編碼核酶的副粘病毒載體及其應用的製作方法

2023-05-28 08:10:51 2

專利名稱：編碼核酶的副粘病毒載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼具有催化活性的RNA的副粘病毒載體及其應用。
背景技術：
有催化活性的低分子量RNAs，例如核酶，已經被用於抑制真核細胞基因表達，而且最近它們在人類基因治療中的應用引起關注。錘頭型核酶主要在細胞質中激活，因此向細胞質的有效轉運是成功的關鍵(Koseki，S.et al.，J Virol 73(3)，1868-77(1999)；Kuwabara，T.et al.，Proc Natl Acad Sci USA96(5)，1886-91(1999))。但是，大多數現有的載體在細胞核中引起基因表達，因此表達的核酶的出核效率是很大障礙。

發明內容
本發明的一個目的是提供編碼具有催化活性的RNA的副粘病毒載體及其應用。
副粘病毒在其轉錄和複製過程中沒有DNA階段，並且它們的基因表達發生在細胞質。因此，本發明者考慮副粘病毒可能是潛在的適合核酶表達的載體。但是，副粘病毒載體在過去沒有被用於表達核酶，並且不清楚有活性的核酶是否可以在細胞內被轉錄並有功能。因此，為開發能表達有活性的核酶的副粘病毒載體，本發明者將編碼核酶的基因插入仙臺病毒(SeV)載體中，將該載體感染細胞，並評價效果。已知K-ras的突變頻率在結直腸癌中很高，將其選作靶點。Ras蛋白是參與細胞內信號轉導的G蛋白之一，用纈氨酸取代12位的胺基酸導致細胞癌變。以前已經報導許多實驗使用核酶靶向含有胺基酸12突變的區域(Funato，T.et al.，Cancer Gene Ther 7(3)，495-500(2000)；Tsuchida，T.et al.，Cancer Gene Ther 7(3)，373-83(2000)；Tsuchida，T.et al.，Biochem Biophys Res Commun 253(2)，368-73(1998)；Zhang，Y.A.et al.，Gene Ther 7(23)，2041-50(2000))。在本發明中，除了以前報導的K-ras核酶外，設計了帶有不同長度K-ras識別位點的核酶並觀察了它們的作用。發現通過感染編碼核酶的副粘病毒載體，細胞中K-ras的表達可以被明顯抑制。此外，與短的核酶相比，當核酶的長度為50個核苷酸或更長時，可明顯改善從該載體表達的核酶的活性。當核酶的長度為60個核苷酸或更長時，用該載體導入的核酶的活性得到進一步改善，當長度為70個核苷酸或更長時，活性更高。
因此，本發明首次利用副粘病毒載體成功地表達有活性的核酶，並證明，可以通過調節副粘病毒載體攜帶的核酶長度，改善從該載體表達的核酶的活性。副粘病毒感染發生在廣泛的組織中。因此，使用編碼核酶的副粘病毒載體，使得有可能直接在用傳統載體很難導入基因的那些組織和細胞中進行核酶基因治療。例如，通過使用本發明編碼核酶的副粘病毒載體抑制癌基因等的表達，可以對各種癌症進行基因治療。因此，表達核酶的副粘病毒載體可應用於各種臨床病例。
本發明涉及編碼核酶的副粘病毒載體及其應用。更詳細地，本發明涉及權利要求書中提出的每一發明。本發明也涉及權利要求所述一或多項(或全部)發明的所需組合，尤其是，本發明涉及引用相同獨立權利要求的從屬權利要求(涉及其它權利要求所述發明未能涵蓋的發明的權利要求)所述一或多項(或全部)發明的所需組合。每個獨立權利要求所述發明也打算包括從屬權利要求所述發明的任何組合。具體地，本發明包括(1)編碼具有催化活性的RNA的副粘病毒載體；(2)(1)的副粘病毒載體，其中RNA的長度是50個核苷酸或更長；(3)(1)的副粘病毒載體，其中RNA的長度是60個核苷酸或更長；(4)(1)-(3)的副粘病毒載體，其中RNA是錘頭型核酶；(5)(1)-(4)的副粘病毒載體，其中副粘病毒是仙臺病毒。
在本發明中，重組的病毒意思是經重組的多核苷酸產生的病毒。重組的多核苷酸是其結合已經被人工修飾(切割或連接)的多核苷酸。重組的多核苷酸不以天然方式結合。重組的多核苷酸可以通過本領域已知的基因重組的方法產生，其中基因重組通過聯合使用多核苷酸合成，核酸酶處理，連接酶處理，等等進行。重組蛋白可以通過表達編碼該蛋白的重組多核苷酸來產生。重組病毒的產生可以是，表達經基因操作構建的編碼病毒基因組的多核苷酸，然後重新組成病毒。「重組蛋白」包括經重組多核苷酸產生的蛋白，和人工合成的蛋白。
本發明中，「基因」指一種遺傳物質，一種編碼轉錄單位的核酸。基因可以是RNAs或DNAs。在本發明中，將編碼蛋白的核酸稱作該蛋白的基因。此外，編碼核酶的核酸稱作核酶的基因。基因可以是天然產生的或人工設計的序列。而且，在本發明中，「DNA」既包括單鏈的也包括雙鏈的DNAs。此外，「編碼蛋白或核酶」意思是包括核酸或核酶的多核苷酸，其編碼該蛋白的胺基酸序列或者核酶的正義或反義鏈，從而可以在適當條件下表達該蛋白。副粘病毒的基因在病毒基因組中以反義序列編碼。
本發明的副粘病毒載體實際編碼有催化活性的RNAs(核酶)。具體地，本發明的副粘病毒載體在其病毒基因組中3』-前導序列和5』-尾隨序列之間攜帶反義核酶RNA序列。
在本發明中，副粘病毒指屬於副粘病毒科的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一組基因組不分節段的負鏈RNA病毒，它們包括副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬(也稱作副粘病毒屬)，腮腺炎病毒屬，和麻疹病毒屬)，和肺病毒亞科(包括肺炎病毒和間質肺病毒)。應用於本發明的副粘病毒的具體例子是仙臺病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3。
本發明的病毒優選屬於副粘病毒亞科的那些或其衍生物，更優選屬於呼吸道病毒的種或其衍生物。可應用於本發明的呼吸道病毒種的病毒例子是人類副流感病毒-1(HPIV-1)，人類副流感病毒-3(HPIV-3)，牛副流感病毒-3(BPIV-3)，仙臺病毒(也稱作鼠副流感病毒-1)，和猴副流感病毒-10(SPIV-10)。本發明中最優選的副粘病毒是仙臺病毒。這些病毒可以源自天然株，野生株，突變株，實驗室傳代株，人工構建株，等等。
本發明中，「載體」是向細胞導入核酸的載體。副粘病毒載體是向細胞內導入核酸的源自副粘病毒的載體。副粘病毒例如上面描述的SeV是極好的基因轉移載體。由於副粘病毒只在宿主細胞的細胞質中完成轉錄和複製，並且它們沒有DNA階段，所以不發生染色體整合。因此，它們不會由於染色體異常(例如癌化或永生化)而引起安全問題。當使用副粘病毒作載體時該病毒的這一特點對其安全性起很大貢獻。當用於外源基因表達時，甚至在連續多次傳代後，SeV幾乎沒有任何核苷酸突變，表明其基因組的高度穩定性和插入的外源基因d長期穩定表達(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。SeV具有進一步的性質上的優點，例如對插入基因大小和對其包裝的適應性，因為它沒有衣殼結構蛋白。可複製的SeV載體可以導入大小至少4kb的基因，並且通過添加轉錄單位可同時表達2或3種基因。因此，可以從同一載體表達兩種或更多的核酶。
已知SeV對齧齒動物是致病的，引起肺炎，然而，它對人類是不致病的。這有以前的報導支持，其通過向非人類的靈長類鼻腔給予野生型SeV未表現出嚴重的不良效果(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15533-540，1997)。以下兩點，「高感染性」和「高表達水平」也應被認為是優勢。SeV載體通過結合細胞膜蛋白糖鏈或糖脂中的唾液酸而感染細胞。幾乎所有細胞都表達這種唾液酸，導致廣泛的感染譜，即高感染性。當基於SeV複製子的可複製載體釋放病毒時，這些病毒再感染相鄰的細胞，多核糖核蛋白(RNP)在感染細胞的細胞質中複製，並隨細胞分裂將其分配到子代細胞中，因此可以預期連續的表達。此外，SeV載體可以被用於非常廣泛的組織。而且，已經顯示，它們的轉錄和複製只發生在細胞質的特徵性表達機制以非常高的水平表達插入基因(Moriya，C.et al.，FEBS Lett.425(1)105-111(1998)；WO00/70070)。而且，已有人成功回收了通過刪除包膜基因而變得不可遺傳的SeV載體(WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。這樣一來，SeV載體被改善，以進一步增強它們的「安全性」，而保持它們的「高感染性」和「高表達水平」。
SeV的這些特徵支持包括SeV在內的副粘病毒載體用於基因治療和基因轉移的有效性，並且可能在體內或回體(ex vivo)核酶表達的基因治療中，SeV會成為一種有前途的選擇。通過向副粘病毒載體中插入用於治療(或分析)的編碼核酶的基因，並局部給予該載體，可以在局部高水平表達核酶基因，並可以預期明確的治療效果，同時減少副作用。這些作用被認為在能誘導插入基因的瞬時強表達的副粘病毒載體包括SeV，中更強。
副粘病毒載體包括副粘病毒基因組RNAs。基因組RNA指一種RNA，其有形成帶有副粘病毒蛋白的RNP的功能，以致基因組中的基因被表達成蛋白，並且核酸被複製以形成子代RNPs。副粘病毒是其基因組為單鏈負鏈RNA的病毒，並且這種RNAs以反義序列編碼基因。一般地，在副粘病毒基因組中，病毒基因在3』-前導區和5』-尾隨區之間以反義序列排列。在各自基因的ORFs之間是轉錄終止序列(E序列)-間插序列(I序列)-轉錄起始序列(S序列)，因此每個基因以單順反子轉錄。本發明的載體中基因組RNAs包含編碼N(核衣殼)-，P(phospho)-，和L(大)-蛋白的反義RNA序列，這些蛋白是RNA所編碼的基因群的表達和RNA自我複製所必需的病毒蛋白。RNAs也可以編碼病毒粒子形成所必需的M(基質)蛋白。此外，RNAs可以編碼病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。副粘病毒包膜蛋白包括引起細胞膜融合的F(融合)蛋白，和病毒粘附於細胞所必需的HN(血凝素-神經氨酸酶)蛋白。但是，HN蛋白並不是感染某些類型的細胞必需的(Markwell，M.A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)978-982(1985))，感染只由F蛋白完成。RNAs可以編碼除了F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋白。
本發明的副粘病毒載體可以是，例如，副粘病毒基因組RNAs和病毒蛋白的複合物，即，核糖核蛋白(RNPs)。例如，可以將RNPs與想要的轉染試劑一起導入細胞。具體地，該RNPs是包含副粘病毒基因組RNA，N蛋白，P蛋白，和L蛋白的複合物。當一種RNP導入細胞時，編碼病毒蛋白的順反子受病毒蛋白的作用從基因組RNA轉錄，而且同時，基因組本身被複製形成子代RNPs。基因組RNA的複製可以通過用RT-PCR，Northern印跡雜交等檢測RNA拷貝數的增加來確認。
進一步，本發明的副粘病毒載體優選是副粘病毒粒子。「病毒粒子」意思是包含受病毒蛋白作用從細胞釋放的核酸的微粒。副粘病毒粒子包含一些結構，其中上面描述的含有基因組RNA和病毒蛋白的RNP被包裹在起源於細胞膜的脂膜中。病毒粒子可以具有感染性。感染性指副粘病毒載體向病毒粒子粘附的細胞導入載體中核酸的能力，因為病毒粒子保留了細胞粘附和膜融合的能力。本發明的副粘病毒載體可以是可複製的或複製缺陷的載體。「可複製的」意思是當將病毒載體導入宿主細胞時，病毒可在細胞內自我複製以產生有感染力的病毒粒子。
副粘病毒亞科的各種病毒的基因通常表示如下。NP基因通常也描述為「N基因」。
副粘病毒屬(Paramyxovirus)NP P/C/V M F HN -L腮腺炎病毒屬(Rublavirus)NP P/VM F HN (SH) L麻疹(Morbillivirus)屬NP P/C/V M F H -L例如，每種仙臺病毒基因核苷酸序列的資料庫登錄號如下對於N基因為M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，和X17218；對於P基因為M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，和X17008；對於M基因為D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，和X53056；對於F基因為D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，和X02131；對於HN基因為D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，和X56131；和對於L基因為D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，和X58886。
這些病毒蛋白的ORFs以上面描述的E-I-S順序在基因組RNA中排列為反義序列。離基因組RNAs 3』-端最近的ORF只需要位於3』-前導區和該ORF之間的S序列，不需要E或I序列。而且，離ORF基因組RNA 5』-端最近的ORF只需要位於5』-尾隨區和該ORF之間的E序列，不需要I或S序列。而且，這兩個ORFs可以以單順反子轉錄，例如通過使用內部核糖體進入位點(IRES)序列進行轉錄。在這種情況下，這兩個ORFs之間不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因組包括3』-前導區，編碼N，P，M，F，HN，和L蛋白的六個ORF(其以反義方式並按照該順序排列)，和另一末端的5』-尾隨區。在本發明的基因組RNAs中，就野生型病毒來說，優選在3』-前導區之後和5』-尾隨區之前，順次排列編碼N，P，M，F，HN，和L蛋白的ORF；但是基因排列不限於此。某些類型的副粘病毒不包括全部這六種病毒基因，即使在這種情況下，優選每種基因按照上面描述的野生型的方式排列。一般地，保留N，P，和L基因的載體能夠在細胞內從RNA基因組自主表達基因，複製基因組RNA。而且，通過編碼包膜蛋白的F和HN基因以及M基因的作用，可形成有感染力的病毒粒子並釋放到細胞外。因此，該載體成為可複製的病毒載體。可以按照如下描述將編碼核酶的基因插入此基因組3』-前導區和5』-尾隨區之間的非蛋白編碼區。
進一步，本發明的副粘病毒載體可以缺失任何野生型副粘病毒基因。例如，滅活或缺失M，F，或HN基因或其任何組合的副粘病毒載體，可被優選用做本發明的副粘病毒載體。例如，可通過外部添加缺失基因的產物來重建該病毒載體。如此製備的病毒載體象野生型病毒一樣粘附於宿主細胞引起細胞融合，但是由於導入細胞的載體基因組缺失病毒基因，它們不能形成具有與原始載體相同感染力的子代病毒粒子。因此，該載體作為只能導入一次基因的安全病毒載體是有用的。基因組中可以缺失的基因的例子是F基因，HN基因，M基因，和它們兩者或三者的任意組合。例如，重建病毒載體可以通過用以下物質轉染宿主細胞完成表達缺失F基因的重組副粘病毒載體基因組的質粒，連同F蛋白表達載體和NP，P，和L蛋白的表達載體(WO00/70055，WO00/70070，WO03/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。例如，也可以用在其染色體中組合了F基因的宿主細胞產生病毒。當外部添加這些蛋白時，它們的胺基酸序列不必與病毒序列相同，並且可以將另一種病毒的突變或同源基因用作替代，只要它們與天然類型相比，核酸導入活性相同或更高。
進一步，可以將包含提供載體基因組的病毒的包膜蛋白而非其它蛋白的載體製備為本發明的病毒載體。例如，當重建病毒時，可以通過表達並非基礎病毒基因組編碼的原始包膜蛋白的另一種包膜蛋白，來產生包含目的包膜蛋白的病毒載體。對這種蛋白無特別限制，包括其它病毒的包膜蛋白，如水皰性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。因此，本發明的病毒載體包括帶有如VSV-G等源自與提供載體基因組的病毒不同的病毒的包膜蛋白的假型病毒載體。通過設計病毒載體使這些包膜蛋白不由RNA基因組編碼，可以使所述蛋白在病毒粒子感染細胞後不再表達。
而且，本發明的病毒載體可以是，例如在包膜表面帶有可粘附於特殊細胞的蛋白的載體，這種蛋白例如粘附因子，配體，受體，抗體，或它們的片段；或者包含嵌合蛋白的載體，該嵌合蛋白在胞外區帶有上述蛋白，在胞內區帶有源自病毒包膜的多肽。因此，也可以產生靶向特殊組織的載體。這種蛋白可以由病毒基因組編碼，或可以是在病毒載體重建時表達除了病毒基因組以外的其它基因(例如，其它表達載體或存在於宿主染色體上的基因)來提供。
進一步，本發明的載體中，包含在載體中的任何病毒基因可以是從野生型基因修飾而得的，目的是例如減少病毒蛋白引起的免疫原性，或增強RNA轉錄或複製的效率。具體地，例如，在副粘病毒載體中，修飾N，P，和L基因中至少一個(它們是複製因子)，被認為可增強轉錄或複製的功能。此外，作為包膜蛋白的HN蛋白既包含血凝素活性也包含神經氨酸酶活性，但是，例如減弱前一活性可能改善病毒在血液中的穩定性，修飾後一活性可以控制感染性。此外，通過修飾F蛋白也可能控制膜融合能力。例如，可以分析可作為細胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，並利用這點，可以製備降低了這些蛋白抗原性的病毒載體。
而且，本發明的載體可以缺失附屬基因。例如，通過敲除SeV附屬基因之一的V基因，SeV對宿主例如小鼠的致病性明顯降低，而不妨礙在培養細胞中的基因表達和複製(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.et al.，WO01/04272，EP1067179)。這種減毒的載體作為體內或回體基因轉移的非毒性病毒載體是特別有用的。
本發明的載體在上面描述的副粘病毒載體基因組中含有編碼核酶的RNAs。這裡，「核酶」指一種有催化活性的RNA(T.R.Cech et al.，Cell，27487-496(1981)；Koizumi M.and Otsuka E.，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，Enzyme)，352191(1990))。催化活性不限於並可包括例如，RNA或DNA鏈的切割和連接，模板依賴的RNA複製，RNA氨醯化，胺基酸從tRNA向5』羥基轉移，自身磷酸化，核苷合成，和肽鍵的形成。特別重要的活性是RNA-切割活性。在本發明中，載體可以攜帶任何核酶，這種核酶包括例如錘頭型核酶，髮夾型核酶，丁型肝炎病毒核酶，核糖核酸酶P的RNA亞基，第一類和第二類內含子，和它們的改變的形式。這裡，「改變」指在核酸序列中取代，刪除，或添加一個或多個核苷。有傳統的方法用於獲得更高活性的改變的核酶，其中通過體外進化系統將天然核酶改變(Joyce，Selective Amplification Techniques for Optimization of RibozymeFunction.in「Antisense RNA and DNA」，pp.353-372(1992)Wiley-Liss Inc.)。核酶可以以二聚體發揮功能。
在本發明中，錘頭型核酶和髮夾型核酶是特別優選由載體攜帶的核酶。天然的錘頭型核酶已經從類病毒等中分離了(J.M.Buzayan et al.，Nature，323349-353(1986)；G.A.Prody et al.，Science，2311577-1580(1986))。錘頭型核酶具有包括三個環和三個螺旋的錘頭狀結構，並且最初以順式起作用，但是當有催化活性的RNA部分同靶RNA分離時可以以反式起作用。該核酶可以包括例如，一個環和一個螺旋，並與靶序列形成假環(Turner，P.C.，TheBiochemistry of the Hammerhead Ribozyme.InScanlon，KJ.，andKashani-Sabet，M.ed.「Ribozymes in the Gene Tarapy of Cancer(MedicalIntelligence UNIT4)」，R.G.Landes Company，3-14(1998))。錘頭型核酶的結構已經被很好地分析了。菸草環斑病毒的核酶特異地切割核苷序列NUH的3』末端(N是A，G，C或U；H是A，C或U)(M.Koizumi et al.，FEBS Lett.228225(1988))。因此，可以製備在目的靶RNA序列中特異切割包括UC，UU，或UA的位點的核酶(M.Koizumi et al.，FEBS Lett.239285(1988)；Koizumi M.and Otsuka E.，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，Enzyme)，352191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.177059(1989))。
此外，也可用髮夾型核酶來達到本發明的目的。髮夾型核酶存在例如，菸草環斑病毒的衛星RNA的負鏈中(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。也可以設計這種核酶來完成靶特異的RNA切割(Y.Kikuchi and N.Sasaki，Nucleic Acids Res.196751(1992)；Y.Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemistryand Biology)30112(1992))。
在本發明中，載體攜帶的核酶的長度優選50個核苷酸或更長，較優選55個核苷酸或更長，甚至更優選60個核苷酸或更長，還更優選65個核苷酸或更長，也更優選70個核苷酸或更長，也還更優選75個核苷酸或更長。「核酶的長度」指從載體轉錄的核酶RNA分子的核苷酸數目。如果核酶太短，優選通過增加靶識別序列的大小來增加其長度。例如，本發明的優點之一是即使核酶長度是45個核苷酸或更少，或40個核苷酸或更少，通過調節靶識別序列的長度，可以以高活性從副粘病毒載體表達有活性的核酶。
一般地，有RNA切割活性的核酶包含催化活性所必需的序列和靶RNA識別所需的序列。錘頭型核酶催化活性需要的序列包括但不局限於，例如，5′-1C2U3G4A5N6G7A8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20G21A22A23A24N-3′(SEQ ID NO38)(其中N代表G，A，U，或C；將5』-8N9N10N11N-3』和5』-16N17N18N19N-3』設計為相互互補以允許鹼基配對)。12N13N14N15N四個核苷酸優選形成環。除了四個核苷酸，核苷酸的數目可以從大約2個到7個核苷酸(即N2-7)，例如，3到5個核苷酸(即N3-5)，23A24N與靶識別序列重疊。24N是與上面描述的靶位點NUH的N互補的核苷酸。更具體的序列如實施例中所示。將靶識別序列附在兩端。具體地，靶識別序列指包括與靶RNA互補序列的部分。在本發明中，核酶靶識別位點的長度優選20個核苷酸或更長，較優選25個核苷酸或更長，甚至更優選30個核苷酸或更長，還更優選35個核苷酸或更長，還更優選40個核苷酸或更長，也還更優選45個核苷酸或更長。當靶識別位點被分成不連續的序列段時，長度相當於各個核苷酸的總數。例如，錘頭型核酶的靶識別位點一般在核酶RNA的兩端，因此長度相當於在這兩端與靶RNA互補的核苷酸總數。優選在每端加入與靶RNA互補的序列，其包含至少連續的7個核苷酸，優選連續8個核苷酸或更多，更優選連續9個核苷酸或更多，甚至更優選連續10個核苷酸或更多，也更優選連續12個核苷酸或更多，也還更優選連續15個核苷酸或更多。
例如，可以將編碼核酶的核酸插入基因組中3』-前導區和5』-尾隨區之間非蛋白編碼區的任何想要位置。例如，可以將上面的核酸插入3』-前導區和與3』-端最近的病毒蛋白ORF之間；每個病毒蛋白ORFs之間；和/或離5』-端最近的病毒蛋白ORF和5』-尾隨區之間。此外，在缺失F或HN基因等的基因組中，可以將編碼核酶的核酸插入那些缺失區。當向副粘病毒導入外源基因時，希望插入基因使被插入的基因組多核苷酸鏈的長度是六的倍數(Journal of Virology，Vol.67，No.8，4822-4830，1993)。應該將E-I-S序列排列在插入的外源基因和病毒蛋白ORF之間。可以將編碼核酶的兩個或多個核苷酸經E-I-S序列串聯插入。或者，可以將目的基因通過IRES(內在的核糖體進入位點)插入。
可以通過在基因上遊(負鏈的3』-端)添加轉錄起始序列的方式控制載體攜帶的核酶的表達水平(WO01/18223)。表達水平也可以受編碼核酶的外源基因插入到基因組的部位控制插入部位離負鏈的3』-端越近，表達水平越高；離5』-端越近，表達水平越低。因此，為獲得想要的基因表達水平，可以適當控制外源基因的插入部位，因而在外源基因前或後聯接編碼病毒蛋白的基因是最合適的。一般地，由於認為核酶的高表達水平是有利的，所以優選將編碼核酶的基因與高效轉錄起始序列連接，並將其插入基因組負鏈的3』-端附近。具體地，將外源基因插入到3』-前導區和離3』-端最近的病毒蛋白ORF之間。或者，可以將外源基因插入離3』-端最近的和第二近的病毒蛋白ORF之間，或離3』-端第二近的和第三近的病毒蛋白基因之間。在一般的副粘病毒中，離基因組的3』-端最近的病毒蛋白基因是N基因，第二近的基因是P基因，第三近的基因是M基因。或者，當不希望導入的基因高水平表達時，可以抑制從病毒載體的基因表達水平以獲得適當的效果，例如，通過將外源基因插入載體中離負鏈的5』-端儘可能近的位點，或通過選擇效率低的轉錄起始序列。
在副粘病毒基因組中將編碼核酶的RNA排列並與S序列和E序列側面相鄰。當核酶從載體轉錄時，從S序列起動轉錄並在E序列終止。因此核酶轉錄物在對核酶活性原始必需的序列的每端含有額外序列。通過向副粘病毒載體插入編碼核酶的核酸而添加的這些額外序列，在這裡被稱作「間隔子」。具體地，間隔子是附著在從副粘病毒載體轉錄的核酶兩端的序列並且不參與核酶的靶識別和催化活性(然而，這不包括附加在3』端的poly(A)尾)。間隔子包括S序列和E序列部分，和用於向載體中插入核酶的連接序列。如實施例中所描述的，甚至當將間隔子附加在核酶末端時，核酶仍保持它的活性。在核酶末端間隔子的總長度可以是10個核苷酸或更長，當核酶較長時，長度可以是20個核苷酸或更長，當核酶再長時，長度可以是25個核苷酸或更長，當核酶更長時，長度可以是30個核苷酸或更長，當核酶還長時，長度可以是35個核苷酸或更長(poly(A)尾不包括在總長度的計算中)。但是，在核酶兩端間隔子的總長度是100個核苷酸或以下，優選80個核苷酸或以下，更優選70個核苷酸或以下，還更優選60個核苷酸或以下，也更優選50個核苷酸或以下。在每端間隔子的長度優選每個50個核苷酸或以下。
例如，當編碼核酶的核酸被插入到基因組時，可以將想要的副粘病毒S序列用作附加的S序列。當載體是仙臺病毒載體時，可優選使用序列3′-UCCCWVUUWC-5′(W＝A或C；V＝A，C，或G)(SEQ ID NO1)。特別優選的序列是3′-UCCCAGUUUC-5′(SEQ ID NO2)，3′-UCCCACUUAC-5′(SEQ ID NO3)，和3′-UCCCACUUUC-5′(SEQ ID NO4)。當表示為編碼正鏈的DNA序列時，這些序列是5′-AGGGTCAAAG-3′(SEQ ID NO5)，5′-AGGGTGAATG-3′(SEQ ID NO6)，和5′-AGGGTGAAAG-3′(SEQ ID NO7)。優選的仙臺病毒載體的E序列是，例如，3′-AUUCUUUUU-5′(SEQ ID NO8)(對編碼正鏈的DNA為5′-TAAGAAAAA-3′(SEQ ID NO9))。I序列可以包括例如，任何三個核苷酸，特別是3』-GAA-5』(在正鏈DNA中為5』-CTT-3』)。
可以通過將載體轉染細胞從本發明的載體上轉錄核酶。例如，當在細胞中表達編碼切割基因轉錄物活性的核酶時，載體感染細胞可以抑制靶基因的表達。當它們感染的細胞表達靶基因在MOI＝10，與不編碼核酶的對照載體相比為相同的MOI時，本發明的載體其編碼有切割靶基因轉錄物活性的核酶，具有降低靶基因表達水平的能力優選70％或更低，更優選75％或更低，也更優選60％或更低。
可以將本發明的載體用作可以體內給藥的治療性病毒載體。由於不整合入宿主染色體，因此本發明的載體是安全的。因為載體一般允許核酶的表達從幾天到幾周或更長，所以它們是適合於各種疾病或異常的治療。為治療目的，本發明載體的局部給藥可以導致體內局部核酶過表達(臨床應用)。特別地，核酶是癌症基因治療的潛在的有用工具(H.Kijima et al.，Pharmac.Ther.，68247-267(1995)；A.Irie et al.，Int.J.Urol.，4329-337(1997))。除了用於癌症的治療，可以看到核酶的各種應用。例如，用編碼核酶的本發明載體的基因治療可被用於預防和治療感染性疾病，包括AIDS(Rossi，J.J.，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(3)316-22(1999)；Lewin，A.S.andHauswirth，W.W.，Trends Mol.Med.，7(5)221-8(2001)；Gaughan，D.J.et al.，Biochim.Biophys.Acta，1445(1)1-20(1999))。
為製備本發明的載體，在包含副粘病毒基因組RNA的RNP重建必需的病毒蛋白(即，N，P，和L蛋白)存在情況下，將編碼本發明副粘病毒基因組RNA的cDNA在哺乳動物細胞中轉錄。可以通過或者負鏈(也稱作負鏈，以相同的反義鏈作為病毒基因組)基因組或者正鏈(也稱作正鏈，正義鏈編碼病毒蛋白)基因組將病毒RNP重建。正鏈的產生對提高載體重建的效率是更好的。RNA末端優選表現3』-前導區和5』-尾隨區序列的末端儘可能準確，象在天然的病毒基因組中一樣。為準確調節轉錄物的5』-末端，例如，可以用T7RNA聚合酶識別序列作為轉錄起始位點在細胞內表達RNA聚合酶。而且，將轉錄物的3』-端經自身切割而準確切斷(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16578-587(1997)；andYu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997))。
例如，按照文獻中描述Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16578-587(1997)；Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997)，等等，可以將攜帶核酶的重組仙臺病毒載體如下重建。
首先，合成編碼核酶的cDNA以使在兩端有用於克隆的限制性位點。合成的DNA應當含有E-I-S序列，使E-I-S序列位於病毒基因組中插入的核酶和側翼病毒基因的ORFs之間。如此設計合成DNA使它在插入載體時大小(核苷酸數目)為6的倍數(所謂的「六的規則」；Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72891-899(1998)；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830(1993)；Calain，P.and R0ux，L.，J.Virol.674822-4830(1993))。象E-I-S序列，例如，仙臺病毒負鏈的S，I，和E序列，優選分別將序列5′-CTTTCACCCT-3′(SEQID NO10)，5′-AAG-3′，和5′-TTTTTCTTACTACGG-3′(SEQ ID NO11)置於寡DNA插入片段的3』端。將此片段插入編碼病毒基因組的cDNA中。例如，將片段插入基因組中編碼病毒蛋白的ORFs和上遊S序列之間，以使E-I-S序列一個接一個地放置在核酶每端的病毒蛋白基因的ORFs之間。
例如，可以通過以前報導中描述的方法構建重組仙臺病毒基因組的cDNA(Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997)；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997))。例如，合成雙鏈DNA以具有粘在核酶正義鏈3』端E-I-S序列。將DNA立即插入編碼基因組正義鏈cDNA中目的S序列的3』端。例如，編碼基因組正鏈的cDNA中，首先將限制性位點放在編碼目的病毒蛋白基因和參與基因轉錄的S序列之間。然後可以將編碼核酶-E-I-S序列的DNA插入限制性位點(Tokusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))。特別地，例如，通過在有P和M基因作側翼的S序列和M基因的ORF之間插入序列可以達到高效病毒產生。
本發明載體的構建可以通過在細胞內存在上述病毒蛋白(L，P和N)的情況下，轉錄如此製備的編碼重組副粘病毒基因組RNA的DNA。為產生本發明的載體，本發明提供編碼發明載體病毒基因組RNAs的DNAs。為本發明載體的產生應用，本發明也涉及編碼載體基因組RNAs的DNAs的應用。可以按照本領域已知的方法重建重組的病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，Virology 235323-332(1997)；Whelan，S.P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392(1995)；Schnell.M.J.et al.，EMBO J.134195-4203(1994)；Radecke，F.et al.，EMBO J.145773-5784(1995)；Lawson，N.D.et al.，Proe.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，EMBOJ.146087-6094(1995)；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996)；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virol.711265-1271(1997)；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404(1996))。用這些方法，可以從DNA重建負鏈RNA病毒其包括副流感病毒，皰疹性口腔炎病毒，病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒，和仙臺病毒。按照這些方法可以重建本發明的載體。當病毒載體DNA有F基因，HN基因，和/或M基因缺失時，這些DNAs不形成有感染性的病毒粒子。但是，通過獨立向宿主細胞導入這些缺失的基因，和/或編碼其它病毒包膜蛋白的基因，並然後在那裡表達這些基因，可能形成有感染性的病毒粒子。
具體地，製備病毒的步驟如下(a)在表達N，P，和L蛋白的細胞中，轉錄編碼副粘病毒基因組RNAs(負鏈RNAs)的cDNAs，或它們的互補鏈(正鏈)；和(b)從這些細胞或從它們的培養上清中收穫包含基因組RNAs的複合物。對於轉錄，將編碼基因組RNA的DNA連接在適當啟動子的下遊。因此轉錄的基因組RNA在存在N，L，和P蛋白的情況下被複製以形成RNP複合物。然後，在存在M，HN，和F蛋白情況下，形成包裹在包膜中的病毒粒子。例如，編碼基因組RNA的DNA可以被連接在T7啟動子的下遊，並由T7 RNA聚合酶轉錄成RNA。除了包括T7聚合酶識別序列的那些，可以使用任何想要的啟動子作為啟動子。或者，可以將體外轉錄的RNA轉染細胞。
對從DNA的基因組RNA起始轉錄必需的酶，例如T7 RNA聚合酶，可以通過轉導表達它們的質粒或病毒載體來添加，或例如，通過將它的基因整合入細胞的染色體以能誘導它們的表達，並然後在病毒重建時誘導表達。此外，提供載體重建所必需的基因組RNA和病毒蛋白，例如，通過轉導表達它們的質粒。在提供這些病毒蛋白時，可以使用輔助病毒例如野生型或某些突變型副粘病毒，但是這可能導致這些病毒的汙染，因此不優選。
向細胞導入表達基因組RNA的DNAs的方法包括，例如，(i)製備靶細胞可內在化的DNA沉澱的方法；(ii)製備包含適合被靶細胞內在化的DNAs，和包括低細胞毒陽性電荷特徵的複合物的方法；和(iii)用電脈衝在靶細胞膜上瞬時打穿足以讓DNA分子通過的孔的方法。
對於(ii)，可以使用各種轉染試劑。例如，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，並且可使用這些。對於(i)，例如，可以使用磷酸鈣的轉染方法，而且儘管用此方法轉入細胞中的DNAs被吞噬體內在化，但已知有足夠量的DNA進入細胞核(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.，Virology 52456(1973)；Wigler，M.andSilverstein，S.，Cell 11223(1977))。Chen和Okayama研究轉染技術的最優化，報導(1)細胞和共沉澱的保溫條件為2～4％CO2，35℃，和15～24h，(2)環狀DNA的活性高於線性DNA，和(3)當在沉澱混合物中DNA的濃度為20～30μg/ml時獲得最佳沉澱(Chen，C.and Okayama，H.，Mol.Cell.Biol.72745(1987))。(ii)的方法適合於瞬時轉染。通過製備DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×105)混合物與目的DNA的濃度比例進行轉染的方法已經清楚。因為大多數複合物在內體中被分解，所以也可以添加氯喹以增強效果(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015(1983))。(iii)的方法被稱作電穿孔方法，因為不是細胞選擇性的，所以比方法(i)和(ii)應用更普遍。在最理想的條件下設想這些方法的效率好電流脈衝的持續時間，脈衝的波形，電場強度(電極間距離，電壓)，緩衝液的傳導率，DNA濃度，和細胞密度。
上述三條，(ii)的方法簡單易於操作並能用大量細胞檢測許多樣品，因此轉染試劑適合於載體重建的DNA導入細胞。優選地，使用SuperfectTransfection Reagent(QIAGEN，Cat No.301305)，或DOSPER LiposomalTransfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)，但是轉染試劑不限於這些。
具體地，從cDNA進行重建可按如下進行在24孔或6孔塑料板或100-mm petri平板中的極限必需培養基(MEM)中培養猴腎細胞系LLC-MK2至100％鋪滿，所述培養基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100單位/ml青黴素G和100μg/ml鏈黴素)。用在有1μg/ml補骨脂素存在的條件下，於UV中暴露20分鐘進行滅活後的表達T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3以2pfu/細胞的量感染上述細胞(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126(1986)；Kato，A.et al.，GenesCells 1569-579(1996))。可以適當調整補骨脂素的量和紫外線照射的時間。對細胞進行轉染，其方法例如是，用Superfect(QIAGEN)、將2-60μg(最好是3-20μg)編碼上述重組仙臺病毒基因組RNA的DNA、以及表達病毒RNP生成所需的、起反式作用的病毒蛋白的質粒(0.5-24μg pGEM-N，0.25-12μgpGEM-P，和0.5-24μg pGEM-L)(Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996))進行脂轉染。編碼N、P和L蛋白的表達載體的量，優選是2∶1∶2的比例，而質粒的量經過適當調整後，可以是例如，1-4μg pGEM-N，0.5-2μg pGEM-P，和1-4μg pGEM-L。
有時可能需要將轉染的細胞培養在含有100μg/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)的無血清MEM中，更優選僅40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)。為使痘苗病毒的細胞毒活性最小而回收的病毒最多，可將藥物濃度調整至最佳(Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996))。轉染後將細胞培養48-72小時，然後收集並通過三輪凍融而裂解。將含有RNP的裂解物再感染LLC-MK2細胞，並將細胞培養。或者，收集培養上清，加入LLC-MK2細胞的培養液中以感染細胞，然後培養。例如可以通過與脂轉染胺，聚陽離子脂質體等形成複合物，並將複合物轉導入細胞進行轉染。具體地，可以使用各種轉染試劑。例如，可以使用DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Roche#1811169)。為防止在內體中分解，也可以加入氯喹(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015(1983))。在轉導了RNP的細胞中，病毒基因從RNP表達，RNP複製，載體擴增。通過將如此獲得的病毒溶液(培養上清)適當稀釋，然後重複擴增，可以將痘苗病毒vTF7-3完全消除。擴增可以重複，例如，三次或更多。可以將因此獲得的載體貯存在-80℃。為重建因缺失編碼包膜蛋白的基因而沒有複製能力的病毒載體，可以用表達包膜蛋白的LLC-MK2細胞轉染，或可以共轉染表達包膜蛋白的質粒。或者，包膜基因缺失型病毒載體的擴增可以通過培養用表達包膜蛋白的LLC-MK2細胞覆蓋的轉染的細胞進行(參見WO00/70055和WO00/70070)。
例如，可以通過測定CIU(細胞感染單位)或血細胞凝集活性(HA)來判斷獲得的病毒滴度(WO00/70070；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996)；Yonemitsu，Y. Kaneda，Y.，Hemaggulutinating Virus ofJapan-liposome-mediated gene deliVery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306(1999))。攜帶GFP(綠色螢光蛋白)等標誌基因的載體滴度的定量可以通過使用標誌作為指標(例如GFP-CIU)直接計數感染的細胞。可以將如此獲得的滴度用與CIU同樣方式處理(WO00/70070)。
只要能夠重建病毒載體，重建中使用的宿主細胞沒有特別限制。例如，仙臺病毒載體等的重建中，培養的細胞可以使用例如LLC-MK2細胞，源於猴腎的CV-1細胞，和源於倉鼠腎的BHK細胞，和源於人的細胞。通過在這些細胞中表達適當的包膜蛋白，也可以獲得有包膜的感染性病毒粒子。此外，為獲得大量仙臺病毒載體，可以將從上述宿主獲得的病毒載體感染受孕的雞卵以擴增載體。已經建立了使用雞卵產生病毒載體的方法(Nakanishi，et al.，ed.，「State-of-the-Art Technology Protocol in NeuroscienceResearch III，Molecular Neuron Physiology」，Koseisha，Osaka，pp.153-172(1993))。例如，具體是將受精卵在37-38℃孵化器中培養9-12天(例如3天)以形成胚。將病毒載體接種尿囊腔，然後將該受精卵接著培養數日以便繁殖病毒載體。可根據所用的重組仙臺病毒類型的不同而改變諸如培養時間等條件。然後，收穫含有載體的尿囊液。用常規方法從尿囊液樣品中分離和純化仙臺病毒載體(Tashiro，M.，「Virus Experiment Protocol」，Nagai，Ishihama，ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp.68-73(1995))。
例如，可以按如下描述進行缺失F蛋白的仙臺病毒載體的重構和製備(見WO00/70055和WO00/70070)1重建F缺失的仙臺病毒的基因組cDNA，和表達F基因的質粒將仙臺病毒(SeV)全長基因組cDNA，pSeV18+b的cDNA(+)(Hasan，M.K.et al.，J.General Virology 782813-2820(1997))(「pSeV18+b(+)」也被稱作「pSeV18+」)用SphI/KpnI消化以收穫片段(14673bp)，其被克隆到pUC18以製備質粒pUC18/KS。在此pUC18/KS上進行F缺失位點的構建。通過聯合使用PCR-連接方法製造F基因缺失，結果F基因ORF(ATG-TGA＝1698bp)被刪除。然後，例如，將atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO12)連接以構建F缺失型SeV基因組cDNA(pSeV18+/ΔF)。使用引物對[正向5』-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO13，反向5』-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO14]的PCR所形成的PCR產物連接到EcoT22I中F的上遊，用引物對[正向5』-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO15，反向5』-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO16]形成的PCR產物連接到F基因的下遊。將因此獲得的質粒用SacI和SalI消化以獲得包含F缺失位點的4931 bp片段部分，其被克隆到pUC18以形成pUC18/dFSS。將此pUC18/dFSS用DraIII消化，將片段回收，用pSeV18+包含F基因區域替換，並連接以獲得質粒pSeV18+/ΔF。例如，將外源基因插入pUC18/dFSS的F缺失位點中NsiI和NgoMIV限制酶位點。
2誘導SeV-F蛋白表達的輔助細胞的製備為構建表達仙臺病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP誘導型表達質粒，將SeV-F基因用PCR擴增，並插入質粒pCALNdlw的唯一的SwaI位點(Arai，T.et al.，J.Virology 72，p1115-1121(1998))，其中該質粒經過設計，使得有可能通過Cre DNA重組酶進行基因產物的誘導型表達，並因此構建質粒pCALNdLw/F。
為從F缺失的基因組回收有感染力的病毒粒子，建立表達SeV-F蛋白的輔助細胞系。例如可以使用通常被用於SeV增殖的猴腎源的LLC-MK2細胞系作為細胞。將LLC-MK2細胞在添加了10％熱滅活的胎牛血清(FBS)，青黴素G鈉(50單位/ml)，和鏈黴素(50μg/ml)的MEM中，於37℃，5％CO2培養。由於SeV-F基因產物是細胞毒的，按照本領域熟知的方法，使用磷酸鈣法用上述質粒pCALNdLw/F轉染LLC-MK2細胞，進行基因轉導，其中質粒經過設計，使得有可能通過Cre DNA重組酶進行基因產物的誘導性表達。
將質粒pCALNdLw/F(10μg)轉導入已經在10cm平皿中生長至40％匯合的LLC-MK2細胞，然後將細胞在含10％FBS的MEM(10ml)中，在5％CO2培養箱中於37℃培養24小時。24小時後，將細胞分散並在培養基(10ml)中重懸。然後將懸液接種在5個10-cm平皿中，一個平皿5ml，兩個平皿2ml，兩個平皿0.2ml，並培養在含有G418(GIBCO-BRL)(1200μg/ml)和10％FBS的MEM中。將細胞培養14天，每兩天更換一次培養基，以選擇基因穩定轉導的細胞系。用克隆環將從上述培養基中生長的表現出對G418抵抗的細胞回收。如此回收的每個克隆的培養繼續在10-cm平皿中直至匯合。
細胞在6-cm平皿中生長至匯合後，按照Saito等的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121(1998))，例如用腺病毒AxCANCre在MOI＝3時感染細胞來誘導F蛋白表達。
3F缺失的仙臺病毒(SeV)的重建和擴增將其中已經插入外源基因的上述質粒pSeV18+/ΔF按照如下轉染LLC-MK2細胞。將LLC-MK2細胞以5×106細胞/平皿接種於100-mm平皿中。當基因組RNA轉錄用T7RNA聚合酶完成時，將細胞培養24小時，然後在MOI約為2時，用表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒於室溫感染1小時，其中痘苗病毒已經用補骨脂素和長波紫外線(365nm)處理20分鐘(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))。對於痘苗病毒的紫外線照射，例如，可以使用裝有五個15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400(目錄號400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)。將細胞用無血清MEM洗滌，然後使用適當的脂轉染試劑轉染細胞，轉染用表達基因組RNA的質粒，和分別表達副粘病毒N，P，L，F，和HN蛋白的表達質粒。儘管沒有額外限制，按照該順序，這些質粒的量的比例可以優選設為6∶2∶1∶2∶2∶2。例如，轉染基因組RNA表達質粒以及表達N，P，L，F，和HN蛋白的表達質粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))的量的比例分別為每平皿12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg。培養幾小時後，將細胞用無血清MEM洗滌兩次，培養在含有40μg/ml的呋喃阿糖胞苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中。回收這些細胞，並將沉澱重懸在Opti-MEM中(107細胞/ml)。將懸液凍融三次，與脂轉染試劑DOSPER(Boehringer Mannheim)混合(106細胞/25μl DOSPER)，室溫放置15分鐘，轉染上述克隆的表達F的輔助細胞(12孔板，106細胞/孔)，並培養在無血清MEM(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰酶)中以回收上清。也可通過與此相同的方法製備缺失除了F以外的其它基因，例如HN基因或M基因的病毒。
在製備缺失型病毒載體時，如將在其載體基因組中缺失了不同包膜基因的兩種不同病毒載體轉染至相同細胞中，每種缺失的包膜蛋白可以通過另一載體的表達來提供。因此，這些載體合起來彌補了蛋白缺失，且可以形成有感染力的病毒粒子。結果是，複製周期可擴增病毒載體。換言之，可以將本發明的兩種或更多種病毒載體同時混合接種，使它們相互補充，從而以較低的成本生產出各種包膜缺陷型病毒載體的大量混合物。當與不缺失病毒基因的載體對比時，由於這些包膜基因缺陷的病毒具有較小的基因組，它們允許插入較長的外源基因。此外，這些由於缺失病毒基因而喪失增殖能力的病毒最終減毒，很難維持共感染狀態，因此它們不會產生後代，對環境的損害也較小。
當向個體或細胞給予可複製的副粘病毒載體後，由於治療完成必須限制病毒載體的增殖，因此也可能通過給予RNA依賴的RNA聚合酶抑制劑，特別地只限制病毒載體的增殖，對宿主無損傷。
按照本發明的方法，可以將本發明的病毒載體釋放到產生病毒的細胞的培養基中，例如，以1×105CIU/ml或更高的滴度，優選1×106CIU/ml或更高，更優選5×106CIU/ml或更高，更優選1×107CIU/ml或更高，更優選5×107CIU/ml或更高，更優選1×108CIU/ml或更高，更優選5×108CIU/ml或更高。可以按照這裡和其它描述的方法(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)測定病毒滴度。
收集的副粘病毒可以通過精製純化使其基本純。純化可以用已知的純化/分離方法進行，如過濾、離心分離和柱純化，或它們的組合。術語「基本純」是指在病毒載體以一種成分存在的樣品中病毒載體佔主要部分。一般地，真正純的病毒載體可以通過確認來自病毒載體的蛋白比例而鑑定，例如，在樣品中佔全部蛋白的10％或以上，優選20％或以上，優選50％或以上，優選70％或以上，更優選80％或以上，更優選90％或以上(但是，除了被當作載體、穩定劑等而加入的蛋白外)。特異於副粘病毒的純化方法有，利用硫酸纖維素或交聯的多糖硫酸酯進行的方法(特公昭62-30752號公報、特公昭62-33879號公報和特公昭62-30753號公報)，以及包括允許含巖藻糖硫酸的多糖和/或其降解產物吸附病毒的方法(WO97/32010)。
在製備含有載體的組合物時，可以按需要將載體與所需藥用載體或賦形劑混合。「藥用載體或賦形劑」意思是可以與載體一起給藥、但不明顯抑制載體的基因轉導的物質。例如，可以將載體用生理鹽水或磷酸鹽緩衝液(PBS)適當稀釋以形成組合物。當載體在雞卵等中生長時，「藥用載體或賦形劑」可以包括尿囊液。此外，含有載體的組合物可以包括載體或賦形劑例如去離子水和5％葡萄糖水溶液。而且，除上面的，組合物可以包括植物油，懸浮劑，表面活性劑，穩定劑，殺生物劑等等。組合物也可包含防腐劑或其它添加物。含有本發明載體的組合物可以用作試劑或藥物。
載體劑量可以依據下列因素而變化疾病，體重，年齡，性別，和患者的症狀，以及給藥目的，給藥的組合物的形式，給藥方法，轉導的基因，等等；但是，本領域的技術人員可以適當判斷劑量。可以適當選擇給藥途徑，儘管給藥可以通過如下進行例如，經皮，鼻內，經支氣管，肌肉內，腹膜內，靜脈內，關節內，脊柱內，或皮下，但是不局限於這些途徑。也可以局部或全身給藥。在可藥用的載體中給藥的載體劑量優選約105CIU/ml至約1011CIU/ml，更優選約107CIU/ml至約109CIU/ml，最優選約1×108CIU/ml至約5×108CIU/ml。在人類，單次劑量優選在2×105CIU至2×1010CIU範圍，並且可以給藥一次或多次，只要副作用在臨床可接受的範圍。對每天給藥的次數也有相同考慮。對除人類外的動物，例如可以將上述劑量基於目的動物和人類之間的體重比或給藥靶點的體積比(例如平均值)進行轉換，將轉換後的劑量向動物給藥。給予含本發明載體的組合物的受試者包括所有動物，例如人類，猴，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛，和狗。
附圖簡述

圖1是表示特異切割K-ras的核酶的結構(A)和活性(B)的圖和照片。靶點的核苷酸序列和它編碼的胺基酸序列分別顯示在SEQ ID NOs31和32中。核酶的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO33中。
圖2是表示編碼特異切割K-ras的核酶的仙臺病毒載體結構的示意圖。在載體中附在核酶每端的核苷酸序列顯示在SEQ ID NOs35和36中。EIS序列顯示在SEQ ID NO34中。pSeV(+)PM克隆位點附近的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO37中。
圖3是顯示編碼特異切割K-ras的核酶的仙臺病毒載體活性的照片和圖。
完成本發明的最佳方式在下文中，將參考實施例更詳細解釋本發明，但是不意味著本發明局限與此。所有這裡引入的參考文獻被引入作為本說明的一部分。
質粒構建表1顯示合成的編碼核酶的寡核苷酸。選擇的靶是在突變體V12K-ras中位置12的突變的纈氨酸。已經有核酶靶向此位點的報導。在本發明中，表1的KRZa和KRZb(圖1A，上圖)的製備分別參考Tokunaga等和Zhang等的設計(Tokunaga，T.et al.Br J Cancer 83(6)，833-9(2000)；Zhang，Y.A.et al.Gene Ther 7(23)，2041-50(2000))，和Funato等(Funato，T.et al.Cancer GeneTher 7(3)，495-500(2000))。在本發明中設計了KRZc和KRZd，其識別位點與上面那些的大小不同。它們各自的序列是KRZa(正義5′-CTAGCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCTGGTAC-3′/SEQ ID NO17，反義5′-CAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAG-3′/SEQ ID NO18)；KRZb
(正義5′-TGCCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCICCAACTAGG-3′/SEQ ID NO19，反義5′-CTAGTTGGAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAGGCAGG-3′/SEQ ID NO20)；KRZc(正義5′-CTAGCCCACTCTTGCCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCTCCAACTACCACAAGGTAC-3′/SEQ ID NQ21，反義5′-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAGGCAAGAGTGGG-3′/SEQ ID NO22)；KRZd(正義5′-CTAGCCTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCTCCAACTACCACAAGTTTATGGTAC-3′/SEQ IDNO23，反義5′-CATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGAGG-3′/SEQ ID NO24)。
在上述每個序列的一端添加NheI位點，另一端添加KpnI位點。將正義鏈和反義鏈以1∶1的比例混合併使之退火。將每個序列亞克隆到pcDNA3.1-hygro(+)、含有仙臺病毒最小基因組的pAG270、和pSeV(+)PM(Tokusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))(圖1A，中圖)。含有核酶的pAG270如下構建使下列兩種序列退火5′-GGCCGCGCTAGCTTGCTCGAGCAAGGCGCGCCTCCGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCGC-3′(SEQ ID NO25)和5′-GGCCGCGATG AACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACGGAGGCGCGCCTTGCTCGAGCAAGCTAGCGC-3′(SEQ ID NO26)，將得到的雙鏈連接到pSeV 18+(Hasan，M.K.et al.，J.General Virology 782813-2820(1997))的NotI位點，用NheI和KpnI消化質粒以去除病毒基因組中大多數中間部分，並將編碼核酶的合成DNA連接到該位點。體外測試核酶活性的底物如下製備用PCR擴增K-ras cDNA的核苷酸1-171的區域，用TA克隆方法將其插入pCRII(Invitrogen)(圖1A下圖)。使用的引物為5′-ATGAGGGACCAGTACATGAGGA-3′(SEQ ID NO27)和5′-GTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCC-3′(SEQ ID NO28)。


(按照從上向下的順序，此表中核苷酸序列為SEQ ID NOs17至24)[實施例2]體外切割實驗測試核酶活性以判斷它是否受副粘病毒，例如仙臺病毒特異的轉錄終止序列，間插序列和轉錄起始序列的影響。將pCRII/K-ras171線性化，在存在[α-32P]UTP的情況下，用SP6RNA聚合酶轉錄，以製備32P-標記的RNA底物。用含8M尿素的6％聚丙烯醯胺凝膠通過電泳將底物純化。其間，用T7RNA聚合酶從線性化的質粒轉錄核酶。將10μg核酶與大約5000cpm32P-標記的RNA混合在裂解緩衝液(40mM Tris-HCl(pH7.5)，20mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM DTT)中，37℃保溫過夜。將此混合物在含8M尿素的6％聚丙烯醯胺凝膠中電泳，凝膠用BAS2000分析。圖1B顯示所得的結果。此核酶的活性僅稍稍低於不含副粘病毒特異序列的核酶的活性，因此認為這些序列對活性幾乎沒影響。而且，無論副粘病毒特異序列存在與否，KRZa的活性低。因此確定這些序列並非由SeV載體攜帶。
重組SeV載體的製備基本按文獻方法(Tokusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))製備SeV載體。修飾pAC116的多克隆位點以引進NheI-KpnI位點。5』-克隆位點含有72-mer片段，其側翼有NotI位點(5′-GGCCGCACTCGAGTTCGCTAGCTTGGCGCGCCGGTACCTCCGTAAGAAAAACTTAGGGTCAAAGTTCATCGC-3′/SEQ ID NO29)並含有NheI位點、KpnI位點和EIS序列。將編碼核酶的DNA亞克隆到NheI/KpnI位點。將DNA用NotI酶切並亞克隆到pSeV(+)PM的NotI位點(T0kusumi，T.et al.Virus Res 86(1-2)，33-8(2002))(圖2)。pSeV(+)PM的NotI位點附近的序列是5′-AGGGTGAAAGAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATG-3′(SEQ ID NO30；從左側開始，下劃線部分相應於S序列、NotI位點和起始密碼子)。用該構建體在LLC-MK2被表達T7RNA聚合酶的痘苗病毒VacT7感染的情況下轉染LLC-MK2。三天後，收穫細胞，凍融三次使細胞裂解以製備裂解物。將所得的裂解物接種於10日齡受精卵以擴增病毒。
Western印跡用MOI為10的重組SeV感染人結直腸癌細胞系SW480。兩天後，收穫細胞。將細胞在SDS-PAGE樣品緩衝液中裂解並在100℃加熱。然後，將樣品用10-20％凝膠通過SDS-PAGE分離，並轉移到PVDF膜(Millipore)。將膜用人K-ras抗體(Oncogene)和抗-GAPDH抗體(TREVIGEN)通過Western印跡分析。用ECL Plus(Amersham)進行檢測。用圖像分析儀LAS1000進行信號分析和定量(圖3)。通過圖像分析儀判斷條帶的強度，並用抗-GAPDH抗體判定的強度標準化。結果，發現編碼核酶的每種仙臺病毒都抑制內源K-ras的表達。因此，SeV允許有活性的核酶的表達。最短的核酶僅表現出低活性，但是，當使用含有較長核酶的載體時，活性較高。活性最高的是包含具有最長識別位點的KRZc的SeV。
工業適用性本發明提供允許核酶表達的副粘病毒載體。本發明的載體可以抑制細胞內目的靶基因的表達。可以將副粘病毒載體用於向廣泛多種類型的細胞中導入基因，並因此適於作為體內導入或回體導入機體的基因治療載體。特別是，抑制引起疾病的基因的表達的核酶編碼載體可以用於這些疾病的基因治療。
序列表110株式會社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)120編碼核酶的副粘病毒載體及其應用130D3-A0207P140
141
150JP 2003-0233131512003-01-3116038170PatentIn Ver.2.1210121110212RNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例(w＝a或c；v＝a或c或g)4001cwuuvwcccu 10210221110212RNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例4002cuuugacccu 102103
21110212RNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例4003cauucacccu 10210421110212RNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例4004cuuucacccu 10210521110212DNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例4005agggtcaaag 10210621110212DNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例
4006agggtgaatg 10210721110212DNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例4007agggtgaaag 1021082119212RNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒E序列的示例4008uuuuucuua921092119212DNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒E序列的示例4009taagaaaaa92101021110212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒S序列的示例40010ctttcaccct 102101121115212DNA213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒E序列的示例40011tttttcttac tacgg 152101221118212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的接頭序列40012atgcatgccg gcagatga 182101321118212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的PCR引物
40013gttgagtact gcaagagc 182101421142212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的PCR引物40014tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 422101521118212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的PCR引物40015atgcatgccg gcagatga 182101621121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的PCR引物40016tgggtgaatg agagaatcag c 212101721144212DNA213人工序列
220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40017ctagctacgc cctgatgagt ccgtgaggac gaaacagctg gtac 442101821136212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40018cagctgtttc gtcctcacgg actcatcagg gcgtag 362101921147212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40019tgcctacgcc ctgatgagtc cgtgaggacg aaacagctcc aactagg 472102021148212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40020ctagttggag ctgtttcgtc ctcacggact catcagggcg taggcagg 48
2102121168212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40021ctagcccact cttgcctacg ccctgatgag tccgtgagga cgaaacagct ccaactacca 60caaggtac 682102221160212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40022cttgtggtag ttggagctgt ttcgtcctca cggactcatc agggcgtagg caagagtggg 602102321180212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40023ctagcctcaa ggcactcttg cctacgccct gatgagtccg tgaggacgaa acagctccaa 60ctaccacaag tttatggtac 802102421172212DNA213人工序列
220
223人工序列的描述用於構建核酶的寡核苷酸40024cataaacttg tggtagttgg agctgtttcg tcctcacgga ctcatcaggg cgtaggcaag 60agtgcct tga gg 722102521166212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建pAG270的寡核苷酸40025ggccgcgcta gcttgctcga gcaaggcgcg cctccgtaag aaaaacttag ggtgaaagtt 60catcgc 662102621166212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於構建pAG270的寡核苷酸40026ggccgcgatg aactttcacc ctaagttttt cttacggagg cgcgccttgc tcgagcaagc 60tagcgc 662102721122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的PCR引物40027atgagggacc agtacatgag ga 22
2102821130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述人工合成的PCR引物40028gtcgagaata tccaagagac aggtttctcc 302102921172212DNA213人工序列220
223人工序列的描述含有多克隆位點和仙臺病毒EIS序列的人工合成序列40029ggccgcactc gagttcgcta gcttggcgcg ccggtacctc cgtaagaaaa acttagggtg 60aaagttcatc gc 722103021135212DNA213人工序列220
223人工序列的描述pSeV(+)PM的Not I位點周圍的序列40030agggtgaaag aaatttcacc taagcggccg caatg 352103121160212RNA213人(Homo sapiens)
220
221CDS222(1)..(60)40031aug acu gaa uau aaa cuu gug gua guu gga gcu guu ggc gua ggc aag 48Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys1 5 10 15agu gcc uug acg 60Ser Ala Leu Thr202103221120212PRT213人(Homo sapiens)40032Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys1 5 10 15Ser Ala Leu Thr202103321146212RNA213人工序列220
223人工序列的描述切割K-ras mRNA的核酶KRZb40033ugccuacgcc cugaugaguc cgugaggacg aaacagcucc aacuac 462103421122212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述仙臺病毒的EIS序列40034taagaaaaac ttagggtcaa ag 222103521124212DNA213人工序列220
223人工序列的描述載體中編碼的核酶的側翼序列40035gcggccgcac tcgagttcgc tagc 242103621146212DNA213人工序列220
223人工序列的描述載體中編碼的核酶的側翼序列40036ggtacctccg taagaaaaac ttagggtcaa agt tcatcgc ggccgc 462103721135212DNA213人工序列220
223人工序列的描述pSeV(+)PM的Not I位點周圍的序列40037agggtgaaag aaatttcacc taagcggccg caatg 35
2103821124212RNA213人工序列220
223人工序列的描述錘頭型核酶的序列(n＝g或a或u或c)40038cugangannn nnnnnnnnng aaan 2權利要求
1.副粘病毒載體，其編碼具有催化活性的RNA。
2.權利要求1的副粘病毒載體，其中RNA的長度是50個核苷酸或更長。
3.權利要求1的副粘病毒載體，其中RNA的長度是60個核苷酸或更長。
4.權利要求1的副粘病毒載體，其中RNA是錘頭型核酶。
5.權利要求1的副粘病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
全文摘要
本發明提供編碼有活性核酶的副粘病毒載體。本發明的載體適於作為在廣泛多種組織中進行目的核酶的體內或回體表達的基因治療載體。可以將本發明的載體用於癌症和其它疾病的基因治療。
文檔編號C12N15/86GK1768145SQ20048000910
公開日2006年5月3日 申請日期2004年1月30日 優先權日2003年1月31日
發明者德炭剛, 伴浩志, 飯田章博, 長谷川護 申請人:株式會社載體研究所