利用ocp3突變調節植物耐旱性的製作方法

2023-07-01 12:04:36 1

專利名稱：：利用ocp3突變調節植物耐旱性的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物生物
技術領域：
，本發明尤其涉及OCPJ基因作為植物耐旱性調節因子的用途，本發明還涉及獲得增強了所述耐旱性或乾旱耐受性的植物。
背景技術：
：乾旱可能是現代農業最重要的問題，成為連年嚴重虧損的原因。長期遭受水分缺乏引起植物破壞性和不可逆的損傷，這常常導致農作物產量的減少，以及偶爾導致^i物死亡。在乾旱期間，由於缺水，溶解物的濃度增加，其反過來使植物水勢下降。在其最初階段，就整體而言，這使膜系統(包括細胞膜)失去穩定性，並且反過來破壞對細胞內環境穩定非常重要的生理和生化過程，其中，由於其在植物有機體中的特別關聯性，光合作用應該被強調(Holmberg和Biilow,1998)。實際上，在乾旱條件或有限的澆水情況下，光合率可以下降到很低的水平以至於危害對於保持細胞新陳代謝所必須的足量的ATP的產生，這可能使細胞死亡。在乾旱過程中，除了光合率的下降以外，光線繼續影響和刺激葉綠體。因此，這導致活性氧簇合成和累積的增加，所述活性氧簇不可避免地參與了上述細胞損傷的產生，並且因此導致加速的細胞衰退(Holmberg和Biilow,1998)。植物已進化了複雜的防禦和適應策略來應對所有這些複雜的由乾旱誘導的或者與乾旱相關的生理和生化過程。最早的策略之一是通過信號級聯的激活而使脫落酸(ABA)水平增加並相應地使氣孔關閉而防止水分過度流失；所有這些都通過保衛細胞中細胞溶質Ca^水平的增加來介導(McAinsh等，1990)。在長期乾旱情況下，除了這種細胞機制以外，植物為了保持其在可維持的限度內代謝而啟動了其它的適應和保護機制。這包括為了保護和/或修復由水勢下降所引起的細胞損傷而激活不同的信號通路，這些信號通路導致編碼可以用作抗氧化劑和滲透保護劑的蛋白質的一簇基因的表達(Courtois等，2000)。ABA是調節所有這些適應和保護過程的主要激素，這些過程配合對水分脅迫進行應答。實質上是通過大量基因的調節來保持氣孔的保衛細胞中的水平4軒以及增加滲透性應激耐受。因而，在ABA合成或感覺上有缺陷的突變體表現出水分脅迫耐受性的顯著降低，不能有效地對相對短的水缺乏期進行應答(Xiong等，2001)。此外，大多數這些ABA調節的基因在其啟動子區具有被稱為ABRE(ABA應答元件)元件或框的共有調節序列。表現出與這些ABRE序列結合能力的蛋白已經被鑑定，並且該蛋白被稱為AREB(ABA應答元件結合)或ABF(植物生長素結合因子)因子。這些是bZIP(鹼性亮氨酸拉鏈)型轉錄因子，並且作為對ABA應答的轉錄激活因子(Uno等，2000;Choi等，2000)。正如與ABF3因子或ABF4因子一起出現的，這些元件中的某些過表達使轉基因植物的乾旱耐受性增加，伴隨著的是應力應答基因表達的改變，例如W"5，WW，raWS，A8i7基因(Kang等，2002)。此外，MYB和MYC蛋白是非常重要的轉錄調節因子，其還作為激活因子參與了依賴於ABA的調節系統(Abe等，2003)。除了這個轉錄調節級聯以外，所謂的活性氧簇或ROS在對乾旱的感知和適應;f幾制中具有主要作用(Sanders等，1999)。因而，通過ABA來誘導ROS,並且有人提出它們能夠作為由對乾旱應答的激素介導的信號的中間產物(Pei等，2000)。然而，另一組基因，如rd29A基因(對脫水應答)的例子，其表達儘管不依賴於ABA,但由對乾旱應答所誘導(Seki等，2003)。這些基因通常在其啟動子區具有保守的CIS序列或者與稱為DRE(脫水應答元件)或CRT(C重複)的調節蛋白所結合的元件(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki,1994,Baker等,1994)。這些蛋白是屬於ERF/AP2(乙烯應答元件結合因子/Apetala2)家族的轉錄因子(Weigel,1995,Seki等，2003)。有兩組DRE/CRT蛋白，DREB2組(包括對乾旱的應答)和DREB1組(包括對寒冷的應答)(Liu等，2000)。已經證實了通過對DREB2A修飾形式和DREB1A的過量表達，轉基因植物的乾旱耐受性得到大量增加，其可以歸因於應力應答基因表達誘導的增強，例如上述基因(Liu等，2000;Gilmour等，2000;Sakuma等，2006)。然而，這些植物具有多效表型，其中，即使它們對外加的應力有抗性，它們在其發育模式中經歷了嚴重紊亂；它們是具有異常葉形態的矮化植物。隨後的工作已經顯示了另一種替換技術，其通過使用可誘導的系統過表達這種類型的基因來減輕所述過表達的多效外觀，以獲得不減少生長率的更抗旱的植物(Kasuga等，1999;Sakuma等，2006)。
發明內容本發明的第一個目的涉及OCP3基因的功能性參與，該基因編碼作為植物對乾旱應答的調節節點的同源異型框型轉錄因子，即，OC屍3基因在植物耐旱性的調節因子的用途。在本發明中證明了通過用EMS阻斷的化學誘變，產生具有合成功能性OC屍3蛋白的能力的植物，植物在對持續的乾旱期的抗性上獲得大量增加，這在oc;^突變體中是明顯的。還證明了通過基因沉默方法，以與所述ocp3突變體相關的功能缺失的方式來抑制植物中該基因的表達，也產生了對持續乾旱期的抗性。因此，本發明的第二個方面將由所獲得的oc/^基因表達減少的植物組成，其對持續乾旱期的抗性大大增強。所述ocj^突變體最初是從由甲磺酸乙酯(EMS)誘變處理的群體中分離到的，隨後依次從被稱為5.2系的轉基因擬南芥系中分離，其中食用番痴(Lycopersiconesculentum)中五;5C基因的啟動子(在Coego等，2005a中首先被描述)指導編碼/3-葡糖苷酸酶的mU4(GUS)基因(Jefferson等，1987)的表達。在此篩選中分離到多個ocp(陽離子過氧化物酶的過表達子)突變體。特別地，所述隱性ocj3突變體具有所述GUS基因的組成型表達，當採用X-Gluc底物進行GUS染色時，其在整個植物上產生強烈且均勻的藍色。該突變體最重要的一個特徵是其對死體營養型病原體無可爭辯的抗性(Coego等，2005b)。ocz^植物具有高耐旱性所述ocp3突變體的全面分子特徵揭示了某些農藝學利益的特徵，其是可歸因於所述ocp3突變的功能缺失的機制所固有的。這些特徵中，要強調的是當與具有野生型基因型(Col-0)(下文中的Wt(野生型)植物)的非突變體植物相比，觀察到突變體植物對持續暴露於水或澆水缺乏的高抗性。因而，如果在正常短日照條件下生長的4到6周齡之間的wt植物12天沒有澆水，則它們不可逆地退化；相反地，這不會發生在ocp3突變體中。圖1顯示每種基因型的代表性植物各自生長(在獨立的盆中)或者在同一盆中成簇生長的wt和如所觀察到的，所述wt植物具有顯著的枯萎，甚至以死亡，而所述oc;3突變體植物在持續乾旱期後保持明顯健壯或者保持不變。甚至在所述持續乾旱期後更換澆水情況，wt植物沒有恢復，而所述oc;3植物繼續其正常發育(圖1)。這些結果證明通過隱性oc;3突變，所述OCP3基因的功能缺失足以使擬南芥植物對乾旱具有明顯抗性，並且為所述OCP3蛋白爭辯，其能夠作為在持續水短缺或者乾旱期中存活的現有植物適應機制的負調節因子。ocpj突變體對ABA有高壽文感性在植物對水分脅迫的應答中存在大量涉及ABA的證據(Zeevaart和Creelman,1988;DaviesandJones，1991;Koomneef等，1998;Hetherington,2001;Schroeder等，2001)。因而，對外源性ABA施用不H感的突變體植物(例如，abil或abi2突變體)不能對水缺乏狀況進行有效的應答，並且所述突變體植物枯萎並在相對短的時期內死亡。在由向擬南芥屬植物施用外源性ABA激素所觸發的若干效應中，它們中的一個是觸髮根延伸能力下降的效應，此外所反映出的一個外觀是該植物較小尺寸氣生部分。因而，與由Col-0和Ler對照所經歷的相比，對ABA不敏感的突變體(例如abil和abi2)顯示出對根部發育較小的抑制作用(Koornneef等,1984)。為了研究外源性ABA施用對ocp3植物發育的任何可能效應，將所述突變體的種子播種於MS-瓊脂平板以及補充有0.8pM濃度ABA的MS-瓊脂平板，並且在這些實驗中始終使用wt野生型基因型(Col-0)作為對照植物。如圖2所示，如果後者在ABA存在下出現，則所述oc;3突變體的發育在發芽的第一階段被阻礙，因此與所述wt對照(Col-0)相比其對ABA激素具有更高的敏感性。因此，在此基礎上可以推斷的是，可歸因於oq3突變的功能缺失產生了對ABA激素的高敏感性，並且因此所述OCP3基因的正常功能在其合成或者在其正確感覺的意義上將相當於其調節ABA激素傳導通路的任何抑制方面的功能。ocpj突變體在脫水應答基因的表達水平上沒有改變能夠解釋ocp3突變體對ABA更高的敏感性以及耐旱性增強的可能性可以是所述基因突變已引起依賴ABA的信號通路的組成型激活，其結果將是脫水應答基因的組成型表達，該脫水應答基因增強對由水分脅迫所引起損傷的保護水平，因此這將有助於植物更好地抵抗這種類型的應力。為了研究這種可能性，進行分子分析來確定對脫水應答的多個信號標記基因的表達水平(測量為通過RT-PCR相應mRNA的積累)，那些基因中的兩個是由依賴ABA的途徑來激活的，另外的基因的激活不依賴ABA途徑。n/"B和WW基因被用作依賴ABA的通路的標記物，而被用於不依賴ABA的通路。植物在含有150|_iMABA的液體培養基中孵育後，對這些基因在不同時間(0，lh,3h以及6h)的轉錄物水平進行分析。如圖3A所示，當對從wt(Col-0)植物和同樣處理的ocp3植物中所獲得的RNA群體進行比較時，在相應於所使用的標記物的轉錄體誘導和累積水平中沒有可觀察到的差別。這表明通過ABA介導這些基因表達誘導的信號通路中沒有可觀察到的缺陷，並且消除了ocp3突變影響所述基因激活途徑的這種考慮。為了完善所述分子特徵，對這些相同標記基因對脫水應答的轉錄物的水平進行比較。按照Sakuma等人所描述的進行實驗。Col-0和ocp3幼苗在MS-瓊脂平板上體外生長，並且在3周後，所述幼苗被轉移到不含培養基的無菌培養皿使它們脫水。在脫水0、10min、30min、lh、3h和6h後，對相應於先前所指出的標記基因的轉錄物累積水平進行分析。該結果(圖3B)證明和以及rW^4在脫水誘導條件上表現出顯著的累積，但與此同時，當對從wt(Col-0)植物和同樣處理的ocp3植物所獲得的RNA群體進行比較時，相應轉錄物的誘導和累積水平之間沒有觀察到差別。因此所有這些表明oc;3突變體沒有表現出與信號級聯的激活有關的任何缺陷，所述信號級聯的激活也是由這些對脫水應答的標記基因來誘導的。總而言之，該結果表明，儘管所述ocp3植物與Col-0植物相比在發育抑制方面表現出對ABA顯著敏感性的事實，但在標記基因表達的可誘導性上沒有差別，所述標記基因的表達是ABA依賴的(例如W2^^和^/22)或ABA不依賴的(例如W"yO。因此，由oc;3突變體所顯示的耐旱性似乎是不依賴這些基因的表達。對外源性ABA施用和脫水的應答抑制了OCy3基因的表達在乾旱和脫水條件下，植物通過增加ABA的內源性水平來應答，其涉及信號級聯的激活，作為結果該信號級聯在轉錄組水平上具有一系列的變化。為了研究ABA在wt植物的轉錄(9C屍3調節中所具有的可能作用，在施用ABA後及使所述植物受脫水應力後的不同時間上通過定量RT-PCR(q-RT-PCR)對相應於OC屍3基因的mRNA的相對水平進行測量。在試驗中，ABI1基因被用作對照，已知對ABA和脫水的應答會誘導其表達。如在圖4中所能觀察到的，由於施用了150]LtMABA，在對幼苗施加水分脅迫後，觀察到相應於OC屍3基因的轉錄物的累積水平明顯降低。由於採用ABA處理或者是由於脫水，在非常短的時間所述OCP3基因表達的抑制已經變得顯而易見。此外，所述降低與ABI1基因所觀察到的激活成反比(圖4)。因此，這表明OC屍3基因可能涉及早期信號，該早期信號對ABA水平的增加進行應答，以至於儘管已經證明對先前所標出的參考基因(包括ABI1基因本身)，促進轉錄程序的激活不是充分必要的，但它的抑制是必需的。此外，ABI1蛋白作為對ABA應答的負調節因子，它的誘導將有助於調節由所使用的誘導條件所激活的強烈的轉錄需求。ocpj突變體沒有表現出對脫水應答的改變由持續乾旱期所引起的內源性ABA水平的增加之後，在植物中出現的一個首要特徵性事件是關閉氣孔(Schroeder等，2001)。因此，對植物關閉氣孔能力的間接測量法包括確定葉子鮮重隨時間的損失，所述葉子從植物分離並被放置在受控制的環境溫度和溼度條件下。因而，在合成、感覺和/或對ABA應答上有改變的突變體是不能有效地關閉氣孔的，並且因此在該突變體中對該脫水過程應答的鮮重較快的降低(Allen等，1999;Finkelstein和Somerville,1990;Koornneef等，1984;Leung等，1997)。為了觀察oc;3植物與生理學方面有關的行為，進行了用於測量脫水率的類型的分析，並且數據參考用W"/植物和相應對照植物(wt)所獲得的那些；Col-0作為oc;J突變體的親本，Ler作為突變體的親本。為此，將每個基因型的植物的蓮座葉切割，分成三份，並且放置在層流箱中的無菌培養皿中以使其乾燥，在不同時間測量鮮重的損失。如在圖5中所觀察到的，在乾燥開始後3小時，所述aZnW突變體的鮮重突然損失，其損失接近其鮮重的80%。相反，如與來自oc;3突變體的樣品一起出現的，Ler對照和Col-0對照^U義損失其原始鮮重的20%。因此，儘管在ocp3突變體和wt植物之間觀察到對乾旱應答的顯著差異，但在所述植物之間對乾燥應答不存在顯著差異。行為上的這種差異(在盆中生長的植物的高耐旱性，而oc;^植物對迅速乾燥的正常行為)可能是因為所分析的這兩種類型的應力(乾旱和乾燥)具有不同的信號傳導機制這一事實，並且所述OCj^突變體清楚地揭示了該差異。突變體在氣孔的排列和數量上沒有改變根據所得到的結果，假如氣孔的數量、它們的排列以及還有它們開/關的程度在植物對水分脅迫的應答中具有關鍵作用，則可以考慮ocp3表現出任何氣孔改變的可能性。掃描顯微鏡分析(圖6)之後，在oq3植物和wt植物之間，或者是在整個葉身上氣孔的排列或數量上沒有觀察到差別。當oc/3植物和wt植物在正常的溫度、光線和澆水條件下生長時，在它們之間的氣孔的開放程度上沒有發現顯著差異(圖6),儘管它們兩者與abil突變體所觀察到的明顯不同，該abil突變體表現出持久的氣孔開放，這解釋了abil植物所觀察到的對脫水的行為。存在有不同的刺激來修飾氣孔的開/關速率以及程度，並且在它們中應當強調的是使所述植物遭受乾旱或者剝奪它們的光照，全部信號傳導始終與ABA內源性水平的增加直接相關，ABA是一種決定在誘導或應力條件下關閉氣孔的激素。為了確定oc;3突變體中ABA介導的信號是否存在任何缺陷，決定對植物和Col-0植物之間在從蓮座葉獲得的外皮樣品(剝下的皮)中直接施用ABA後所出現的氣孔關閉率進行比較。如在圖7中所觀察到的，ABA的存在使ocp3植物中的氣孔加速關閉，這在施用ABA後30分鐘以及在wt對照仍然沒有啟動關閉其氣孔的過程的情形中已經是可以明顯地觀察到的。然而，這些差異在施用.ABA後2小時消失，在該時間所述ocp3植物和wt植物的氣孔^皮完全關閉。因此，從這些實驗可以推斷，所述ocp3突變體對ABA激素更加敏感，並且這轉化為對該激素的早期應答，其是以加速的氣孔關閉來表現的。當幼苗在ABA存在條件下發芽並生長時，對ABA較大的敏感性與由幼苗所顯示的超敏感性一致(圖2)。此外，所述對ABA的超敏感性可以解釋耐旱性表型，由於乾旱導致ABA合成的增加，其反過來使氣孔關閉以防止水分通過蒸發蒸騰作用損失。因此，由於所述o3突變體對ABA更敏感，所以它將根據乾旱信號加速關閉其氣孔，並且在應答中的敏捷性可以更好地或更長時間地給它提供優勢以克服來自水缺乏的代謝缺點。flh7-7突變消除了ocz3植物對乾旱的抗性在依賴ABA的信號傳導通路中包含ABI1磷酸酶2C，這是明確的並且已得到了4艮好的研究(Koornneef等，1984;Leung等，1997;Allen等,1999;Merlot等，2001;Mishm等，2006)。實際上，在顯性突變體中表現出大多數依賴該激素的表型。由於這些突變體植物不能關閉氣孔(氣孔關閉是由於ABA介導的信號傳導被組成型抑制)，所以它們對乾旱和脫水超壽1感。此外，W/-7植物對ABA不敏感，並且因此在脫水條件和對外源性ABA施用的應答上都沒有顯示出標記物基因表達的誘導。為了確定由ocp3突變所產生的耐旱性是否依賴45//，將ocp3突變滲入到a^'-7突變體本底，從而產生ocp3雙突變體，並且對這些植物在不同條件下的應答進行分析。一方面，對在補充有0.8pMABA的MS平板上ocp3W〃-7雙突變體的生長進行研究，並且對其在幼苗生長上所發揮的作用與Col-0、ocp3和aZn-/基因型進行了比較。如在圖8中所能觀察到的，所述oc;3a^7-7雙突變體行為與a&7-7類似，並因此表現出對ABA超敏感性的抑制，其可以歸因於所述OC;^突變。另一方面，通過對先前所使用的ABA通路標記基因的mRNA水平進行分析，觀察到的是，與用wt或ocp3植物所觀察到的相反，攜帶有oc;3雙突變的植物的該標記基因的表達誘導減少。所述ocp3Wz7-/雙突變體的行為與W〃-7突變體類似，其也具有對ABA應答的參考基因表達的激活減少(圖9)。如在a&7-7和所述oq3a&7-/雙突變體的例子中都能觀察到的，n/"j基因的表達誘導大大減少，而在^/295和W22基因的例子中，其實際上消失。這些結果與先前工作中所獲得的那些是一致的，其中，在aZn7-7突變體中標記基因表達的誘導減少，所述標記基因是依賴於ABA的(例如W"5)和不依賴於ABA的(例如n^9J)(Nordin等，1993;Shinozaki等，2000;Umezawa等，2006)。在這些實驗中，所述Wa2-7突變體(圖9)被用作內對照以證明ABA施用和所使用的劑量是有效的。所述"^z2-/突變體不合成ABA(L6on-Kloosterziel等，1996)，因此先前所使用的依賴ABA的基因的表達的任何誘導只可以歸因於所施用的外源性ABA，而不可以歸因於任何由所使用的不同遺傳背景所引起的其它內擾。最後，分析了Col-0、ocp3、fl^7-7和oc/^^)〃-7植物對乾旱應答的行為。圖10顯示的是一組每種基因型的代表性植物，以及對沒有受到所述水分脅迫的和正常澆水的每種基因型的代表性植物的比較(圖10)，每種基因型的代表性植物在保持12天不澆水後澆水2天(圖10)。如在該圖中所觀察到的，如果應力期持續很長時間，則所述wt植物(在其各自的Col-0和Ler背景)表現出枯萎和應力症狀，這是缺乏澆水和完全^隻滅前的特徵。同樣地，分別具有經過改變的ABA感覺和合成的所述aZ)"-/突變體和Wa2-7突變體表現出對外加水分脅迫的敏感性增加(具有4支早和更顯著表現的特徵性症狀)，這表示該激素在這種類型應答中的重要性。相反，如所期望的，所述ocj^突變體表現出對該應力抗性的明顯行為。然而，所述ocpJa&7-7雙突變體表現出與顯著枯萎的a&7-7單突變體相似的行為，所述枯萎比在wt(Col-0)植物中所觀察到的還更大，並且在更換澆水之後它們似乎沒有從中恢復(圖10)。因此，由ocp3aZ〃-7植物所證明的耐旱性的缺失表明，對於可歸因於ocp3的抗性表型的表現，通過ABI1調節因子保持ABA通路的完整是完全必需的。此外，從上述內容中可以衍生出的是，在野生型條件下，所述ABI1和OC屍3蛋白可以相互作用來介導例如在wt植物中所觀察到的用於對乾旱的感覺和應答的行為。OCP3與ABI1的物理相互作用與OCP3相互作用的蛋白的鑑定與了解植物由不同類型應力(例如乾旱和對死體營養真菌的應答)所引發的現象以及確認它們之間可能的聯繫是高度相關的。為了確定存在這些相互作用，採用了酵母"雙雜交"技術(Ausubel,1987)。採用這種技術，基因的表達使得酵母在營養缺乏的培養基中生存成為可能，所述基因表達是受基因的調節區或啟動子調控的——只有在所研究的兩種蛋白之間形成穩定的蛋白複合物後才被激活。在該例子中，所述OC屍3蛋白與GAL4基因激活結構域融合，並且該融合物(OCP3-AD)被用作融合到GAL4啟動子結合區(X-BD)的擬南芥(A.thaliana)的蛋白的基因文庫的引物。這些融合物在含有載體的酵母中被表達，在所述載體中，對指導HIS3標記基因表達的GAL4啟動子進行了定位，以至於只有當OC屍3和一種X蛋白相互作用時，該酵母在不含組氨酸的培養基中的生長才將被恢復。此外，使用HIS3的竟爭性抑制劑，例如3-AT(3-氨基三唑酸)來增強特異性。在篩選中檢測到的一個克隆與所述ABI1^粦酸酶2C的cDNA相對應，其i正明在OC屍3和ABI1之間存在相互作用。在圖11中可以觀察到，ABI1-BD和OC屍3-AD融合蛋白的連鎖表達如何來恢復該酵母的生長，而它們兩者單獨任何一個或者是空載體是不能夠恢復酵母生長的。因此，可以推斷出ABI1與OC屍3相互作用。該結果與直到現在為止所描述的那些是一致的，其中，在a&7-/突變體中存在的ABI1磷酸酶2C的遺傳功能的獲得能夠抑制ocp3植物的耐旱性。OCP3編碼同源異型框型轉錄因子，並且在文獻中描述有若干例子，其中，已經證明了通過磷酸化/去磷酸化作用的轉錄因子的功能調節(Kaffman等，1994;Pines1999;Whitmarsh等，2000;NowakandCorces,2000)。因此，假設ABI1是磷酸酶，為了將OCP3去磷酸化，將發生相互作用，因而非常可能來調節其功能。由OC屍3突變所產生的對灰葡萄孢菌的抗性是不依賴ABI1的先前的工作已經描述了所述oq3突變體對死體營養型病原體感染的抗性表型(P200501035;Coego等，2005b)。在該工作中產生了—Wz7-7雙突變體，其似乎是非常有價值的遺傳物質，可以用於研究ABA激素在ocp3突變體所證明的。該雙突變體一方面通過a&7-7突變將不能感覺以及因此ABA介導的信號的非傳導相組合，另一方面可歸因於oc;3基因座中功能缺失的分子改變，並且作為顯著的效果，其除了先前所顯示的更大的耐旱性以夕卜，對例如灰葡萄孢菌或孢菌(Plectosphaerellacucumerina)的真菌具有更大抗性。為了分析ABA可能涉及對死體營養病原體的抗性，採用Col-O、Ler、oc;3、a&7-7和oq^Wz7-7植物的灰葡萄孢菌進行接種實驗。圖12顯示的是這些植物在接種真菌孢子的懸浮液後72小時的反應，其中，在wt植物中所觀察到的正常敏感性可與在W/7"植物中所觀察到的相比。因此，這表明wt植物對該死體營養真菌的正常敏感性似乎是不依賴正確的ABA激素感覺的。同樣地，當對在oc;3a^7-/雙突變體中a6〃-/突變存在下的oc/3突變進行分析時，也不影響所述oc;^突變體^皮證明的抗性特徵的增加。總而言之，這些結果表明oc;3突變體所特有的對死體營養真菌的抗性依照與ABA激素的正確感知和轉導過程無關的過程。相反，所述無關性與由oq3突變體所顯示的對ABA的絕對需求相比較來表明在上文所證明的耐旱性。因此，這些結果表明，所述OC屍3基因作為植物對不同類型應力(例如乾旱和死體營養真菌)的防禦反應的調節節點的可能作的ABI1基因的所述ABA激素，而非用於對真菌的抗性。(9C屍3同源番茄基因(LeOC屍3)的沉默在番茄植物中產生耐旱性表型病毒誘導的基因沉默或VIGS是一種通過其mRNA的幹擾用於瞬時中斷基因功能的一種方法(Baulcombe,2004)。儘管不了解其確切的機制，但該方法利用植物抑制外來RNA積累的天然能力作為對病毒感染的防禦機制(Dawson,1996)。由於由VIGS沉默的植物所表現出的表型與功能缺失的表型相當，所以攜帶有內源性植物基因特異序列的重組病毒載體的產生已使成功抑制不同基因的表達成為可能，並成為一種研究基因功能的強有力的工具(Burton等，2002)。已經開發了許多有效的病毒載體，可以用於研究不同植物品種例如菸草本塞姆氏(Nicotianabenthamiana)(Liu等，2002b)、番^S(Lycopersiconesculentum)(Ekengren等，2003;Liu等，2002a)、牽牛花(Petunia)(Chen等，2004)或馬鈴薯(Solanumtuberosum)(Brigneti等，2004)中的基因功能。VIGS技術被用於研究OCT^抑制的作用是否還增強了具有更大農業利益的其它植物品種中的植物的抗性。尤其是使用了基於TRV病毒(菸草脆裂病毒，一種二分RNA病毒)的第二代VIGS載體(Liu等，2002a)。這種載體已^t設計存在有TRVRNA2中的多克隆位點，其中插入了大約344bp的OC屍3同源的番茄基因(LeOC屍"的特異序列(圖13)。從在Genebank資料庫中出現的並且顯示與擬南芥的OC屍3有48.3%胺基酸序列同源性的馬鈴薯(Solanumtuberosum)基因序列(登記號BQ112211)中克隆得到番茄(Lycopersiconesculentum)的直向同源基因，即下文中的LeOCP3。基於該馬鈴薯(9C屍3核苷酸序列，設計特異的寡核苷酸(具有SEC.ID.No.1的寡核苷酸PoRTl和具有SEC.ID.No.2寡核苦酸PoRT2)，並且在對從番茄葉RNA中所獲得的cDNA樣品進行的PCR反應中被用作寡核苷酸。將所述PCR反應的產物克隆到載體pTZ57,並且對被稱為LeOC屍3的該克隆DNA產物進行測序(圖14)。由該擴增所獲得的序列與馬鈴薯序列具有95%的相似性。用tom(9C/^EcoRI和tomOCP3Xho1馬鈴薯序列的特異引物(分別摻入EcoRI和Soy酶切位點)通過PCR從該番茄克隆中擴增出330bp的片段(LeOCP3*)，用這些酶消化之後，將該片段連接到載體TRVRNA2,從而產生TRVRNA2-Le(9C戶"構建體(圖13和14)。當番茄植物葉子的葉部或子葉分別與包含構建體TRV和TRVRNA2-LeOC屍"的根癌土壤桿菌作物(農桿菌滲入法)共浸潤時，所述植物細胞認為轉錄的RNA是外來的並且使之沉默。這種沉默對於病毒RNA和內源性LeOC屍3RNA都是有效的，並且該沉默機制是系統性的，涵蓋了整個植物，其最初是局部農桿菌滲入的。為了評價Le(9C屍3基因沉默對番茄植物的耐旱性所發揮的作用，使用了Micro-Tom(微型矮化番茄品種)多樣性番茄植物，其子葉與農桿菌(A.tumefaciens)作物共浸潤，該作物一方面包含TRVRNA1,另一方面包含帶有LeOC屍3特異的344bp片段的TRVRNA2。對20個7天大的植物分批進行農桿菌滲入。含有空白TRVRNA1和TRVRNA2的Micro-Tom植物的子葉、帶有TRVRNAl或TRVRNA2的植物，以及不含有任何這些載體的植物被農桿菌滲入作為該實驗的內參。為了證實該沉默是有效的，使用了該病毒載體的變異體，其包括大約500bpZ^戶ZX9基因(八氫番茄紅素脫飽和酶基因Phytoenedesaturase)的片段。該基因編碼類胡蘿蔔素生物合成的關鍵酶，因此，其表達的減少產生易於檢測的表型，例如葉子中色素的損失(Liu等，2002a)。農桿菌滲入後20天，取消該^i物的澆水，並且逐漸評價耐旱性表型。在缺水後15天對所述植物進行拍照。非農桿菌滲入的對照植物以及與空白載體(沒有LeOC屍3序列)農^f菌滲入的植物表現出特徵性的乾旱表型，其以枯萎和顯著的葉子脫水來表現。相反，用攜帶TRVRNAl+TRVRNA2-LeOC屍3的農桿菌(A.tumefaciens)滲入的植物能夠對抗該乾旱期而不遭受顯著損傷(圖15)。此外，10天之後，在所有被分析的例子中，與TRVRNA1和TRVRNA2-PDS共浸潤的植物中Ze屍i)S基因的沉默是顯而易見的，在葉子上出現顯著的缺綠病，其表示基於特異序列識別的基因沉默在所有例子中都是有效的。總之，所述LeOC屍3內源性番茄基因的沉默能夠模擬A.thaliana擬南芥的oc;3突變體的表型，這似乎是明確的，這表明OCP3基因的調節功能在兩個如此疏遠的物種中是保守的。因此，所述OC屍3基因表達水平的減少可能是植物通過減少由該應力所引起的損傷來對乾旱進行應答的通用機制。獲得了該基因表達減少的植物，其可以提供一種用於獲得具有更大乾旱耐受性的作物的重要方法。因此，在本發明中證實了擬南芥(Arabidopsisthaliana)中(9C屍3基因的功能缺失產生了對持續乾旱期的顯著抗性，正如在ocp3突變體(用15化學試劑曱磺酸乙酯(EMS)所誘導的突變體)中所觀察到的。儘管對乾旱誘導型基因表達的誘導沒有改變，但出現了該抗性，並且這對誘導被當作依賴ABA激素的基因和誘導是不依賴ABA激素的其它基因都是有效的，並且這些基因通常被用作測量植物中水分脅迫影響的分子標記物。在此意義上，還證實了野生型植物中所述OC屍3基因的表達是由ABA激素以及實際脫水負調控的而且是快速調控的；並且在與ABI1基因的誘導儘管相反但相似的時間模式之後出現了所述負調控，所述ABI1基因是ABA介導的信號傳導的一種主要調節因子。除了抵抗持續乾旱期的能力以外，當所述OC屍3基因的正常功能被突變或者缺失時，本發明還證明了對將出現的持續乾旱通過ABI1蛋白的正確功能來保持正確完整的ABA激素感覺是有必要的。本發明還證明了ABI1和OCP3蛋白之間存在物理相互作用，並確定了OCP3作為調節植物對乾旱應答的節點這個新角色。本發明所顯示的另一方面是由OCW基因的功能缺乏或缺失所帶來的對死體營養真菌的抗性是不依賴於ABA的。後者證明了產生乾旱抗性和對真菌抗性的能力是通過不同途徑的，但它們都集中於該基因的實際功能，其正常功能是作為兩種信號轉導通路的轉錄抑制因子。此外，正如在番茄的例子中已經證明的，通過VIGS技術使直向同源基因沉默來對與另一植物中OC屍3同源的基因進行操作，產生了通過所述oc;3突變體在擬南芥(Ambid叩sisthaliana)中所觀察到的耐旱性表型。因此，本發明證明了oc;^基因或該蛋白正常功能的消除或抑制是用於控制、產生和誘導植物對乾旱期的抗性的增加以及用於控制、產生和誘導對死體營養真菌攻擊的長效抗性的一種手段。圖1顯示的是對wt和ocp3植物的耐旱性的分析。(A)6周大的植物13天沒有澆水，此後恢復正常的澆水狀況(下部的方形照片)。正常澆水的植物的外觀(上部的方形照片)。(B)4周大的wt基因型(左)和ocp3基因型(右)的植物12天沒有澆水，此後恢復正常的澆水狀況。(C)分別生長的5周大的wt和oc;3植物；它們14天沒有澆水，並且此後恢復正常的澆水狀況。在所述oc;3突變體的例子中，對水缺乏進行不同的處理之後，觀察沒有變化的表型，相反，在野生型wt植物上觀察到所述處理所具有的有害外觀。圖2顯示的是與wt(Col-0)植物相比ABA在oc;3植物發育中的作用。對種子進行消毒，於4°C分層4天並播種於含有MS-瓊脂培養基和補充有0.8pMABA的MS-瓊脂的平4反中。播種後17天進行拍照。圖3顯示的是通過RT-PCR對Col-0和ocp3植物中的水分脅迫標記基因W"丄W"S和的表達進行分析，使用五丄/^7Q!基因作為對照。所述植物在MS-瓊脂平板上生長3周，並從在不同時間收集的樣品中提取RNA。(A)在液體培養中施用150juM的外源性ABA之後的表達水平。(B)所述植物脫水後10min、30min和l、3以及6h的表達水平。圖4顯示的是通過實時PCR所測量的對150(LtM外源性ABA施用(A)以及脫水(B)應答的OC屍3和ylBi7的相對表達水平。該圖表顯示了OC屍3和」5//轉錄物的水平，它們都涉及APT基因的轉錄水平並由三個獨立測量的平均值來表示。誤差條表示標準差。有相似結果的實驗至少重複3次。圖5顯示的是受到乾燥作用的葉子的鮮重損失。每個基因型使用3份，通過將它們切割並且把它們放置在層流箱中的培養皿中使其乾燥。根據在0時間和所標出的每個時間之間葉子重量的差別來確定重量的損失。突變體(-X-)很快變幹，而在Col-0(-畫-)、Ler(-A-)和ocp3(—*一)之間不存在顯著差異。圖6顯示的是通過掃描顯微鏡對來自wt、ocp3和Wz7植物的葉子進行葉表面分析。下部方形照片是放大圖，其中顯示了對於每個所選擇的基因型的典型氣孔，並且其中與abil植物的葉子樣品相應的氣孔開放是顯而易見的。條形代表100微米(上部方形照片)或者10微米(下部方形照片)。在開/關程度之間或者在wt和oc/^樣品之間的氣孔數上沒有觀察到差異。圖7顯示的是通過ocp3和wt才直物中的ABA(100ptM)所誘導的氣孔關閉的測量。將蓮座葉從6周大的oc;3和Col-0基因型的植物上分離，並在溶液(10mMMes-KOH，pH6.15和30mMKC1)中孵育2小時以誘導氣孔的開力文。然後，加入100/xMABA誘導該氣孔關閉。在所標出的不同時間上對具有不同遺傳背景的葉子表皮上氣孔的開放進行測量。施用ABA後30分鐘，oc;3突變體中氣孔較大的關閉是明顯的而且是有統計學意義的。條形代表實驗的平均值，每個實驗至少有90個測量。誤差條表示平均值的標準誤(SEM)。星號表示根據Studentt檢驗(統計學檢驗)的顯著性差異(p<0,001)。圖8顯示的是ABA中ocp3a6〃-/雙突變體發育中的作用。除了Col-0和Ler以外，oc/3和a&7-7親代被用作對照。種子採用與圖2所描述的相同方法來處理。圖9顯示的是對來自Col-0、ocp3、a^2-八W〃-7和ocp3a&7-7植物的RNA樣品通過RT-PCR分析來比較ABA對水分脅迫標記基因W"j,W"萬和WW表達的誘導，使用與作為對照的五丄F7o!基因相對應的mRNA的累積。步驟與在圖3中所描述的相同。如果與ocp3或wt所獲得的水平相比，Wz7-/突變體和oc;3a&7-7雙突變體中標記基因表達的誘導明顯減少。圖10顯示的是W〃-/才直物和所述W〃-7雙突變體的耐旱性分析。作為各自突變體遺傳背景的Col-0和Ler被用作對照，並且Wa2-7突變體被用作乾旱高敏感性對照。6周大的植物12天沒有澆水(下部方形照片)。正常澆水的植物的外觀(上部方形圖片)。所述ocp3a&7-7雙突變體表現出與在a^7-7單突變體中所觀察到的相似的易感行為，其與oc;3植物所展示的抗性形成明顯對比。圖11顯示的是OC屍3和ABI1之間的相互作用。攜帶不同質粒組合的酵母在具有和不具有組氨酸以及不同濃度3AT(—種HIS3抑制劑)的選擇性培養基上生長。只有產生OC屍3-AD和ABI1-BD融合蛋白的酵母能夠在缺乏組氨酸和高濃度的3AT條件下生長，這表明兩種蛋白發生相互作用。圖12顯示的是Col-0、oc;3、Ler、W〃-7和oc;3aZz7-7植物對灰葡萄孢菌(B.cinerea)的抗性分析。(A)不同基因型中真菌感染後72小時所出現的損傷的典型照片。(B)不同基因型中由灰葡萄孢菌(B.cinerea)所引起的壞死的直徑量度。測量結果的平均值被表示在圖表中。誤差條表示標準差。星號表示針對Col-O對照的顯著性差異。圖13顯示的是在分析中所使用的VIGS載體。在分析中被用作沉默對照的載體TRVRNA2-LePDS與TRVRNA2-Lc(9C屍3相同，只是用LePDS替換了Le(9C屍丄圖14顯示的是採用程序CLUSTALW(1.83)對擬南芥(A.thaliana)的OC屍3基因以及馬鈴薯和番茄的直向同源基因的cDNA序列進行比對。星號表示在這3個種類中保守的核苷酸。圖15顯示的是通過VIGS技術使LeOCP3沉默的MicroTom番茄中耐旱性的分析。照片顯示了針對與空白載體TRVRNA1+TRVRNA2農桿菌滲入的對照(左)，與載體TRVRNAl+TRVRNA2-LeOC屍3農桿菌滲入的MicroTom番茄植物(右)的重要抗性的表現。具體實施例方式植物的生長及所使用的植物材料所述才直物在23。CJiffy-7壓實底物(Clause-TezierIberica，Valencia,Spain)中生長，其光照期為10小時的光和14小時的黑暗。對於體外培養，通過加入70%的乙S享2分鐘以及商品化的30%的鹼液7分鐘對種子進行消毒。隨後，用無菌水洗滌5-7遍並在4。C使其分層4天。所標出的例子中所使用的培養基是補充有蔗糖(10g/L)和瓊脂膠(Sigma)的Murashige&Skoog(MS)培養基(Sigma)。所述植物在22°C於所標出時期內生長，光照期為16小時的光和8小時的黑暗，其光強度為150-200使用了擬南芥(A.thaliana)(L.)Heynh.:ocp3和幽2-7的Col-0生態型遺傳背景的突變體以及Lansbergerecta(Ler)生態型遺傳背景的a&7-7突變體。番茄植物如Coego等所描述的進行生長。(2005a)基因構建體通過將OCP3的cDNA克隆到載體pAS2.1(Clontech)來產生在酵母雙雜交篩選中所使用的構建體，使用具有被確定為SEC.ID.NO.19的序列的引物(9C屍3-1和具有被確定為SEC.ID.NO.20的序列的引物OC屍3-2進行擴增，分別產生酶切位點EcoRI和SmaI。為了克隆LeOO^基因和LeOC屍"片段，進行了引物的設計，其在5'和3'端分別包括限制性酶Sacl和Ncol的切割位點PoRTl:SEC.ID.NO.1_PoRT2:SEC.ID.NO.2tomOCP3EcoRI:SEC.ID.NO.tomOCP3XhoI:SEC.ID.NO.4PwoSuperYieldDNA聚合酶(Roche)被用於PCR擴增反應。PCR反應的條件詳見下表構建體退火溫度延伸時間循環數大小pAS2.1:OCP3552'221065LeOCP357301042LeOCP3*58r20330用相應的限制性酶對PCR產物進行消化，並使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)連接到所標出的載體中。隨後通過測序對該構建體進行檢查。脫水和外源性ABA施用的分衝斤所述植物在補充有10g/L蔗糖的MS-瓊脂培養基上生長2-3周。對於脫水實驗，將植物放置於培養皿中。直接從MS-瓊脂平板收集的植物被用作時間0。在外源性ABA施用的實驗中，將植物轉移到50mL補充有10g/L蔗糖的攪拌下的液體MS培養基中，在所標明的例子是補充有150/xMABA(Sigma)。在不同時間後，每種基因型取4-5個植物(大約150mg)，去除殘留的培養基，並在液氮中冷凍。20乾燥分析對於這些分析，使用在短日照條件下生長的6周大的植物。將每種基因型3個植物的六分之五的蓮座葉切掉並放置在培養皿中。將培養皿置於層流箱中，在5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、120、150和180min後進行連續的稱重操作。對於每種基因型產生了不同植物的3個獨立重複。起始重量被認為是100%，3個重複的重量損失百分比的平均值以及它們的標準差被表示。對類似結果進行3次重複分析。通過RT-PCR對基因表達的分析半定量RT-PCR技術被用於確定一些目的mRNA的相對量。對於RNA提取，原材料是大約150mg的組織，按照公司的流程來使用Trizol試劑(Invitrogen)。用50pL不含核糖核酸酶的水重懸總RNA。使用RevertaidHMinusFirstStrandcDNA合成試劑盒(Fermentas)以及該試劑盒所揭:供的隨機六聚體寡核苷酸引物對RNA(5pg)進行反轉錄。在所得到的cDNA基礎上，採用每個基因的特異引物在PTC-IOOPeltier熱循環儀中進行不同的PCR。用3%的瓊脂糖凝膠(IXTAE)對RT-PCR產物進行分離。在下表中顯示了對源自擬南芥的樣品所使用的引物tableseeoriginaldocumentpage21實時PCR將樣品分成三份進行分析，使用SybrGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)在ABIPRISM7000序列檢測器中進行實時PCR反應。使用寡核苦酸表達(Oligonucleotideexpress)計算機軟體包i殳計正向和反向引物。該儀器的軟體所提供的Cts被用於分析表達式，使用程序Excel5.0計算2"(4°《"值並且針對Actina8參考基因對它們進行標準化。所使用的引物的序列是tableseeoriginaldocumentpage22耐旱性分析每種基因型的20個植物在短日照條件下生長6周，每周用營養液澆水兩次，並將它們隨積^文在不同盤上。此後對它們不澆水，12天後，對每種基因型進行代表性照相。然後重新進行澆水並在48小時後再進行代表性照相。灰葡萄孢菌(B.cinerea)感染的分析對於接種，使用在短日照條件下生長的5-6周大的植物。用5/xL終濃度為1S個孢子/mL的孢子懸浮液對六分之五的葉子/植物進行接種。接種的植物保持在高環境溼度的氣氛中，並且在接種後72小時對由真菌所引起的損傷的直徑進行測量。每種基因型使用了20個植物，並且至少進行三次實驗。酵母雙雜交篩選為了尋找OC屍3的相互作用因子，進行了酵母雙雜交篩選，使用轉化入PJ69-4a酵母菌林的載體pACTIT(Clontech)中的擬南芥的cDNA基因文庫，因而表達與GAL4(GAL4AD)激活結構域融合的蛋白。PJ69-4A酵母中表達的融合到載體pAS2-l(Clontech)中GAL4(GAL4BD)激活結構域的OC屍3的cDNA被用作引物，採用由Soellick和Uhrig所描述的方法來確定該相互作用。通過對酵母在不含組氨酸的培養基和不同濃度3-氨基三唑酸(3AT)中的生長分析來進行篩選。為了再次確認陽性克隆，從酵母中提取質粒，轉化到大腸桿菌(E.coli),對它們進行測序並且隨後再轉化到酵母，對相互作用再進行檢查。氣孔開放的測量為了確定氣孔的開放，使用在短日照條件下生長的6周大植物的完全展開的蓮座葉。首先，葉子在開放誘導(叩ening-inducing)緩衝液(10mMMes,用KOH將pH調到6.15,30mMKC1)中孵育2小時。將葉子與補充有100/iMABA(Sigma)的相同緩衝液進4亍孵育來誘導氣孔的關閉。照了IO張每種基因型的葉子的不同表皮的照片，時間和處理藉助與NikonEclipseE600顯樣麼鏡配套的NikonDXml200F數位照相機並使用Act-l軟體(Nikon)。根據Ichida等所描述的需要考慮的事項使用免費的ImageJ1.36b專欠<牛(BrokenSymmetrysoftware)進4亍測量。具有相4以結果的實驗重複5次。參考文獻1.AbeH,UraoT,ItoT,SekiM,ShinozakiK,Yamaguchi-ShinozakiK.(2003)ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling,屍/awfCe//15:63—782.Alien,G丄，Kuchitsu,K,,Chu,S.P,,Murata,Y.,Schroeder,J丄(1999)Arabidopsisandah'2-7phosphatasemutationsreduceabscisicacid-inducedcytoplasmiccalciumrisesinguardcells.屍/滅Ce//，11,17851798.3.Baker,S.S.,Wilhelm,K.S.andThomashow,M.F.(1994)The5'-regionofAfl/z'flwaccW5ahasc^-ac"wgelementsthatconfercold-,drought-,andABA畫regulatedgeneexpression.P/awfMo/.5z'o/.24，701—713.4.Choi,H.，Hong,J.,Ha,J.,Kang,J.andKim,S.Y.(2000)ABFs,afamilyofABA-responsiveelementbindingfactors.所o/.CZem.275:1723—1730.5.CoegoA,RamirezV,EllulP,MavdaE,VeraP.(2005a)TheH202-regulatedEp5Cgeneencodesaperoxidaserequiredforbacterialspecksusceptibilityintomato.PlantJ.42(2):283-93.6.CoegoA,RamirezV,GilMJ,FlorsV,Mauch陽ManiB,VeraP.(2005b)AnArabidopsishomeodomaintranscriptionfactor,OVEREXPRESSOROFCATIONICPEROXIDASE3,mediatesresistancetoinfectionbynecrotrophicpathogens.PlantCell17(7):2123-37.7.Davies,W丄andJones，H.G.(1991).jfocz、/c爿"V/屍A戸'o/ogy5z'oc力emz、^y.Oxford:BIOSScientificPublishers.8.Finkelstein，R.R.andSomerville,C.R.(1990)Threeclassesofabscisicacid(ABA)-insensitivemutationsof爿ra脇o戸、definegenesthatcontroloverlappingsubsetsofABAresponses.PlantPhysiol.94,11721179.9.GilmourSJ,SeboltAM,SalazarMP,EverardJD,ThomashowMF(2000)OverexpressionoftheArabidopsistranscriptionalactivatormimicsmultiplebiochemicalchangesassociatedwithcoldacclimation.屍/滅屍一/oZ124:1854—1865.10.HetheringtonAM.(2001)Guardcellsignalling.Ce〃107,711—714.11.Holmberg,N.andBillow,L.(1998》Improvingstresstolerancebygenetransfer.Trendsinplantscience3(2).12.IchidaAM,PeiZM,Baizabal-AguirreVM,TurnerKJ,SchroederJI.(1997)ExpressionofaCs十-resistantguardcellK+channelconfersCs+隱resistant,light-inducedstomatalopeningintransgenicJn36zW0戸j.ThePlantCell9,1843—1857.13.JeffersonR.A.,KavanaghT.A.,BevanM.W.(1987)GUSfusions,beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.6,3901-3907.14.KaffmanA,HerskowitzI,TiianR,O'SheaEK.(1994)PhosphorylationofthetranscriptionfactorPH04byacyclin-CDKcomplex,PHO80-PHO85.Science.25:263(5150):1153-6.15.Kang,J.Y"Choi,H丄，Im,M.Y"andKim,S.Y.(2002).Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestress-responsiveabscisicacidsignaling,屍toCe//14:343-35716.Kasuga，M.,Liu,Q.，Miura,S.,Yamaguchi-Shinozaki,K.，andShinozaki,K.(1999)Improvingplantdrought,salt,andfreezingtolerancebygenetransferofasinglestress-inducibletranscriptionfactor.Nat.Biotechnol.17:287-29117.Koornneef，M,,L6on-Kloosterziel，K.M.,Schwartz,S.H.,Zeevaart,J.A,D.(1998)ThegeneticandmoleculardissectionofabscisicacidbiosynthesisandsignaltransductioninJn26zW0/Jw、.屍/awf屍/i少w'o/.5z'ocAew.36,838918.L6on-KloosterzielKM，GilMA,RuijsGJ,JacobsenSE,OlszewskiNE,SchwartzSH,ZeevaartJAD,KoornneefM.(1996)Isolationandcharacterizationofabscisicacid-deficientArabidopsismutantsattwonewloci.PlantJ.10:655-66119.Leung,J.,Merlot,S,,Giraudat,J.(1997)TheJra&V/opwi爿5SCZS/CJC7Z)-/A^￡7V5777KE2(ABI2)andABIlgenesencodehomologousproteinphosphatases2Cinvolvedinabscisicacidsignaltransduction.屍/朋fCe//，9,759771.20.LiuJ,IshitaniM,HalfterU,KinCS,ZhuJ-K.(2000)ThezW/朋a/SOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiresforsalttolerance.ProcNatlAcadSciUSA97:3730-374021.McAinshM.R,,BrownleeC.,HetheringtonA.M.(1990)Abscisicacid-inducedelevationofguardcellcytosolicCaprecedesstomatalclosure.Nature.343:186-188.22.MerlotS,GostiF,GuerrierD,Vavasseur人,Gi認datJ.(2001)TheABIlandABI2proteinphosphatases2Cactinanegativefeedbackregulatoryloopoftheabscisicacidsignallingpathway.PlantJ.25(3):295-303.23.MishraG,ZhangW,DengF,ZhaoJ,WangX.(2006)AbifurcatingpathwaydirectsabscisicacideffectsonstomatalclosureandopeninginArabidopsis.Science.200614;312(5771):264-6.24.NordinK,VahalaT,PalvaET.(1993)Differentialexpressionoftworelated,low-temperature-inducedgenesinArabidopsisthaliana(L)Heynh.PlantMolBiol.21(4):641-53.25.NowakSJandCorcesVG(2000)PhosphorylationofhistoneH3correlateswithtranscriptionallyactiveloci.Gewesi)ev,14,3003—3013.26.Pei,Z.，Murata，Y.,Benning,G.Thomine,S.,Klues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技術領域：
，並且更具體地，涉及OCP3基因作為植物耐旱性調節因子的用途，以及還涉及因而得到的具有該耐旱性或乾旱耐受性增強的植物。文檔編號C12N15/82GK101535485SQ200780040183公開日2009年9月16日申請日期2007年10月29日優先權日2006年10月31日發明者巴勃羅·薇拉·薇拉,文森特·拉米雷斯·加西亞,阿爾貝託·科伊岡·岡薩雷斯申請人:卡蘭提亞生物技術有限公司