對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法
2023-06-21 20:25:31
專利名稱：對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法
技術領域：
本發明屬於對蝦抗病品種選育技術領域，具體地涉及一種對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法。
背景技術：
對奸白斑綜合症病毒(White Spot Syndrome virus, WSSV)於1992年首次發現於臺灣(Chou HY, Huang CY, Wang CH, et al. Pathogenicity of a baculovirus infectioncausing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases ofAquatic Organisms，1995，23 :165 173)，並迅速在世界範圍的養殖對蝦中發現該病毒(Inouye K，Miwa S，Oseko N，et al. Mass mortalities of culture Kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993. Fish Pathology. 1994,29 :149 158/ 黃健，於佳，宋曉玲，等.1994年浙江省對蝦暴發性流行病病原及傳播途徑的初步調查.海洋水產研究，1995，16 (I) :91 98/Jory D. E. &Dixon H. M. Shrimp white spot virus in thehemisphere. Aquaculture Magazine 1999，25，83-91.)。在諸多病原當中，WSSV 是對蟲下養殖過程中最為肆虐的病毒類疾病，具有傳播快、流行面廣、死亡率高、防治困難等特點，嚴重製約對蝦養殖業的健康發展。每年由該病毒給對蝦養殖業造成的經濟損失高達幾百億元，嚴重威脅對蝦養殖業的可持續發展。1995年，世界動物衛生組織(OIE)、聯合國糧農組織(FAO)以及亞太地區水產養殖發展網絡中心(NACA)將其列為需要報告的水生動物病毒性疫病之一。為改良生產性狀、解決各種病害問題，抗病新品種的選育越來越被國家和遺傳育種學家所重視。在選育過程中一個非常重要的環節就是用人工感染病毒的方法測試選育對象的抗病性能。一般人工感染方法主要有三種，分別為浸浴病毒懸液(Momoyama K，et al. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp，Penaeus japonicus，in Japanin 1993 histopathological study. Fish Pathology. 1994,29 :141-148/Nakano H，et al. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp，Penaeus japonicus，in Japanin 1993 epizootiological survey and infection trials. Fish Pathology. 1994,29 :135_139/Chou HY, et al. Pathogenicity of a baculovirus infection causingwhite spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of AquaticOrganisms, 1995, 23 165 173)、人工注射病毒粗提液(Momoyama K，et al. Massmortalities of cultured kuruma shrimp， Penaeus japonicus， in Japan in 1993 histopathological study. Fish Pathology. 1994,29 141-148/Nakano H，et al.Massmortalities of cultured kuruma shrimp， Penaeus japonicus， in Japan in 1993 epizootiological survey and infection trials. Fish Pathology. 1994，29 :135-139/Chou HY, et al. Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spotsyndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases ofAquatic Organisms，1995,23 :165 173)以及整池粗放式投餵毒餌。其中人工注射方法會對測試個體本身造成創傷，影響結果的真實性；同時，浸浴病毒懸液和人工注射病毒粗提液的方法由於與自然環境中病毒侵染宿主的路徑不同，導致對蝦自身產生的防禦機制及結果會有差異；另外，病毒粒子一旦離開宿主處於游離狀態，4小時後失去致病力(何建國，莫福.對蝦白斑綜合症病毒暴發流行與傳播途徑、氣候和水體理化因子的關係及其控制措施.中國水產，1999，7
34-37)，因此不建議在育種過程中採用這兩種感染方式。整池粗放式投餵毒餌的方法是將測試個體全部放於測試池中， 停食1-3天後，全池投餵含病毒餌料，並隨時撈取、記錄死亡個體時間、數量、體重等信息。由於不同對蝦個體攝食能力不同，全池投餵毒餌後不能保證每尾對蝦攝食毒餌量相同，如有的對蝦可能反覆多次攝食毒餌；體弱、個小的蝦搶食量少或吃不到；蛻皮蝦不攝食；已蠶食同類而飽胃的蝦也可能不攝食；這種狀況會大大增大抗病性能測試過程中的條件誤差而使選育效果不理想。另外，由於對蝦體色、腸胃透明，一般由病蝦組織製備的毒餌經攝食後仍與對蝦體色相同，導致極易錯誤判斷人工感染過程中對蝦個體是否攝食毒餌，使測試數據不準確。此外，如果將存活對蝦直接用於留種親蝦，在不知對蝦是否仍攜帶病毒的情況下對整個育種系統存在潛在危險。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法，以解決目前對蝦抗病性能測試過程中不能等量、定量感染、不能控制對蝦攝食量、不能準確分辨對蝦是否攝食毒餌、不明確存活對蝦是否可以安全用於育種等無法避免的問題，從而實現中國對蝦抗WSSV性能測試的準確性、高效性，克服現有技術的不足。本發明是按如下技術方案實現的對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法，包括I)、毒餌製備；2)、抗WSSV性能測試；3)、數據及樣品採集；4)、確定留種親本，具體步驟如下I)、毒餌製備(I)毒餌病毒含量檢測人工感染所用毒餌為經WSSV感染致死、具明顯白斑症候群症狀的對蝦；分別取5mg肌肉組織提取基因組DNA並進行核酸濃度測定、TaqMan實時螢光定量PCR法進一步確定感染病毒種類並檢測病毒拷貝數，選取病毒拷貝數相同的對蝦用作製備毒餌，根據實際人工感染需要，計算出特定重量肌肉組織中病毒拷貝數；(2)染色毒餌製備取經螢光定量PCR確定病毒且病毒含量相同的對蝦，去除其頭胸部、附肢和甲殼後，僅使用肌肉組織，稱重後按lOiil/g加入可食用紅色素，在充分預冷的組織勻漿機中攪勻，製成病毒量均一、顏色醒目的毒餌，毒餌製備過程必須在低溫環境中快速進行，色素與毒餌混合後在海水中不變色、不發散，可供對蝦抱食、且便於觀察；2)、抗WSSV性能測試(I)等量人工感染選取規格整齊、體質健康的對蝦為測試對象，將待測試對蝦分別置於透明塑料容器中飢餓2小時後，將現製備的毒餌置於有冰層的託盤中，用鑷子夾取特定重量毒餌輕輕送至對蝦口器處，對蝦抱食，10-15分鐘後觀察，可見攝食毒餌的對蝦胃及腸道呈現鮮豔的紅色，未攝食毒餌的對蝦胃及腸道無色，挑選抱食完畢的對蝦放入測試池內；測試池所用器皿、工具嚴格與對照池、暫養池區分，用後及時用50ppm有效氯消毒；⑵對照池對蝦人工感染測試必須設置對照池，即投餵經螢光定量PCR檢測後不含WSSV病毒、且經與毒餌等量可食用紅色素染色的鮮蛤肉；3)、數據及樣品採集感染完備後，測試池和對照池正常投餌、換水，觀察對蝦死亡情況，從出現第一尾對蝦死亡開始，隨時撈出死亡對蝦並記錄其存活時間、體長、體重、性別、家系編號，並於-80°C保存死亡對蝦；待對蝦狀態穩定、不再有對蝦死亡後，將所有存活對蝦轉入新池繼
續養殖；4)、確定留種親本感染測試後存活的對蝦，在作為留種親本進入遺傳育種中心前，必需進行活體取樣檢測病毒含量，病毒含量低於陰性對照組的個體作為留種親本，同時根據需要選取存活時間較長家系的備份留種。進一步，所述的步驟4中活體取樣檢測病毒含量的步驟為首先用70%酒精消毒待取樣附肢、解剖剪、鑷子，並在眼柄處套上帶有編號的環狀眼標用作個體間標識，然後用酒精噴燈將解剖剪燒紅，快速剪取1/3-1/10附肢置於乾淨的印pendorf管中，同時用解剖剪將附肢剪口部位燙白，最後將對蝦放入1-3%氟苯尼考藥浴的乾淨池中，完成活體取樣；然後提取附肢基因組DNA並進行核酸濃度測定、TaqMan實時螢光定量PCR法檢測病毒拷貝數，挑選未攜帶病毒或病毒含量低於背景值的存活對蝦用於留種親蝦，所述的背景值為38個PCR循環時陰性對照樣品的檢測值。進一步，在所述的等量人工感染過程中所用的鑷子為不帶橫紋的尖頭鑷子。本發明與現有技術對比的有益效果(I)由於對蝦體色、腸胃透明，一般由病蝦組織製備的毒餌經攝食後仍與對蝦體色相同，很難辨認是否攝食毒餌。本發明使用經鮮豔的紅色食用色素染色的毒餌投餵測試對蝦，對蝦攝食後，胃及腸道都會呈現醒目的粉紅色，非常容易辨認，從而可以正確剔除未攝食毒餌對蝦，易操作、數據可靠。(2)本發明可實現對蝦人工感染的定量、可控、無傷害。不同個體、同一個體的不同組織(鰓、肝胰腺、心臟、附肢、肌肉)病毒含量差異非常大(可相差10-1000倍)，粗放式人 工感染無法控制每尾對蝦的攝食量、攝食部位和攝食次數，對某些個體來說可能造成未感染、多次感染和攝食部位不同而感染差異大等現象。注射感染雖然可以控制注射的病毒量，但會造成對蝦體本身的傷害而影響測試結果。另外，注射感染和浸浴感染都使用病毒提取液進行，離開宿主的游離病毒會很快失活，導致感染失敗或數據不準確。本發明使用新鮮製備的病蝦組織，去除頭胸部、甲殼及所有附肢後，僅使用軀幹部位的肌肉組織製備毒餌，並準確定量用作製備毒餌的每尾對蝦的肌肉組織，保證了感染源的同一性。本發明還可根據需要控制投餵的毒餌量，如IO3病毒拷貝、IO5病毒拷貝，或設置I次、2次感染，簡單、準確、可控。(3)本發明對存活的對蝦進行病毒攜帶量檢測，挑選未攜帶病毒或病毒含量低於背景值的存活對蝦用於留種親蝦。保證了育種系統的安全。取樣過程輕、快、準，取樣量少，對蝦體本身造成的傷害小，可順利養成至親蝦規格。
圖I :人工投餵染色毒餌過程中蝦胃及腸道的顏色變化a.未攝食毒餌對蝦；b.正在攝食經染色毒餌的對蝦；c.已攝食毒餌的對蝦；d.感染完畢後放入測試池中的對蝦。
具體實施例方式下 面通過實施例詳細敘述本發明的技術內容。本實施例以中國對蝦為例證實人工感染病毒的可控、等量、定量、安全。實施例I比較攝食不同含量病毒的對蝦存活狀況實驗用中國對蝦為2010年山東省青島市岙山衛「中國對蝦遺傳育種中心」培育的「黃海2號」仔蝦320尾，體長2-3cm，於山東省海陽黃海水產有限公司海珍品養殖基地進行人工感染WSSV測試，包括I)、毒餌製備；2)、抗WSSV性能測試；3)、數據及樣品採集；具體方法步驟如下I)、毒餌製備(I)毒餌病毒含量檢測為了實施對蝦的抗病性能測試，首先需要製備已知病毒含量的毒餌。挑選經WSSV感染致死、具有明顯白斑症候群症狀的染病對蝦(-80保存或剛死亡對蝦)，使用解剖刀取肌肉組織5mg提取基因組DNA。基因組DNA模板可以用常規的組織核酸提取方法製備，也可用商品化的組織DNA提取試劑盒製備。本發明中採用北京博邁德「基因組DNA快速提取試劑盒」進行樣品DNA的提取和純化，製備DNA模板的詳細操作步驟參見該試劑盒的使用說明書。使用核酸測定儀GeneQuant Pro (Amersham)測定核酸濃度，製備成核酸終濃度為IOOng/ii I病毒DNA模板。病毒檢測所需引物、探針序列參考Durand andLightner(Durand S V,Lightner D V. Quantitative real time PCR for the measurementof white spot syndrome virus in shrimp. J Fish Dis, 2002,25 :381-389),目標片段長度為69bp，引物及探針由大連寶生物(TaKaRa)合成。病毒定量檢測使用美國AB公司的7500型螢光定量PCR儀。PCR反應體系為20 u L，包括I X體積的Perfect Real Timepremix (RR039A, TaKaRa)、正反向弓 I物各 0. 25 u mol/L、探針 0. 125 u mol/L、病毒 DNA 75ng、滅菌雙蒸水補足體積。PCR反應參數為95°C預變性10s ;95°C變性5s，60°C退火及延伸34s ;共40個PCR循環，在退火及延伸過程中採集螢光信號。標準品為含有目的片段的重組質粒PUCm-T/WSSV69，用作陽性對照及標準曲線的構建。樣品平行檢測2_3次，病毒含量值為I. 2X IO5Copy/ V- I,計算5mg、10mg、20mg肌肉組織中病毒拷貝數分別為5. 2X IO8Copy>1.0X 109copy、2. I X IO9Copy0(2)染色毒餌製備取經螢光定量PCR確定病毒且病毒含量相同的對蝦，去除其頭胸部、附肢、甲殼及體表多餘水分後，僅使用肌肉組織，稱重後按10 iU/g加入草莓紅食品級天然紅色素(廣州市天陽泰天然色素有限公司)，在充分預冷的組織勻漿機中攪勻，製成病毒量均一、顏色醒目的毒餌。毒餌製備過程必須快速在低溫環境中進行，色素與毒餌混合後在海水中不變色、不發散，可供對蝦抱食、且便於觀察；2)、抗WSSV性能測試(I)等量人工感染
選取規格整齊、體質健康的對蝦為測試對象，將測試對蝦隨機分為4組，每組80尾，分別置於透明塑料容器中(底面直徑X高=IOcmX 15cm)，容器內水位高5cm。飢餓2h後，將現製備的毒餌置於有冰層的託盤中，分別用5mg、10mg、20mg毒餌(測試組)和染色鮮蛤肉(對照組)投餵4組測試對蝦。用不帶橫紋的尖頭鑷子夾取毒餌輕輕送至對蝦口器處，對蝦抱食(圖Ib)。約15分鐘後觀察，可見攝食毒餌的對蝦胃及腸道呈現鮮豔的紅色(圖Ic)，未攝食毒餌的對蝦胃及腸道無色(圖Ia)。挑選抱食完畢的對蝦分別放入4個測試水族箱(圖Id)，因蛻皮等原因未攝食對蝦放回暫養池等待再次測試。測試池所用器皿、工具嚴格與對照池、暫養池區分，用後及時用50ppm有效氯消毒。(2)對照池對蝦人工感染測試必須設置對照池，即投餵經螢光定量PCR檢測後不含WSSV病毒、且經與毒餌等量草莓紅食品級天然紅色素(廣州市天陽泰天然色素有限公司)染色的鮮蛤肉。3)、數據及樣品採集(I)日常管理感染完備後，正常投館、換水，每天吸底I次、換水I次(換水量40-70% );每6小時投餌一次，一天共計4次，分別投餵配合餌料、活滷蟲、鮮蛤肉、配合餌料。按照體重計算，投餵量為配合飼料1_2%，活滷蟲、鮮蛤肉等鮮活飼料10-15%。(2)信息收集注意觀察對蝦死亡情況，從出現第一尾對蝦死亡開始，隨時撈出死亡對蝦並記錄存活時間、體長、體重、性別、家系編號，並於-80°C保存死亡對蝦。待實驗池內對蝦狀態穩定，統計4組對蝦生存狀況。人工感染後第13天(300小時)時，20mg毒餌組對蝦全部死亡，IOmg毒餌組對蝦存活率52. 05%，5mg毒餌組對蝦存活率82. 18% ;人工感染後26天(608小時)時測試結束，20mg毒餌組對蝦平均存活時間為187. 33±47. 99小時，IOmg毒餌組對蝦平均存活時間為323. 29± 134. 05小時，5mg毒餌組對蝦平均存活時間為389. 27±98. 32小時。攝食不同病毒含量的對蝦存活時間差異顯著(P < 0. 01)。實施例2留種家系的選擇及親本病毒攜帶量檢測實驗用中國對蝦為2011年山東省青島市岙山衛「中國對蝦遺傳育種中心」培育的「黃海2號」家系，共計104個家系，每家系隨機選取60尾，體長2-3cm，進行VIE (visibleimplant elastomer)突光標記後暫養,2天之後轉移至山東省海陽黃海水產有限公司海珍品養殖基地進行人工感染WSSV測試，包括I)、毒餌製備；2)、抗WSSV性能測試；3)、數據及樣品採集；4)、確定留種親本，具體步驟如下I)、毒餌製備(I)毒餌病毒含量檢測方法同實施例I。病毒含量檢測值為I. 6X IO5Copy/iU，計算出5mg肌肉組織中病毒拷貝數為6. 8 X IO8Copy。(2)染色毒餌製備方法同實施例I。2)、抗WSSV性能測試方法同實施例I。投餵毒餌量全部為5mg/尾。3)、數據及樣品採集方法同實施例I。大規模人工感染測試從2011年7月I日開始到8月5日結束，共進行36天，每尾對蝦攝食毒餌5mg (6. 8 X 108copy)。在人工感染48小時後開始有個別對蝦出現白斑綜合症的典型症狀，行動遲緩、攝食量減少，甲殼出現直徑為0. 5-2. Omm的白色斑點。第六天(140小時)出現死亡高峰，累計死亡率為61. 40%。第13天(300小時)後對蝦死亡速度越來越慢,基本不再死亡。4)、確定留種親本感染測試後15天，測試對蝦狀態穩定，有59尾對蝦存活。對所有活體進行附肢取樣檢測病毒含量。取樣方法為首先用70%酒精消毒待取樣附肢、解剖剪、鑷子等，並在眼柄處套上帶有編號的環狀眼標，然後用酒精噴燈將解剖剪燒紅，快速剪取1/3部分附肢置於乾淨的印pendorf管中，同時用解剖剪將附肢剪口部位燙白，最後將對蝦放入1_3%氟苯尼考藥浴的乾淨池中，完成活體取樣。提取附肢基因組DNA、核酸濃度測定、TaqMan實時螢光定量PCR檢測病毒拷貝數的方法同毒餌的有關檢測方法。測試結果表明，有42尾對蝦病毒含量低於lcopy/ng DNA，可直接安全作為留種親本，其它17尾個體病毒含量值範圍為9. 6-10223copy/ng DNA，不能納入常規育種體系。同時，依據存活時間對所有測試家系進行 排序，另外選取存活時間較長的24個家系的備份留種。
權利要求
1.一種對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法，其特徵在於包括I)、毒餌製備；2)、抗WSSV性能測試；3)、數據及樣品採集；4)、確定留種親本，具體步驟如下 1)、毒餌製備 (1)毒餌病毒含量檢測 人工感染所用毒餌為經WSSV感染致死、具明顯白斑症候群症狀的對蝦；分別取5mg肌肉組織提取基因組DNA並進行核酸濃度測定、TaqMan實時螢光定量PCR法進一步確定感染病毒種類並檢測病毒拷貝數，選取病毒拷貝數相同的對蝦用作製備毒餌，根據實際人工感染需要，計算出特定重量肌肉組織中病毒拷貝數； (2)染色毒餌製備 取經螢光定量PCR確定病毒且病毒含量相同的對蝦，去除其頭胸部、附肢和甲殼後，僅使用肌肉組織，稱重後按10yl/g加入可食用紅色素，在充分預冷的組織勻漿機中攪勻，製成病毒量均一、顏色醒目的毒餌，毒餌製備過程必須在低溫環境中快速進行，色素與毒餌混合後在海水中不變色、不發散，可供對蝦抱食、且便於觀察； 2)、抗WSSV性能測試 (1)等量人工感染 選取規格整齊、體質健康的對蝦為測試對象，將待測試對蝦分別置於透明塑料容器中飢餓2小時後，將現製備的毒餌置於有冰層的託盤中，用鑷子夾取特定重量毒餌輕輕送至對蝦口器處，對蝦抱食，10-15分鐘後觀察，可見攝食毒餌的對蝦胃及腸道呈現鮮豔的紅色，未攝食毒餌的對蝦胃及腸道無色，挑選抱食完畢的對蝦放入測試池內；測試池所用器皿、工具嚴格與對照池、暫養池區分，用後及時用50ppm有效氯消毒； (2)對照池 對蝦人工感染測試必須設置對照池，即投餵經螢光定量PCR檢測後不含WSSV病毒、且經與毒餌等量可食用紅色素染色的鮮蛤肉； 3)、數據及樣品採集 感染完備後，測試池和對照池正常投餌、換水，觀察對蝦死亡情況，從出現第一尾對蝦死亡開始，隨時撈出死亡對蝦並記錄其存活時間、體長、體重、性別、家系編號，並於_80°C保存死亡對蝦；待對蝦狀態穩定、不再有對蝦死亡後，將所有存活對蝦轉入新池繼續養殖； 4)、確定留種親本感染測試後存活的對蝦，在作為留種親本進入遺傳育種中心前，必需進行活體取樣檢測病毒含量，病毒含量低於陰性對照組的個體作為留種親本，同時根據需要選取存活時間較長家系的備份留種。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述步驟(4)中活體取樣檢測病毒含量的步驟為首先用70%酒精消毒待取樣附肢、解剖剪、鑷子，並在眼柄處套上帶有編號的環狀眼標用作個體間標識，然後用酒精噴燈將解剖剪燒紅，快速剪取1/3-1/10附肢置於乾淨的eppendorf管中，同時用解剖剪將附肢剪口部位燙白，最後將對奸放入1_3%氟苯尼考藥浴的乾淨池中，完成活體取樣； 然後提取附肢基因組DNA並進行核酸濃度測定、TaqMan實時螢光定量PCR法檢測病毒拷貝數，挑選未攜帶病毒或病毒含量低於背景值的存活對蝦用於留種親蝦，所述的背景值為38個PCR循環時陰性對照樣品的檢測值。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的等量人工感染過程中所用的鑷子為不帶橫紋的尖頭鑷子
全文摘要
對蝦抗白斑綜合症病毒能力的等量、定量測試方法，屬於對蝦抗病品種選育技術領域，包括1)毒餌製備；2)抗WSSV性能測試；3)數據及樣品採集；4)確定留種親本。通過TaqMan實時螢光定量PCR法確定感染病毒種類並檢測病毒拷貝數，選取病毒拷貝數相同的對蝦用作製備毒餌，根據實際人工感染需要，計算出特定重量肌肉組織中病毒拷貝數；通過在毒餌中加入可食用紅色素，並逐尾對待測試對蝦進行感染，實現對蝦等量、定量的測試方法，為獲得真實可靠的數據提供了保障。
文檔編號A01K61/00GK102657109SQ20121010737
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者劉寧, 孔傑, 孟憲紅, 張天時, 曹寶祥, 欒生, 羅坤 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所