抗水禽細小病毒vp3蛋白單克隆抗體的製作方法

2023-06-21 13:57:01 1

專利名稱：抗水禽細小病毒vp3蛋白單克隆抗體的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及抗體工程技術，具體為涉及抗水禽細小病毒VP3 蛋白單克隆抗體。
背景技術：
水禽細小病毒主要包括鵝細小病毒(Goose parvovirus, GPV)和番鴨細小病毒 (Muscovy duck parvovirus, MDPV)，是小鵝瘟和番鴨細小病毒病的病原，均屬於細小病 毒科細小病毒屬，基因組大小約5kb，病毒粒子直徑20 22nm，無囊膜，呈二十面體對稱 (Zadori et al. ,1994,1995 ；Tatar-Kis et al.，2004)。鵝細小病毒可感染鵝和番鴨，其危害極為嚴重，在雛鵝和雛番鴨表現高發病率和 高死亡率。番鴨細小病毒僅感染番鴨，不感染鵝；是以雛番鴨為易感的急性傳染性疾病， 臨床以腹瀉、呼吸困難、腳軟、滲出性腸炎為主要症狀，也具有較高的死亡率(Takehara et al. , 1995,1998 ；Gough, 2003 Jansson et al. ,2007) 目前細小病毒感染已成為水禽養殖 業中危害最為嚴重的病原，給水禽養殖業造成巨大的損失。GPV和MDPV基因組都包括兩個開放閱讀框(Open Read Frame，0RF)，左側ORF 編碼非結構蛋白NSl和NS2，它們具有相同的終止密碼子；右側ORF編碼結構蛋白VP1， VP2和VP3，其中VPl包含了 VP2和VP3，它們使用同一終止密碼子(Zddori et al.，1994， 1995 ；Tatar-Kis et al. ,2004) VP3基因由1605bp組成，編碼534個胺基酸，分子量為 60kDa(Zadori et al. , 1995 ；Chu et al. ,2001) 鵝細小病毒與番鴨細小病毒VP3間的同 源性為85-93%以上。VP3基因是編碼病毒粒子衣殼的主要蛋白，是刺激機體產生保護性抗體的主要成 分，與病毒的毒力及致病性有關(Le Gall-Recule et al.，1996)。以MDPV VP3重組蛋白制 備特異性單克隆抗體可為水禽細小病毒的研究提供必要的試劑和技術手段，對探討VP3蛋 白在水禽細小病毒粒子形成及其致病方面具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供抗MDPV和GPV VP3蛋白單克隆抗體。本發明的單抗隆抗體是用純化的MDPV VP3重組蛋白為抗原，通過雜交瘤細胞方法 獲得的，能夠同時特異識別MDPV和GPV感染細胞病毒VP3蛋白的單克隆抗體。MDPV VP3重 組蛋白是將MDPV VP3基因克隆與原核表達載體pET-30a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表 達，純化的VP3重組蛋白。該單克隆抗體的具體製備方法如下1、根據MDPV VP3基因cDNA序列設計一對引物，通過PCR擴增得到全長VP3基 因，將MDPV P22株VP3基因克隆於原核表達載體pET-30a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導 表達VP3蛋白；進行SDS-PAGE檢測及Western blot分析鑑定後，裂解表達菌體，分離包涵 體，用pH 8.0的尿素裂解沉澱，離心後取上清經鎳親和層析過柱純化(購自Qiagen公司，Valencia, CA公司)，將純化後蛋白用6mol/L尿素進行梯度透析復性獲得VP3重組蛋白。2、用MDPV VP3重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行 細胞融合，以HAT培養基(購自Invitrogen公司)選擇性培養後，經VP3重組蛋白和His 蛋白進行雙重ELISA篩選和有限稀釋法克隆化，獲得分泌抗VP3蛋白單克隆抗體的雜交瘤 細胞株2D5 ；將雜交瘤細胞注BALB/c小鼠誘生腹水，對獲得抗VP3蛋白單克隆抗體特性進 行鑑定。3、以ELISA測定抗VP3蛋白單克隆抗體的腹水效價，間接免疫螢光鑑定抗VP3蛋 白單克隆抗體與MDPV和GPV病毒蛋白的反應性和特異性，用單克隆抗體亞型測定試劑盒 (Zymed Laboratories, Inc.)鑑定抗VP3蛋白單克隆抗體的Ig亞類。本發明的優點是(1)本發明提供的MDPV VP3重組蛋白製備方法簡單，純度高； (2)本發明提供抗MDPV和GPV VP3蛋白的單克隆抗體特異性強，製備方法簡單；(3)抗 MDPV/GPV VP3蛋白單克隆抗體可用於VP3蛋白結構和功能研究。具體地，在一個方面，本發明提供分泌抗水禽細小病毒VP3蛋白單克隆抗體的雜 交瘤細胞系，其保藏號為CGMCC No. 3671。另一方面，本發明提供針對水禽細小病毒VP3蛋白的單克隆抗體，其由保藏號為 CGMCC No. 3671的雜交瘤細胞系分泌。再一方面，本發明提供用於治療水禽細小病毒病的藥物組合物，其包含上述定義 的單克隆抗體。在另一個發明，本發明提供用於治療水禽細小病毒病的試劑盒，其包含上述定義 的單克隆抗體。在另一個方面，本發明提供上述定義的單克隆抗體在製備用於治療水禽細小病毒 病的藥物中的應用。在又一個方面，本發明涉及所述單克隆抗體在製備檢測水禽細小病毒病的要求中 的應用。在本發明上述技術方案的優選實施方案中，所述水禽細小病毒病是鵝細小病毒病 或番鴨細小病毒病。雜交瘤細胞株2D5，於2010年3月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，100101)，保藏號為CGMCC No. 3671。


圖1為MDPV VP3重組表達質粒pET30a_VP3的鑑定圖，泳道1是質粒pET30a_VP3 的PCR結果；泳道2和3是2kb DNA ladder ；泳道4是質粒pET30a_VP3的Bam Hl/Sall酶 切鑑定產物。圖 2 為 MDPV VP3 表達蛋白的 SDS-PAGE (A)和 Western blotting (Bi 和 B2)鑑定 圖，其中泳道1、5和8是蛋白質Marker，泳道2是BL21 (DE3)/pET30a_VP3誘導表達菌體， 泳道3是BL21 (DE3) /pET-30a誘導表達菌體，泳道4是純化的VP3重組蛋白；泳道6和7分 別是BL21 (DE3) /pET30a-VP3和BL21 (DE3) /pET_30a誘導表達菌體在番鴨抗MDPV陽性血清 下的 Western blotting 結果；泳道 9 和 10 分別是 BL21 (DE3)/pET30a_VP3 和 BL21 (DE3) / pET-30a誘導表達菌體在番鴨抗GPV陽性血清下的Western blotting結果。
圖3為抗VP3蛋白單克隆抗體的IFA鑑定圖，圖中MDPV、GPV和Negative分別是 單克隆抗體2D5與MDPV和GPV感染及正常鴨胚成纖維細胞(DFl)的反應結果。
具體實施例方式實施例1. MDPV VP3重組蛋白的製備根據MDPV序列設計引物，PCR擴增MDPV VP3基因，將其克隆於原核表達載體 PET-30a，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導表達MDPV VP3蛋白；收集表達菌體，凍融 3次後，離心分離包涵體，用pH 8. 0的尿素裂解沉澱，經鎳親和層析純化，獲得MDPV VP3重 組蛋白，最後該蛋白經6M尿素進行梯度透析復性。1). VP3重組表達質粒的構建根據MDPV VP3核苷酸序列(SEQ ID NO 1)設計合成特異性引物，上遊引物pVP3F 5'-TTT GGATCC ATGGCAGAGGGAGGAAGCGGAGCTA-3，(SEQID NO :2，下劃線為 Bam Hl 位點)，下 遊引物 PVP3R :5，-GGGGTCGACTTACAGATTCTGAGTC-3』 (SEQID NO :3，下劃線為 Sal I 位點)。 以PCR從MDPV P22株(哈爾濱獸醫研究所提供)反轉錄的cDNA中擴增VP3基因(PCR反 應條件為94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 3min，32 個循環；72°C延伸 lOmin，4°C保 存。)pET30a(購自Novagen公司)經BamHl/Sall雙酶切消化後，將擴增的VP3基因連接到 原核表達載體pET-30a的BamHl/Sall位點間，轉化大腸桿菌ToplO，提取轉化細菌的質粒， 以PCR鑑定重組表達質粒(圖1)，經序列測定驗證，獲得VP3重組表達質粒pET-30a-VP3。陽 性重組表達質粒pET-30a-VP3轉化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Invitrogen公司)，SDS-PAGE 和Western blotting表明，表達的72kDa重組VP3蛋白均可被鵝和番鴨細小病毒陽性血清 所識別(圖2)，其中鵝和番鴨細小病毒陽性血清是分別利用由哈爾濱獸醫研究所提供的鵝 小病毒GPV-2T和番鴨細小病毒MDPV P22株免疫番鴨製備，即分別將純化的100 μ g GPV和 MDPV與弗氏佐劑等比例混合，充分乳化，製備免疫抗原，免疫4周齡番鴨。免疫3次，每次 IOOyg/每隻(0.2mL)；第一次以弗氏完全佐劑免疫抗原，肌肉注射；間隔14天，用弗氏不 完全佐劑免疫抗原進行第二次免疫；間隔14天，用不加佐劑的免疫抗原進行三免，肌肉注 射；免疫10天後，採血，分離鵝和番鴨細小病毒陽性血清。2). MDPV VP3重組蛋白的表達與純化以氯化鈣法將重組表達質粒pET-30a-VP3轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，取陽性克隆 用LB液體培養基(含50 μ g/mL Kan)，37°C 250r/min振蕩培養過夜，次日按1 100的比 例接種於含IOmL新鮮LB培養基IOOmL錐形瓶中，37°C 300r/min振蕩培養，當OD6tltl = 0.6 時，加入終濃度為ImM IPTG誘導表達2h，4°C 12000r/min離心30sec，收集菌體，凍融三次， 40C 12000r/min離心lOmin，SDS-PAGE分析裂解菌體的上清和沉澱，分析VP3蛋白的表達情 況。加入5倍體積8M尿素溶解沉澱，振蕩至溶液澄清，4°C 12000r/min離心lOmin，棄沉澱， 上清轉移至鎳離子親和層析柱中(購自Qiagen公司，Valencia，CA)，振蕩lh，由pET_30a 表達的帶有His標籤的VP3表達蛋白與鎳離子螯合，先後用2倍體積柱床體積pH = 8. 0的 8M尿素溶液，3倍柱床體積pH = 6. 3的8M尿素，3倍柱床體積pH = 5. 9的8M尿素和5倍 柱床體積pH = 4. 5的8M尿素洗脫柱床，收集洗脫液Iml/管；用SDS-PAGE分析洗脫液，經 6mol/L尿素進行梯度透析復性，獲得高純度的VP3重組蛋白。實施例2.抗VP3蛋白單克隆抗體的製備
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用等量弗氏佐劑(Sigma公司)乳化純化的IOOug VP3重組蛋白，免疫6周齡雌 性BALB/c小鼠，15天後用不完全弗氏佐劑(Sigma公司)乳化等體積蛋白進行二次免疫， 二次免疫後十天斷尾採血用ELISA方法檢測小鼠血清效價，此時小鼠血清效價已經明顯上 升，經第三次免疫後檢測小鼠血清效價，陽性值達1.0以上，P/N大於10時取其脾細胞與骨 髓瘤細胞SP2/0在聚乙二醇(Invitrogen公司)作用下進行細胞融合，用HAT培養基(購 自Invitrogen公司)進行選擇性培養；以純化的VP3重組蛋白和His蛋白(購自KPL)為 檢測抗原，用雙重ELISA方法對雜交瘤細胞培養上清進行篩選，陽性雜交瘤經連續5次有限 稀釋法克隆化，獲得穩定分泌抗VP3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株2D5，將其於2010年3 月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，100101)，保藏號為CGMCC No. 3671 ；將雜交瘤細胞注入致敏小鼠腹腔誘生腹水， 獲得抗MDPV VP3蛋白單克隆抗體2D5。具體如下。1).小鼠免疫分別將純化的MDPV VP3重組蛋白與弗氏佐劑等比例混合，充分乳化，製備VP3免 疫抗原，免疫6周齡BALB/c小鼠8隻(購自哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心)。免疫3次， 每次IOOyg/每隻(0. 2mL)；第一次以弗氏完全佐劑免疫抗原，背部皮下多點注射；間隔20 天，用弗氏不完全佐劑免疫抗原進行第二次免疫，腹腔注射；間隔20天，用不加佐劑的VP3 免疫抗原進行三免，肌肉注射；免疫15天後，尾靜脈採血，以VP3重組蛋白為檢測抗原，用間 接ELISA方法測定免疫小鼠血清的抗體水平，免疫小鼠抗體滴度達到1 4000以上，表明 小鼠獲得良好免疫效果。2).雜交瘤細胞株的建立i)細胞融合細胞融合前3天，以不加佐劑的VP3重組蛋白尾靜脈注射小鼠，每隻 100 μ g(0. ImL)，無菌取脾臟，分離脾細胞，計數後按5 1的比例與SP2/0骨髓瘤細胞 (2 X IO7)混合，在PEG4000作用下進行細胞融合(《實用免疫學》，楊廷彬主編，長春出版社， 1994年12月出版)；用HAT選擇培養基(購自Invitrogen公司)重懸，置5% CO2 37°C進 行選擇性培養，5天後半量換液，10天後改為HAT培養基(購自Invitrogen公司)。待細胞 克隆長至1/4-1/2培養孔時，取細胞培養上清檢測分泌抗體。ii).雜交瘤細胞篩選分別用純化的VP3重組蛋白和His蛋白(購自KPL公司)作為檢測抗原，對雜交 瘤細胞培養上清中的分泌抗體進行雙重ELISA檢測，篩選陽性雜交瘤細胞。用0. 05M碳酸 鹽包被緩衝液(PH9. 6)稀釋純化的VP3重組蛋白或His蛋白，按100 μ L 0. 045g/孔加入酶 標板中，37°C包被Ih後轉入4°C過夜；用含0. 05%吐溫20的PBS緩衝液(PBST)洗滌3次， 加5%脫脂奶粉37°C封閉lh，每孔加入雜交瘤細胞培養上清100μ L，37°C孵育2h ；PBST洗 3次，加入1 5000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗小鼠IgG抗體(購自北京中 杉金橋生物技術有限公司)，37°C孵育lh，PBST洗4次，加入顯色底物OPD-H2O2 (購自北京 中杉金橋生物技術有限公司)，避光反應IOmin後，用2M H2SO4終止反應，用酶標儀讀取OD49tl 值，以與陰性OD49tl值的比值大於2. 1判為陽性。VP3重組蛋白陽性而His蛋白陰性檢測的 雜交瘤細胞孔為陽性克隆。iii).有限稀釋法克隆化獲得雜交瘤細胞系和保藏
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用HT培養基將雜交瘤細胞稀釋至20個/ml，每孔0. Iml接入96孔培養板，細胞含 量分別為2個/孔和1個/孔，置5% C023 7°C培養，5-7天觀察細胞克隆生長情況，選取單 克隆生長孔細胞上清，以ELISA檢測分泌抗體；對陽性克隆進行連續5次克隆，獲得穩定分 泌抗VP3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株2D5，使其抗體分泌陽性率達95%以上。雜交瘤 細胞株2D5擴大培養，500轉/分鐘離心5分鐘，收集細胞培養上清，將細胞沉澱用37°C提 前預熱的DMEM凍存液(含7份DMEM+2份血清+1份二甲亞碸)重懸，每管2ml分裝，-70°C 凍存細胞。該雜交瘤細胞株於2010年3月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCC-3671。3).抗VP3蛋白單克隆抗體2D5的製備。成年雌性BALB/c小鼠經0. 2ml/只降植烷腹腔注射，致敏1周後，腹腔注射雜交瘤 細胞2D5懸液5 X IO6-I X IO7, 7-10天後採集腹水，12000g離心5min，收集上清。上清加入 等量 PH7. 2 巴比妥緩衝鹽水(VBS ；0. 004mol/L 巴比妥，0. 15mol/L NaCl, 0. 8mmol/L Mg2+， 0. 3mmol/L Ca2+)稀釋；每IOml稀釋腹水中加150mg 二氧化矽(Sigma公司)，混勻，懸液在 室溫孵育30分鐘，搖動；2000g離心20分鐘，即得到澄清的單克隆抗體2D5腹水，_70°C凍 存。4).抗VP3蛋白單克隆抗體2D5的腹水效價的測定。首先抗VP3蛋白單克隆抗體2D5腹水用PBS緩衝液1000倍稀釋，然後倍比稀釋， VP3重組蛋白(2 μ g/ml) 100 μ L/孔包被的酶標板(購白Corning公司)，37°C孵育2h ；加 入倍比稀釋(1 2000)的抗VP3蛋白單克隆抗體2D5腹水100μ 1，37°C孵育lh，PBST洗 滌3次後加入1 5000稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG抗體，37°C孵育lh，PSBT洗滌後，加 入顯色底物OPD-H2O2 (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，避光反應lOmin，用2M H2SO4 終止反應，用酶標儀讀取OD49tl值，以與陰性OD49tl值比值大於2. 1判為陽性，以陽性孔的最大 稀釋度為抗VP3蛋白單克隆抗體2D5腹水效價。結果測得單克隆抗體2D5腹水的ELISA效 價分別為:6·4Χ10_7。實施例3.抗VP3蛋白單克隆抗體2D5的特性鑑定以純化VP3重組蛋白為檢測抗原用間接ELISA方法測定抗VP3蛋白單克隆抗體 2D5的腹水效價；以間接免疫螢光鑑定抗VP3蛋白單克隆抗體2D5與MDPV/GPV病毒蛋白的 反應性和特異性；用Zymed Laboratories，Inc公司亞型測定試劑盒鑑定抗VP3蛋白單克隆 抗體2D5重鏈和輕鏈的Ig亞型。i).抗VP3蛋白單克隆抗體2D5與水禽細小病毒的反應性和特異性鑑定以間接免疫螢光測定抗VP3蛋白單克隆抗體與MDPV和GPV病毒蛋白的反應性和 特異性。雞胚成纖維細胞DFl經MDPV和GPV病毒(由哈爾濱獸醫研究所提供)感染24h， PBS洗兩次；100 μ 1/孔加入甲醇固定，Ih後棄固定液，分別加入單克隆抗體2D5的細胞培 養上清，100μ1/孔，37°C孵育lh;PSB洗滌3次，加入1 100稀釋的FITC標記羊抗鼠 IgG抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，37°C孵育30min ；PBS洗滌後，加入PBS 100 μ 1，螢光顯微鏡觀察並照相。結果單克隆抗體2D5株均特異識別MDPV和GPV病毒VP3 蛋白(圖3)。ii).抗VP3蛋白單克隆抗體的Ig亞型測定。利用Zymed Laboratories, Inc.公司亞型測定試劑盒測定抗VP3蛋白單克隆抗體
7Ig亞型。結果顯示，單克隆抗體4E5的重鏈為IgGl，輕鏈均為κ。參考文獻Zadori Z,Erdei J,Nagy J,Kisary J. Characteristics of the genome of goose parvovirus. Avian Pathol. 1994. 23，359—364.Zadori Z， Stefancsik R， Rauch T， Kisary J.Analysis of the complete nucleotide sequences of goose and muscovy duck parvoviruses indicates common ancestral origin with adeno—associated virus 2. Virology 1995. 212,562-573.Tatar-Kis TiMato TiMarkos BiPalya V. Phylogenetic analysis of Hungarian goose parvovirus isolates and vaccine strains. Avian Pathol. 2004. 33,438-444.Chu CY, Pan MJ,Cheng JT. Genetic variation of the nucleocapsid genes of waterfowl parvovirus. J. Vet. Med. Sci. 2001. 63，1165-1170.Le Gall-ReculeG,Jestin V,Chagnaud PiBlanchard P，Jestin A. Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3)in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins. J. Gen. Virol. 1996. 77，2159-2163.Takehara K，Ni shio T，Hayashi Y，Kanda J，Sasaki M，Abe N，Hiraizumi M， Saito S，Yamada TiHaritani M. An outbreak of goose parvovirus infection in Japan. J. Vet. Med. Sci. 1995. 57，777-779.Gough RE. Goose parvovirus infection. In :Saif YM, Barnes HJ, Glisson JR, Fadly AM，McDougal LR, Swayne DE. (Eds·)，Diseases of Poultry. Ilth ed. Iowa State Univ. Press, Ames，IA，2003. pp. 367—374.Jansson DS, Feinstein R，Kardi V，MatoT, Palya V. Epidemiologic investigation of an outbreak of goose parvovirus infection in Sweden. Avian Dis. 2007. 51,609-613.
權利要求
分泌抗水禽細小病毒VP3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其保藏號為CGMCC No.3671。
2.針對水禽細小病毒VP3蛋白的單克隆抗體，其由保藏號為CGMCCNo.3671的雜交瘤細 胞系分泌。
3.用於治療水禽細小病毒病的藥物組合物，其包含權利要求2所述的單克隆抗體。
4.權利要求3的藥物組合物，其中所述水禽細小病毒病是鵝細小病毒病或番鴨細小病毒病。
5.用於治療水禽細小病毒病的試劑盒，其包含權利要求2所述的單克隆抗體。
6.權利要求2所述的單克隆抗體在製備用於治療水禽細小病毒病的藥物中的應用。
7.權利要求6的應用，其中所述水禽細小病毒病是鵝細小病毒病或番鴨細小病毒病。
8.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測水禽細小病毒病的藥物中的應用。
9.權利要求8的應用，其中所述水禽細小病毒病是鵝細小病毒病或番鴨細小病毒病。 全文摘要
本發明涉及一種抗水禽細小病毒VP3蛋白單克隆抗體細胞株2D5，其保藏號是CGMCC No.3671。本發明還涉及所述細胞株分泌的單克隆抗體，及其應用。
文檔編號C07K16/08GK101914499SQ20101024609
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者劉明, 張雲, 李娜, 王笑梅 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所