溶存氧濃度的存儲部;該存儲值和用上述溶存氧濃度檢測手段測定的測定濃度值進行比較的比較部;根據該比較部的輸出信號，上述供氧管路上的調節部分、排氣管路上的排氣部分和氧氣供應部分工作。上述存儲部分所存儲的溶存氧濃度值根據培養對象物培養時需要的氧量而有所不同，最好為5ppm左右。上述比較部分，當測定濃度值比存儲濃度值小時，上述調節部分及排氣部分根據比較部分的信號進行工作以致能閉鎖各管路，然後供氧部分工作。當該供氧部使用壓縮機時，該壓縮機根據比較部的信號進行工作。通過該工作使培養槽內處於氧加壓狀態，而該加壓相應於上述存儲濃度值最好在0.3～0.7kg/cm2左右。
此外，在本發明裝置的培養槽中附設帶有過濾手段的培養液循環流路和培養基供給手段。由附設的這些循環流路和培養基供給手段構成培養液交換手段。上述插設的過濾手段採用了主要由不透過細胞等但能透過培養液中溶解成分的過濾器管路組成的裝置，即採用了過濾器的面對著循環流路、設在同一軸上，因而當培養液通過該流路的循環過程中，能將上述透過成分排至該循環流路之外，由這種結構構成的所謂橫流式裝置。上述過濾手段的結構最好是能在循環流道上裝卸。上述過濾器管路最好是陶瓷製成的。
上述循環流路中設有輸液手段。該輸液手段最好是蠕動移液泵。
上述培養基供給手段是由培養基貯槽和從該貯槽通過輸液手段接到培養槽的培養基輸送用管路構成。上述輸液手段最好是蠕動移液泵。該培養基供給手段是在培養槽內的貯存培養液比規定量減少時進行工作，其操作最好能自動控制。該自動控制機構最好是能根據培養槽內培養液的液面變動進行輸液手段的工作，例如，在培養槽內設置液面傳感器，根據該液面傳感器的輸出信號，控制上述輸液手段的驅動或停止。
根據需要，還可在本發明裝置中設置至培養槽的二氧化碳供給管線及空氣輸入管線。即，當在防止培養液的pH值偏移到鹼性側時，需要供給二氧化碳;在供氧量過多細胞等產生障礙時，為了降低培養槽內的氧濃度則有必要輸入空氣。上述二氧化碳供給管線及空氣輸入管線可以各自具有調節部件並獨立配置，還可以各自具有調節部件以管線形式接到上述供氧管上。
本發明之培養槽中可以設置普通的培養液pH測定手段和控制培養液溫度的手段。
按照本發明，能在培養槽內保持氧加壓狀態，由此能使氧氣強制性地溶解在培養液中，以致溶存氧經常以高於一定濃度的狀態存在，因此能高密度地進行細胞或需氧微生物的培養。培養液由設有過濾手段的循環流路循環，因此可以將培養液中的溶解成分排至該循環流路之外，又可以將細胞分離出來並殘留在該流路內，培養液通過循環再次返回培養槽中。此外，由培養基供給手段提供新鮮培養基，在培養槽內將以貯存一定量的培養液。
以下根據實施例詳細說明本發明，但本發明並不受實施例的限制。
具體實施方式
圖1是本發明之加壓式培養裝置的一實施例的構成說明圖。圖中，加壓式培養裝置(1)由培養槽(2)、攪拌裝置(3)、DO傳感器(4)、控制部分(5)、供氧管路(a)、排氣管路(b)構成。
培養槽(2)具有可以密封的培養液注入口和排出口(圖中設示出)，且設有攪拌裝置(3)。設置該攪拌裝置的目的是攪拌培養液並使該培養液中的溶存氧濃度均勻。
供氧管路(a)由氧氣瓶(6)順次通過電磁閥(7)、流量計(8)、除菌過濾器(9)、洗氣瓶(10)與培養槽相接、排氣管路則通過電磁閥(12)及除菌過濾器(11)與培養槽(2)相接。
控制部分(5)包括存儲部分(51)和濃度比較部分(52)，存儲部分(51)存儲預先設定的溶存氧濃度的濃度值。濃度比較部分(52)與DO傳感器(4)相接，對用該DO傳感器測定的溶存氧濃度和上述存儲濃度值進行比較。根據該濃度比較部分傳出的信號，控制部分(5)使供氧線(a)上的電磁閥(7)及排氣管線(b)上的電磁閥(12)進行開閉動作。
以下說明本裝置的操作。
首先將應該設定的溶存氧濃度預先貯存在存儲部裡。另一方面在培養槽內貯存含有細胞或需氧微生物的培養液並攪拌之。在該狀態下將供氧管線上的電磁閥和排氣管線上的電磁閥都處於開啟狀態，並在培養液上使氧氣接觸通過。然後，關閉上述各電磁閥，在此狀態下開始培養。此期間在控制部分的濃度比較部用設置在該培養液中的DO傳感器測出來的溶存氧濃度和開始設定的濃度值進行比較。如果在該狀態下培養下去，培養液中的溶存氧為細胞或需氧微生物所消耗，則用DO傳感器測出的濃度值會低於上述有儲濃度值。這樣，供氧管路上的電磁閥及排氣管路上的電磁閥工作至開啟狀態並由氧氣瓶供給氧氣使其通往培養液上面。如果在此狀態下繼續進行培養，細胞密度或需氧微生物的密度就會變高，該培養液中溶存氧的消耗速度加快，象上述那樣僅僅靠在培養液上面通氧氣是不能維持上述存儲濃度值的。這種狀態意味著用DO傳感器測出的測定值比上述記憶濃度值低，而此時控制部分進行工作僅使上述排氣管路上的電磁閥關閉，其結果是在培養槽內由於供氧而呈加壓狀態。在此狀態下氧氣強制性地被溶解在培養液中，培養液中的溶存氧濃度變高，使培養繼續進行達到高密度的培養效果。
以下對裝置加以說明，該裝置中裝有向培養槽進一步補給培養基的培養基供給手段和培養液的循環流路，並在該循環流路的途中插設有不讓細胞透過而讓培養液中溶解成分透過的過濾器組成的培養液過濾手段。
圖2是本發明之加壓式培養裝置一實施例的構成說明圖。圖中，加壓式培養裝置(1)主要由培養槽(2)，攪拌手段(13)、供氧手段(23)，排氣手段(15)，培養基供給手段(16)，培養液過濾手斷(17)，控制部分(18)組成。
培養槽(2)由培養液貯存槽和可以裝卸能使它密閉的蓋體組成。在該蓋體的規定位置上分別設有，DO傳感器(21)、pH電極(22)、液面傳感器(23)及後述的各管路。在該培養槽上還設有圖中未示出的溫度調節器，其結構為能將培養液的溫度保持穩定。
攪拌手段(13)中採用了磁性攪拌器。(31)是其旋轉體。通過該攪拌手段攪拌培養液，使該培養液中的溶存氧濃度變得均勻。
供氧手段(14)由從未圖示的氧氣瓶開始依次通過電磁閥(4)，除菌過濾器(42)並接到培養槽(2)之蓋體上的供氧管路(a)組成。該管路(a)在培養槽內的上部空間開口設置。在該管路的電磁閥(41)和除菌過濾器之間也可設置洗氣瓶。氧氣流量用附屬在氣瓶上的流量計調節。
排氣手段(15)由排氣用管路(b)構成，該排氣用管路在培養槽內的上部空間開口，並安裝在培養槽(2)的蓋體上，順次將除菌過濾器(151)及電磁閥(152)進行管路接續，並延伸到圖中未示出的排氣口。
培養基供給手段(16)由貯存新鮮培養基的培養基罐(61)和培養基供給用管路(c)構成，培養基供給用管路在培養基罐(61)的底部近傍開口，通過蠕動移液泵(62)接到培養槽(2)的蓋體上，並且在培養基槽內的上部空間開口。
培養液過濾手段(17)是由，在培養槽內的底部附近開口且安裝在蓋體上，並順序通過蠕動移液泵(71)、過濾部分(72)、再次接到蓋體且在培養槽內的上部空間開口設置的培養液循環流路(d)構成。上述過濾部分(72)採用橫流式過濾裝置。也就是將具有筒狀過濾面的過濾器管路插設到上述循環流路(d)上，以致過濾面設置在與該流路的同一軸上，在該過濾管路的外側收容濾液的外筒狀容器。該過濾器管路是按可以交換安裝的。在上述過濾部分(72)，上濾液排放管路(e)通過蠕動移液泵(73)接到培養液回收罐(74)上。
(f)是與二氧化碳瓶相接並有電磁閥(19)的二氧化碳供給管路，(g)是與空氣瓶相接、並有電磁閥(20)的空氣導入管路。
控制部分(8)分別與DO傳感器(21)、pH電極(22)、液面傳感器(23)、電磁閥(41)、(52)、(9)、(10)、蠕動移液泵(62)、(71)、(73)、電氣相接，控制它們的工作。該控制部分主要由控制培養液中溶存氧濃度的溶存氧濃度控制系統，和控制培養液交換的培養液交換控制系統構成。在上述溶存氧濃度控制系統中，有存儲部和濃度比較部，存儲部存儲預先設定的溶存氧濃度的濃度值。濃度比較部是對DO傳感器測出的溶存氧濃度值和上述存儲濃度值進行比較。而且根據來自濃度比較部的信號，供氧管路(a)上的電磁閥(41)及排氣管路(b)上的電磁閥(152)進行開閉動作。在上述培養液交換控制系統中，根據液面傳感器(23)是否接通，該養基供給手段的蠕動移液泵進行一定時間的工作。
以下說明裝置的工作。
溶存氧濃度的檢測及供氧，由於與圖1示出裝置的工作相同，因而省略，只對培養液的交換進行說明。
首先，根據控制部的指令，設在培養液循環流路上的蠕動移液泵起動，使培養槽內的培養液循環通過該流路。隨著該循環，在該流路的過濾部分，溶解在該流路內培養液中的廢物和培養基成分等的溶解成分，從過濾管路浸出而排至該流路之外，而由此分離並殘留的培養細胞隨循環流再次返回至培養槽內。上述排出的溶液成分通過設置在回收管路上的蠕動移液泵的工作送到培養回收罐。由於這種過濾操作，培養槽內的貯存培養液量減少，隨之液面下降，一旦預先設定的液面傳感器離開液面，該傳感器就不會接通，這將成為液面檢測信號並輸到控制部，根據輸出功率值，培養基供給手段的蠕動移液泵進行一定時間的工作。從而，新鮮的培養基能定量地供入培養槽內，能更加高密度地進行培養。
採用上述圖2示出的裝置培養人淋巴系統細胞NAT-30的結果示於圖3。下面列出此時的各種條件。
培養液量500ml培養基牛血清白蛋白、胰島素、鐵傳遞蛋白、乙醇胺、亞硒酸鈉添加RDF培養基培養條件溫度37℃攪拌轉數60rpmDO5.0ppmpH7.2培養液交換率 1.0l/天過濾器管路孔徑10μm外徑10mm，內徑7mm，長200mm的陶瓷過濾器圖3的結果證明，用本發明之裝置可以長期進行高密度培養。
按照本發明，培養液中氧氣用加壓方法被強制地溶解，並且通常是存在超過一定濃度的溶存氧，因此能以比原來更高的密度培養需氧微生物，而且能從少量的培養液中回收大量的細胞生產物。還由於沒有必要往培養液中添加供氧用的物質，故可以很容易進行細胞生產物的回收、分離精製。該裝置還可長期而有效地進行培養液更換。因而能長期進行高密度培養。
以下簡單說明附圖圖1、圖2是本發明之加壓式培養裝置的一實施例構成說明圖，圖3是採用本發明裝置培養人淋巴系細胞時的培養時間和細胞密度關係的曲線圖。
(2)……培養槽 (3)……攪拌手段(4)……DO傳感器 (15)……排氣手段(16)……培養基供給手段(17)……培養液過濾手段 (8)……控制部分(21)……DO傳感器 (22)……pH電極(23)……液面傳感器 (31)……旋轉體(61)……培養基罐 (72)……過濾部分(41)、(52)、(9)、(10)……電磁閥(62)、(71)、(73)……蠕動移液泵(a)……供氧管路(b)……排氣管路(c)……培養基供給管路(d)……培養液循環流路(e)……濾液排出管路(f)……二氧化碳供給管路(g)……空氣導入管路
權利要求
1.加壓式培養裝置，該裝置中具備能將細胞或需氧微生物的培養液密閉地貯存在內部的培養槽、能從供氧部分通過流量調節部分將氧供入上述培養槽內的供氧管路、能從上述培養液中通過排氣調節部分將培養槽內氣體排出的排氣管路、攪拌培養槽內培養液的攪拌手段、檢測培養液中溶存氧濃度的溶存氧濃度檢測手段、以及根據該溶存氧濃度檢測手段的檢測輸出功率控制上述調節部分從而能將培養槽內保持為氧加壓狀態的控制部分；上述供氧管路是在處於培養槽內液體上部的空隙部分開口，以便由它供給的氧實際上不會使培養液起泡，排氣用管路是在上述空隙部分開口。
2.權利要求
1所述的加壓式培養裝置，其中控制部分備有存儲規定溶存氧濃度的存儲部、對存儲在該存儲部的存儲濃度和用溶存氧濃度檢測手段測定的測定濃度進行比較的比較部，並能對供氧部分、流量調節部分及排氣調節部分發出動作指令，以致當該測定濃度值小於上述存儲濃度值時向培養槽供給氧直到溶存氧濃度超過上述存儲濃度值，從而使該槽內保持氧加壓狀態。
3.權利要求
1所述之加壓式培養裝置，其中裝設了向培養槽中補給培養基的培養基供給裝置和培養液的循環流路，並在該循環流路途中插設了由不透過細胞但能透過培養液中溶解成分的過濾器管路組成的培養液過濾手段。
4.權利要求
1所述之加壓式培養裝置，其中，供氧管路上至少接有二氧化碳供給管路及空氣導入管路的任何一種。
專利摘要
本發明涉及的是加壓式培養裝置。
文檔編號C12M1/36GK87106371SQ87106371
公開日1988年4月27日 申請日期1987年9月17日
發明者小島清嗣, 山形浩一 申請人:株式會社島津製作所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan