聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法

2023-07-01 13:44:06 3

專利名稱：聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法
技術領域：
本發明涉及一組石油降解菌群的固定化，尤其涉及一種採用聚氨酯泡沫為載體固定化石油降解菌群的方法，用以抵抗海水的衝刷與稀釋的幹擾、提高對石油的降解能力。
背景技術：
在全球經濟迅速發展和人口激增的情況下，海洋對人類實現可持續發展起到了重要的作用。但隨著海洋資源的開發和使用，海洋也受到了嚴重的汙染，其中石油汙染表現得尤為突出。海上石油及其產品汙染是最重要的生態學災難性汙染之一，沿海海洋石油開採和管道化以及商船運輸都是潛在的流動汙染源。石油在海面會形成一層油膜，隔絕大氣與海水的氣流交換，並減弱太陽光透入海水的能量。這種耗氧和隔絕會導致海水嚴重缺氧，並影響海洋綠色植物的光合作用。海洋石油汙染會導致魚貝藻類死亡，海濱生物結構破壞，海鳥飼餌消失。而海洋生物多樣性減少和海洋生物體內致癌物濃縮蓄積給環境和人類帶來的損害則更是無法估算。海洋石油汙染，特別是一些突發的溢油事件一旦發生，如能及時採取有效措施，損失就會小得多。在各種油汙染的清理技術中，生物修復技術以其高效安全而受推崇。這種技術的創新之處是利用微生物和其他生物將存在於海洋中的石油汙染物降解為二氧化碳和水，或轉化為無害物質，可以對大面積的汙染區域進行治理。海洋環境中存在著豐富的降解石油的微生物，在溢油後微生物數量迅速增加([9]Yakimov，Μ.Μ., Timmis, K.N., Golyshin, P.N.0bligate oil-degradingmarine bacteria[J].Current Opinion in Biotechnology,2007, 18(3):257-266.),許多石油烴化合物能被單一微生物或一個微生物群體部分或全部降解([10]McKew，
B.A.，Coulonj F.，Osborn, A.Μ.，Timmis, Κ.N.，McGenity, Τ.J.Determining the identityand roles of oi l-metabolizing marine bacteria from the Thames estuary, UK[J].Environmental Microbiology，2007，9 (I): 165-176.)。但是與實驗室條件下的純培養相t匕，石油烴在自然環境中的降解要緩慢得多，受低水溫、寡營養、海水的衝刷以及石油組分非常複雜等不利因素的影響，實際上土著微生物對石油的降解效率非常低下。已有的研究多集中在投加外源石油降解菌或改變環境因子來加速石油的微生物降解，如添加營養鹽([ll]0h, Y.S., Sim, D.0., Kimj S.K.Effects of nutrients on crude oil biodegradationin the upper intertidal zone [J].Marine Pollution Bulletin，2001，42(12):1367-1372.)、接種各種可降解汙染物的微生物([12] T，H.，H，T.，M，K.Bioremediation on theshore after an oil spillfrom the Nakhodka in the sea of Japan.1.Chemistry andcharacteristics of heavy oil loaded on the Nakhodka and biodegradation testsby a bioremediation agent with microbiological cultures in the laboratory[J].Marine Pollution Bulletin, 2000，40(4):308-314.)等。由於石油成分複雜，包括不同碳鏈長度的鏈烷烴、環烷烴、芳香烴、瀝青質等，接種單一的微生物無法將殘餘的石油完全降解，不同的微生物對不同的石油成分有不同的降解能力，或者在降解中起到不同的作用。因此接種混合的微生物對石油汙染的控制更有效，原因是微生物間存在一定的協同作用且菌群對石油的降解譜較廣。目前，國內外對這方面的研究尚處於起步階段([13]崔志松，鄭立，楊佰娟，劉倩，高偉.兩種海洋專性解烴菌降解石油的協同效應[J].微生物學報，2010，50 (3): 350-359 ; [14]Wang, H.，Xu, R.，Li, F.Efficient degradation of lubeoil by a mixed bacterial consortium[J].Journal ofEnvironmental Sciences-China,2010, 22(3):381-388.)，對石油降解菌群的構建僅僅局限於簡單的混合，缺乏一定的理論基礎。另外，在開放的海面上由於風浪、潮流等作用很難將營養和微生物與油汙緊密接觸，接種的微生物或添加的營養鹽很快就被稀釋或衝刷掉。如何解決這一難題，使微生物降解保持在一個最佳的環境中，是目前國內外海洋石油汙染生物修復技術面臨的主要挑戰。解決這一問題的關鍵就是接種「固定化微生物」。微生物細胞固定化技術由於其穩定性高、操作簡便，可固定的微生物細胞密度大並且可在放大規模下使用等優點。微生物細胞被固定化後細胞密度高、反應速度快、耐毒害能力強、產物分離容易、能實現連續操作，可以大大提高生產能力等優勢，因此在近幾十年來固定化細胞技術得到了迅速的發展和廣泛的應用。聚氨酯(polyurethane)是主鏈含-NHC00-重複結構單元的一類聚合物，由異氰酸酯(單體)與羥基化合物聚合而成。由於含強極性的氨基甲酸酯基， 不溶於非極性基團，具有良好的耐油性、韌性、耐磨性、耐老化性和粘合性。通過不同原料可製得適應較寬溫度範圍(-50 150°C)的材料，包括彈性體、熱塑性樹脂和熱固性樹脂；高溫下不耐水解，亦不耐鹼性介質。用聚氨酯泡沫(Polyurethane Foam, PUF)作為固定化載體時，其孔徑遠大於細胞尺寸，內外表面都能作為固定化吸附界面；空隙率高，便於傳質；吸油性能良好，能夠增大石油與微生物的接觸面積；載體為化學惰性，對細胞不具毒害作用([15] 0h，Y.-S.，Maeng, J.，Kim, S.-J.Use of microorganism-1mmobilized polyurethane foams to absorb and degradeoil on water surface[J].Appl microbiol Biotechnolj 2000, 54:418-423 ； [16]Quekj E., Ting, Y.-P., Tan, H.M.Rhodococcus sp.F92immobilized on polyurethane FOamshows ability to degrade various petroleum products[J].Bioresource Technology,2006,97:32-38.);聚氨酯泡沫的預處理方便，價格也較為低廉，而且其密度比水小，能夠浮在海面上方，對石油烴和微生物有較好的吸附作用。上述特點使聚氨酯泡沫成為海洋石油汙染生物修復的首選固定化材料。

發明內容
本發明的目的在於提供一種可提高石油降解率的聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法。本發明包括以下步驟:I)將聚氨酯泡沫制粒，經過沸水煮沸，除去聚氨酯泡沫中含有可能對細胞有害的聚醚類物質，烘乾；在步驟I)中，所述聚氨酯泡沫的密度可為65kg m_3 ;所述將聚氨酯泡沫制粒的粒徑可為4飛臟；所述沸水煮沸的時間可在30min以上，所述烘乾的溫度可為50 70°C。2)將經過制粒、煮沸、烘乾的聚氨酯泡沫與2216E培養基共同滅菌，接入石油降解菌群進行搖瓶培養，石油降解菌群進入或依附於聚氨酯泡沫內壁生長，形成含高密度石油降解菌群的聚氨酯泡沫。
在步驟2)中，所述2216E培養基可為:蛋白腖(Peptone) 5g，酵母提取物(YeastExtract)lg,磷酸高鐵0.lg,pH7.6 7.8,陳海水定容到1L, 121°C滅菌20min ;所述接入石油降解菌群的接種量為菌液0D600=0.1 0.3的量接入；所述搖瓶的條件可為150r/min，28°C下搖瓶培養16 24h。本發明將聚氨酯泡沫制粒後，再經過沸水煮沸，以除去泡沫中含有可能對細胞有害的聚醚類物質，之後烘乾。經過處理的聚氨酯泡沫，憑藉它孔隙大、吸附能力強、無毒副汙染、傳質傳能效果良好等特點，可以作為安全有效的吸附載體，它能在約2h內吸附已生長的石油降解菌群2.4X IOiciceIls g_\並且在實驗室搖瓶條件下，固定化石油降解菌群對柴油經過2周的降解率最高為63%。聚氨酯泡沫在震蕩中吸附游離石油降解菌群的同時，其表面也被磨成近似球狀，間接地增加其比表面積，也提高了其吸附能力。使用過的聚氨酯泡沫可通過反覆擠壓清洗、超聲波清洗、去離子水清洗及煮沸後烘乾的方法進行回收再利用，這也降低了使用成本，提高了該固定方法的經濟效益，為解決實際石油降解菌群投入海洋中效率低下的難題提供思路。聚氨酯泡沫以石油降解菌群作為吸附用細菌，將其吸附在聚氨酯泡沫內壁或孔隙中生長，防止其流失，同時為其提供了一個相對穩定的生長環境，使其發揮其最佳的生物功效。石油降解菌群的構建，將分離得到的具有柴油降解能力的單菌進行系統發育分析，並採用氣相色譜質譜聯用技術測定單菌對柴油的降解率，根據各單菌對柴油降解率的高低和降解譜及其親緣關係，構建了具有高效降解柴油能力的菌群。構建後的菌群對柴油的降解率較之單菌對柴油的降解率有顯著提高。本發明的有益效果是，採用一定密度及大小的具有強吸附能力、無毒副汙染、傳質傳能效果良好且方便廉價的聚氨酯泡沫吸附固定化石油降解菌群，使其在實際海洋石油汙染治理中的應用性能顯著提高，而且使用過後的聚氨酯泡沫通過特定處理可實現回收利用，具有良好的經濟效益。以聚氨酯泡沫作為石油降解微生物細胞的固定化載體，這種材料通過吸附殘餘在海水表面的石油為石油降解菌提供碳源，通過對降解石油的混合微生物細胞的固定可以同時降解多種石油組分。相當於建立一個流動、漂浮的生物反應器，同時又能克服或抵消海水的稀釋與衝刷的影響，維 持營養物和石油降解微生物在油水界面，使微生物降解保持在一個最佳的環境中，進而快速有效地消除油汙染。


圖1為聚氨酯泡沫固定的石油降解菌群的螢光顯微圖片(400X)。圖2為未吸附石油降解菌群的空載體內部的掃描電鏡照片(70X)。圖3為吸附石油降解菌群的載體內部的掃描電鏡照片(650X)。圖4為聚氨酯泡沫固定菌群種類的分子指紋圖譜。在圖4中，a為游離石油降解菌群；b為聚氨酯泡沫固定的石油降解菌群。圖5為新的和重複使用的聚氨酯泡沫對石油降解菌群吸附性能的比較。在圖5中，橫坐標為新的和重複使用的聚氨酯泡沫，縱坐標為聚氨酯泡沫固定化石油降解菌群數量(cells/g) ;a 為 immobilized bacteria, b 為 free bacteria。圖6為不同添加量的聚氨酯泡沫固定石油降解混合菌群的比較。在圖6中，橫坐標為聚氨酯泡沫添加的質量(g)，縱坐標為聚氨酯泡沫吸附的石油降解菌群數量(cells)。
圖7為不同質量聚氨酯泡沫固定化石油降解菌群與游離菌群對柴油降解率的比較。在圖7中，橫坐標為聚氨酯泡沫添加量(g)，縱坐標為對柴油的降解率(％)。
具體實施例方式以下的實施例是對本發明的進一步說明，但本發明不限於下述實施例。1、石油降解菌液的製備將活化後的菌液交替單胞菌(Alteromonassp.) 12C1、潮汝桿菌(Aestuariibactersp.) 12C24> 新鞘氨醇菌(Novosphingobium sp.) F2 和芽抱桿菌(Bacillus sp.) KB,按終濃度為0D600=0.3的接種量接入含100mL2216E培養基的250mL錐形瓶中，150r/min, 28 °C搖瓶培養16 24h。交替單胞菌(Alteromonassp.) 12C1、潮汝桿菌(Aestrariibactersp.) 12C24、新鞘氨醇菌(Novosphingobium sp.)F2 和芽抱桿菌(Bacillus sp.)KB均於2012年11月07日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏中心登記入冊編號分別為:CGMCCN0.6789、CGMCC N0.6790、CGMCC N0.6791、CGMCC N0.6792。2、聚氨酯泡沫的製備將聚氨酯泡沫剪成不同大小的立方體，使用前用去離子水清洗去除雜質，沸水煮30min以上，60°C烘乾至恆重，滅菌備用。聚氨酯泡沫載體使用後回收處理，將聚氨酯泡沫反覆擠壓清洗數次後，超聲波清洗lh，經去離子水清洗，煮沸30min後烘乾，回收備用。

3、聚氨酯泡沫對石油降解菌群的固定取一定質量預處理過的聚氨酯泡沫加入到含有50mL2216E培養基的250mL三角瓶中，共同滅菌，接入對數生長期的菌群，使接種量在IO9ceIlsAiL左右，150rpm, 28°C搖床中振蕩培養，獲得固定化菌體備用。2216E培養基為:蛋白腖(P印tone)5g，酵母提取物(YeastExtract) lg,磷酸高鐵0.lg, pH7.6 7.8,陳海水定容到1L, 121°C滅菌20min。4、固定化石油降解菌群對柴油的降解能力檢測將石油降解菌群吸附於聚氨酯泡沫上，固定2h後，將吸附有石油降解菌群的聚氨酯泡沫轉移至含有1% (V/V) O號柴油的麗2培養基中，28°C，150rpm搖床中避光培養兩個周，二氯甲烷萃取，氣相色譜質譜聯用技術測定其對柴油的降解率。所述MM2培養基為:硫酸亞鐵0.278mg, I摩爾磷酸二氫鉀溶液0.lmL，硫酸銨2.3g，環糊精10g，陳海水750mL，蒸餾水 250mL, ρΗ7.2，121°C滅菌 20min。圖1顯示的是固定的石油降解菌群的螢光顯微圖片，菌體大小不一，形態各異，說明菌群多樣性豐富，且能夠被吸附於聚氨酯載體表面的菌株種類較多。圖2表示空的聚氨酯泡沫載體具有疏鬆多孔的特性，孔徑大小和粗糙程度各異，孔徑與細胞尺寸相比較大，內外表面都能夠作為固定化吸附的界面，能夠作為理想的固定化載體材料。圖3表示聚氨酯泡沫對石油降解混合菌群有很好的吸附能力，能夠吸附大量的菌群於其內外表面。圖4對於石油降解菌群，聚氨酯泡沫固定的菌群與游離菌群在群落結構上完全一致，說明聚氨酯泡沫對上述4種石油降解菌都有良好的固定化能力；且條帶亮度也基本一致，可以初步判定4種石油降解菌在降解石油過程中長勢良好且一致。圖5為新的和重複使用的聚氨酯泡沫對石油降解菌群吸附性能的比較。由圖可知新的聚氨酯泡沫的吸附菌量(1.7X101(I個)略高於重複使用的聚氨酯泡沫的吸附菌量(1.5 X 101°個)。新的聚氨酯泡沫的固定化率為49.71%，與重複使用的聚氨酯泡沫的固定化率49.01%相差無幾。圖6為不同添加量的聚氨酯泡沫固定石油降解混合菌群的比較，結果顯示聚氨酯泡沫的添加量對固定的總菌數有較大影響，添加量越大則固定的菌數越多，反之亦然。圖7是不同質量 聚氨酯泡沫固定石油降解菌群與游離菌群對柴油降解率的比較，結果表明游離菌群對柴油的降解率為54%，與0.7g PUF固定的菌群降解率相近(56%)，而經
0.5gPUF固定的菌群降解率僅為38%，1.0g PUF固定的菌群降解率升高至63%。
權利要求
1.聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)將聚氨酯泡沫制粒，經過沸水煮沸，除去聚氨酯泡沫中含有可能對細胞有害的聚醚類物質，烘乾； 2)將經過制粒、煮沸、烘乾的聚氨酯泡沫與2216E培養基共同滅菌，接入石油降解菌群進行搖瓶培養，石油降解菌群進入或依附於聚氨酯泡沫內壁生長，形成含高密度石油降解菌群的聚氨酯泡沫。
2.如權利要求1所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟I)中，所述聚氨酯泡沫的密度為65kg m_3。
3.如權利要求1所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟I)中，所述將聚氨酯泡沫制粒的粒徑為4 6mm。
4.如權利要求1所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟I)中，所述沸水煮沸的時間在30min以上。
5.如權利要求1所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟I)中，所述烘乾的溫度為50 70°C。
6.如權利要求1所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟2)中，所述2216E培養基為:蛋白腖5g，酵母提取物lg，磷酸高鐵0.lg，pH7.6 7.8，陳海水定容到IL0
7.如權利要求1所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟2)中，所述接入石油降解菌群的接種量為菌液0D600=0.1 0.3的量接入。
8.如權利要求1 所述聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，其特徵在於在步驟2)中，所述搖瓶的條件為150r/min，28°C下搖瓶培養16 24h。
全文摘要
聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法，涉及一組石油降解菌群的固定化。提供一種可提高石油降解率的聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法。將聚氨酯泡沫制粒，經過沸水煮沸，除去聚氨酯泡沫中含有可能對細胞有害的聚醚類物質，烘乾，再與2216E培養基共同滅菌，接入石油降解菌群進行搖瓶培養，石油降解菌群進入或依附於聚氨酯泡沫內壁生長，形成含高密度石油降解菌群的聚氨酯泡沫。採用一定密度及大小的具有強吸附能力、無毒副汙染、傳質傳能效果良好且方便廉價的聚氨酯泡沫吸附固定化石油降解菌群，使其在實際海洋石油汙染治理中的應用性能顯著提高，且使用過後的聚氨酯泡沫通過特定處理可實現回收利用，具有良好的經濟效益。
文檔編號C02F101/32GK103114084SQ20131003170
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者田蘊, 郭倩, 範雪怡, 於楊陽, 鄭天凌 申請人:廈門大學