2′，5′-寡聚腺苷酸衍生物的治療用途的製作方法

2023-06-21 18:02:56

專利名稱：2′，5′-寡聚腺苷酸衍生物的治療用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及2′，5′-寡聚腺苷酸類似物的某種治療用途以及這種類似物的藥物組合物。
本發明主題完整的命名要用極長的術語，本領域的熟練技術人員慣常將這些術語以他們所熟知的方式進行縮寫，下面列出的就是這些通常的，慣用的縮寫形式，本說明書中將採用這些縮寫形式。
縮寫A腺苷或腺苷酸或腺苷醯基蟲草品或C或3′-dA3′-脫氧腺苷(3′-脫氧腺苷酸)ara-A9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤EHNA赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤A-3′-氨基3′-氨基-3′-脫氧腺苷殺結核菌素4-氨基-7(β-D-呋喃核糖)吡咯並-〔2，3-d〕嘧啶3′-dATP3′-三磷酸脫氧腺苷ATP三磷酸腺苷I肌苷或肌苷酸或腺苷醯基木-A或木腺苷9-β-D-木阿糖呋喃腺嘌呤dCF或2′-脫氧助間型黴素(R)-3-(2-脫氧-β-D-赤戊呋喃)-3，6，7，8-四氫咪唑並〔4，5-d〕〔1，3〕二氮雜草-8-酚2-5A或2′，5′-寡聚(A)，或2′，5′-寡聚腺苷酸帶有2′，5′-磷酸二酯鍵和一個在5′一端的三磷酸的腺苷酸寡聚物2′，5′-蟲草品類似物或2′，5′-寡聚蟲草品帶有2′，5′-磷酸二酯鍵和一個在5′一端的三磷酸的3′-脫氧腺苷酸的寡聚物2′，5′-An或核心低聚物帶有2′，5′-磷酸二酯鍵的腺苷酸的寡聚物2′，5′-A3或2′，5′-腺苷酸三聚物核心腺苷醯基-(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷2′，5′-A4或2′，5′-腺苷酸四聚物核心腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷2′，5′-3dA3或2′，5′-C-C-C或2′，5′-蟲草品三聚物核心3′-脫氧腺苷醯(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯-(2′，5′)3′-脫氧腺苷2′，5′-C-C-C-C或2′，5′-蟲草品四聚物核心3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧醯苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-腺苷3′，5′-A3腺苷醯基(3′，5′)腺苷醯基(3，5′)腺苷2′，5′-I3或2′，5′-肌苷三聚物核心腺苷醯基-(2′，5′)腺苷醯基(3′，5′)肌苷EBVEpstein-Barr病毒EBNA與早期核抗原有關的Epstein-Barr病毒HIV人類免疫缺失病毒，包括HIV-1，HIV-2，以及所有其它的HIV亞型HBLV人類B-細胞淋巴變病毒HTLV人類T-細胞白血病病毒，包括HTLV-Ⅰ，HTLV-Ⅱ和HTLV-Ⅲ，以及所有其它的HTLV亞型。
IFNαα-幹擾素rIFN-αA重組α-幹擾素dsRNA雙股核糖核酸2′，5′-A-A-Tu腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)殺結核菌素2′，5′-Tu-Tu-Tu2′，5′-殺結核菌醯基(2′，5′)殺結核菌醯基(2′，5′)殺結核菌素2′，5′-A-A-ara-A腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)ara-A2′，5′-C-C-A3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷2′，5′-A-C-C腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷-(2′，5′)3′-脫氧腺苷2′，5′-A-A-C腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷2′，5′-C-A-C3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯(2′，5′)3′-脫氧腺苷2′，5′-C-C-A3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷2′，5′-A-C-A腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷2′，5′-木-A3木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基-(2′，5′)木腺苷2′，5′，-木-A4木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基-(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷AC乙醯基Bz苯基MMTr5′-O-對-甲氧基三苯甲基2′，5′-三苯甲基-C35′-O-對-甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷2′，5′-三苯甲基-A35′-O-對-甲氧基三苯甲基腺苷醯基-(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷2′，5′-C-C-dCF3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)2′-脫氧助間型黴素2′，5′-A-A-A-3′-氨基腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基-(2′，5′)3′-氨基-3′-脫氧腺苷SiTBD叔-丁基二甲基甲矽烷基或-Si(CH3)2C(CH2)32′，5′-A(si)-A(si)-A3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-腺苷醯基(2′，5′)3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基腺苷醯基(2′，5′)-腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-甲基腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基-(2′，5′)3′-O-甲基腺苷
2′，5′-A-A-A-3′-O-戊基腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基-(2′，5′)3′-O-戊基腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-己基腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-O-己基腺苷2′，5′-A-A-A-3′-O-庚基腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-O-庚基腺苷2′，5′-EHNA-A-A赤-9-(2-羥基-3-壬基)-腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷由腺苷醯(A)和3′脫氧腺苷醯(C)部分組成的「四聚物」化合物的縮寫形式表示如下2′，5′-A-A-C-C腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷隨著對有關由於幹擾素誘導的抗病毒情況知識的不斷了解，人們已經把注意力集中在作為抗病毒應答介體的2′，5′-低聚核苷酸的化學和酶催化合成及其生物特性，2′，5′-寡聚(A)是在植物和動物體中天然的，能起廣譜抗病毒作用的一種成份。2-5A通道，也就是人們所知道的2-5A/核糖核酸酶L通道或抗病毒系統廣泛地認為在幹擾素的抗病毒機制中起作用，還對細胞生長的調節及分化起作用，根據該通道，可以由ATP通過2′，5′-寡聚腺苷酸合成酶〔ATP(2′，5′)寡聚(A)-腺苷醯轉移酶(EC2，7，7，19)〕(下文稱為「2-5A合成物」)合成得到2-5A，該酶用dsRNA激活，2-5A通過與其唯一已知的靶酶，即特異的2-5A依賴的內核糖核酸酶RNaseL鍵合併使其活化而、發揮其生物作用。後一種酶裂解病毒和細胞的mRNA或rRNA，從而抑制蛋白質的合成，參見Hovanessian等人，Eur.J.Biochem.93515-526(1979);Kerr等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75256-260(1978)但是真正2-5A分子在生物系統中的短的半衰期是公認的對控制病毒複製是不利的。
「人類B-淋巴變病毒」也就是已知的「人類B-細胞淋巴變病毒」(HBLV)，其特徵是一種大分子量的雙股DNA基因組，該病毒在形態上類似於皰疹病毒科的病毒，但與已知的人類和非人類靈長目皰疹病毒在宿主範圍、體外生物作用，抗原性能和基因組上存在差別。參見Salahuddin等人，Science.234596-601(1986)Josephs等人，Science234601-602(1986)已經發現該病毒能選擇性地感染剛剛分離的人類B-細胞，這些細胞被轉變成具有核和細胞質粒包合體的大的，可折射光的單或雙核細胞、人們懷疑HBLV是引起慢性類單核增生綜合症的原因所在，該綜合症的症狀為持續一年以上的慢性疲勞。
人類免疫缺失病毒(「HIV」)，也就是人們所知道的人類T-細胞白血病病毒Ⅲ(HTLV-Ⅲ」)是獲得性免疫缺乏綜合症的病原劑，該病毒是D型反轉錄病毒，象所有的反轉錄病毒一樣，HIV複製的基本特徵為將正股RNA基因組反轉錄成DNA，該過程需要一種依賴於與RNA的DNA聚合酶，即反轉錄酶，這種酶是病毒編碼的，且發現與成熟的HIV病毒粒子中基因組的RNA有關，反轉錄酶對反轉錄病毒和需要較短反轉錄步驟的病毒的排他性使得反轉錄酶成為抗病毒，尤其是抗反轉錄病毒，治療幹預的主要目的。
因此，人們要求有一種用比真正2-5A代謝更穩定，更有效的化合物來控制由HBLA引起的慢性疲勞HIV，以及其它的以2-5A通道缺陷為特徵的疾病的方法。
根據本發明，提供了一種治療哺乳動物2-5A通道缺陷為特徵的失調症的方法，該方法包括給這些哺乳動物施用至少一種分子式如下面所示的化合物或它的藥用鹽。
其中n是從1-8的正整數m是0、1、2或3隻要所有R在同一化合物中不都是-OH，則每一個R，可以相同或不同地選自於氫、羥基、氨基、C1-C10烷氧基和-OSi(CH3)2C(CH3)3優選地，n為1至3，為1或2更好，最好在核苷酸2′-末端上的R基團不是羥基，即2′-末端核苷酸不是腺苷。
用於本發明方法中的化合物的例子包括下列核心化合物，它們相應的5′單雙和三磷酸酯以及它們的藥用鹽。
R選自於氫和羥基中的化合物2′，5′-C-C-C，2′，5′-A-A-C，2′，5′-A-C-C，2′，5′-C-C-A，2′，5′-C-A-C，2′，5′-C-C-A，2′，5′-A-C-A，還有A和C結合的各種四聚物，它們包括組不限於2′，5′-C-C-C-C，2′，5′-A-A-A-C，2′，5′-A-A-C-C，2′，5′-A-A-C-A，以及類似物R選自於羥基和C1-C10烷氧基，特別是C1-C7烷氧基的化合物，例如2′，5′-A-A-A-3′-O-甲基2′，5′-A-A-A-3′-O-戊基2′，5′-A-A-A-3′-O-己基2′，5′-A-A-A-3′-O-庚基R選自羥基和氨基的化合物，例如2′，5′-A-A-A-3′-氨基
R選自於羥基和OSi(CH3)2C(CH3)3的化合物例如2′，5′-A(si)A(si)A在所述發明中，在治療哺乳動物的以2-5A通道缺陷為特徵的失調症的方法中包括給這些哺乳動物施用至少一種選自於下面列出的化合物2′，5′-A-A-ara-A，2′，5′-A-A-Tu，2′，5′-Tu-Tu-Tu，2′，5′-I3，2′，5′-木-A3，2′，5′-木-A4，2′，5′-C-C-dCF，2′，5′-EHNA-A-A，以及5，6-二氯苯並咪唑醯基(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑醯基(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑核糖苷或者是其5′單一，雙一，和三磷酸酯，或者是它們的藥用鹽。
本發明還進一步涉及用於治療哺乳動物以2-5A通道缺陷為特徵的任何一種失調症的藥物組合物，它包括至少一種上述化合物和一種藥用載體。
附圖簡述

圖1表示用下列2′，5′-寡聚腺苷酸類似物進行HIV-1反轉錄酶抑制的效果P2C3(實心圈);PC4(空心圈);P3C3(實心方塊);PC3(空心方塊);C3(實心三角);A-C-A(空心三角)。反轉錄酶反應中含有作為模板引物的聚(A)-(dT)15，作為酶的Triton X-100活化的HTLV-ⅢB溶胞產物，並用〔3H〕dTTP結合(如例9中所述)進行監視，對比值平均為129，000cpm(每分鐘計數)，而背景值平均為10，000cpm。
圖2表示下列物質對體外HIV-Ⅰ感染的效果(Ⅰ)蟲草品，(Ⅱ)2′，5′-A3，(Ⅲ)2′，5′-C3和(Ⅳ)2′，5′-pC3，(Ⅴ)(2′，5′)-A-C-A以及(Ⅵ)2′，5′-pC4。在存在和不存在效應物時用HTLV-ⅢB攻擊MT-2細胞，通過如例9中所述的病毒染色吸收定量測定細胞致病效果，每一個數據點代表三個值的平均數，標準誤差小於平均值的10%。
圖3是2′，5′-C3和rIFN-αA(A)，或失配dsRNA(B)結合起來的抗-HIV-1效果的圖示，結合藥物指數由劑量-效果曲線的斜率計算得到，並對百分保護值或影響分數製圖。濃度分別為2′，5′-C3為3.1-100微克/毫升;rIFN-αA為9.8-312.5國際單位/毫升;失配dsRNA為1.6-25微克/毫升。
本發明的詳細描述外源、代謝穩定的2-5A類似物的投藥，將對以2-5A通道缺陷為特徵的失調症增強保護，特別將對動物和人體中的反轉錄病毒感染產生保護，這裡引用的「2-5A缺陷」是指一種現象狀態或2-5A通道的中斷。以2-5A缺陷為特徵的疾病例如包括反轉錄病毒感染，尤其是HTLV感染，特別是HIV感染，慢性疲勞和皮膚T-細胞淋巴瘤;慢性骨髓白血病;急性白血病;癌症;T-細胞白血病;早老性痴呆;帕金森氏病;多發性硬化症;自免疫疾病;以及外科和其它創傷引起的免疫機能障礙。
這種缺陷在例如上述的由慢性病毒感染，免疫細胞缺陷或兩者共同引起的失常疾病中是很明顯的，2-5A通道缺陷特別表現在以慢性病毒感染和免疫細胞缺陷為特徵的疾病中。
通過對2-5A分子上的3′-羥基基團和其它地方作結構修飾，可以使2-5A類似物明顯地增加對2′-磷酸二酯酶和細胞核的代謝穩定性，同時又能保持活化RNaseL的能力。通過端部核苷酸的取代而對天然2-5A作類似調整可以獲得一種更穩定的分子，由於提高了穩定性，結果使代謝穩定的2-5A類似物更持久，並具有效高的細胞內濃度。
2-5A類似物的持久的藥物活性提供了一個更加有利的治療率。與代謝不穩定的2-5A相比它可以減小給藥的頻率，由於許多以2-5A通道缺陷為特徵的疾病具有長期性質，減小給藥頻率就顯得十分重要。
2-5A類似物對治療由反轉錄病毒引起的感染特別有用，與反轉錄病毒感染有關的2-5A通道缺陷包括由於病毒幹擾2-5A合成酶受dsRNA活化而引起的通道失活，如果2-5A合成酶缺乏活化，那麼2-5A的產生以及RNaseL的活化就要降低，根據本發明，施用外源、代謝穩定的2-5A類似物可以抵消在2-5A通道中因反轉錄病毒引起的缺陷。2-5A類似物象真正2-5A一樣，均能活化使病毒RNA斷裂的RNaseL2-5A類似物對於保護由各種人類T-細胞白血病病毒(集體性「HTLN」)，例如HTLN-Ⅰ，HTLV-Ⅱ，HTLV-Ⅲ和HTLV-Ⅳ引起的感染特別有用，HTLV-Ⅰ引起皮膚下-細胞淋巴瘤;HTLV-Ⅱ引起Sezany淋巴瘤;HTLV-Ⅲ和HTLV-Ⅳ目前被認為是多發硬化症的病原劑。每一種HTLV病毒均是反轉錄病毒，和「HIV-Ⅰ」一樣，已知HTLV-Ⅲ能引起獲得性免疫缺陷綜合症(「AIDS」，愛滋病)，人們還相信該化合物在治療HIV-2中是有用的，HIV-2是血清學差異的第2種HIV亞型，以後(HIV)就是指HIV-1或HIV-2以及目前或今後為人們所知的其它HIV亞型。
受HTLV感染的病人，特別是受HTLV-1感染的病人已經證明在血液單核細胞中2-5A和/或RNaseL的活性異常地低，與之相反，來自健康個人的血液單核細胞平均來說，表現上較高的2-5A水平，且RNaseL活性很容易觀察到，類似地，來自感染慢性疲勞症的個人的血液單核細胞則表現出較低的2-5A水平，且RNA裂解產物顯示出新型外觀，這種新型RNA裂解產物不同於在正常個人的血液單核細胞中看到的特定裂解產物。
雖然本發明的實踐在此被描述為用來治療通常被看成是一種原型反轉錄病毒的HIV-1感染，但也可以將本發明的方法用來治療任何一種其病原因子由一種反轉錄病毒組成的疾病其它使人受感染的反轉錄病毒包括例如如前所述的各種非HIV，HTLV病毒。
通過施用外源、代謝穩定的2-5A類似物可以抵消與疾病狀態有關的2-5A系統缺陷，從而對以2-5A通道缺陷為特徵的各種疾病，尤其是反轉錄病毒感染，特別是HIV感染進行治療。
當用作為藥物時，可以將2′，5′-寡聚腺苷酸類似物吸收在藥用的載體中，用來製備本發明藥物組合物的載體可以是有機的或無機的，在性質上可以是固體的或液體的。合適的固體載體包括動物膠、微晶纖維素、乳糖、澱粉和硬脂酸鎂。合適的液體載體包括水和醇。例如乙醇、苯甲醇和聚乙二醇、優選的，用於可注射製劑的液體載體包括水、鹽水溶液、葡萄糖溶液和苷醇溶液，如含水丙二醇或含水聚乙二醇。配方的性能可以通過添加一種或多種具有某種性能的助劑來提高，例如加入粘度提高劑表面活性劑、pH調節劑、防腐劑、矯味劑、穩定性提高劑、著色劑、懸浮劑、粒化劑、塗覆劑、分解調節劑、推進劑、乳化劑以及溼潤劑。得到的組合物可以是溶液、懸浮液、片劑、膠囊、藥膏、酏劑、可注射的組合物以及類似物。
給藥劑量取決於感染或疾病的嚴重程度以及對象的大小及重量，根據疾病的性質以及對象大小、重量，該劑量可以在很寬的範圍內變化。根據實例，該化合物可以在水中、磷酸鹽緩衝鹽水中或其它合適的液體中製成0.1-100毫克/毫升的溶液，也可以製成含有0.01-1克活性化合物的片劑。
該化合物可以以水溶性鹽形式施用，藥用的水溶性鹽包括例如該活性化合物的鈉，鉀、銨鹽，它們很容易溶於水中或鹽水溶液中，該配方中可以含有一些附加劑，例如一種糖或蛋白質以保持滲透平衡。
對於患有、或懷疑患有、或容易患有任何一種以2-5A通道缺陷為特徵的疾病的動物或人類，可以以0.1毫克到1克的劑量施用2′，5′-寡聚腺苷酸類藥物。每天的總劑量例如可以從約0.001克變化到大約1克，當然也可以給於更低或更高的劑量，優選的每日劑量是約0.01克到約0.1克活性成分。該化合物可以通過幾種途徑中的任何一種施用，包括但不限於靜脈內注射，皮下注射或肌肉內注射以及口服給藥。完成這些給藥的技術均是醫藥領域常規的，熟知的。給藥頻率可一天幾次或一周幾次，採用靜脈內注射尤其是用於治療HIV時，最好採用含有0.1～1.0毫克/毫升活性組分的溶液。
還可以預料通過局部施用2′，5′-低聚腺苷酸類似物可以治療以2-5A通道缺陷為特徵的任何一種疾病狀況有關的皮膚病，可以將足量的，含有一種或多種2′，5′-低聚腺苷酸類似物的製劑覆蓋在患處或感染區域，活性試劑的有效濃度從大約10-3M至大約10-5M，10-4M左右更好。
除了用常用載體給藥以外，2-5A類似物也可以通過一系列特別的寡聚核苷酸或核酸輸送技術來施用，例如通過密封在單層脂質體或重建仙臺病毒膜中，或者通過與載體分子如聚(L-賴氨酸)結合。這些方法均公開在普通轉讓的共同未決定美國專利申請112，591中，其相應的國際專利申請為WO89/03683，該文獻的全部公開通過參考被結合在本文中。
2′，5′-低聚腺苷酸類似物可以如下進行化學合成，通過用苯甲醯基閉塞6-氨基位置，用對-甲氧基三苯甲基閉塞5′-位置，3′-位置，可以用叔-丁基二甲基甲矽烷基閉塞，也可以不閉塞，從而製得保護好的腺苷-2′-磷酸二酯。通過用乙醯基、苯甲醯基或叔-丁基二甲基甲矽烷基閉塞2′和3′位置可以製得保護好的核苷酸。適當保護的腺苷-2′-磷酸二酯的製備過程為向N6-苯甲醯-5′-O-(4-甲氧基三苯甲基)腺苷上的3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-異構-3′-羥基基團中加入叔-丁基二甲基甲矽烷基基團，即用咪唑(在吡啶中)縮合前一種化合物和叔-丁基二甲基甲矽烷基氯化物的化合物，從而產生3′-O-叔丁基二甲基甲矽烷基衍生物，用2，5-二氯苯-偶磷三唑化合物(在吡啶中)對該衍生物進行磷酸化即能產生適當保護的腺苷-2′-磷酸二酯。該製備過程被描述在R.Charubala，E.Uhlmann和W.Pfleideres的LiebigsAnn.Chem.，2392(1981)以及R.Charubala，W.Pfleiderer的TetrahedronLett.21，4077(1980)中，這些文獻通過參考具體地結合在本文中。在一種縮合試劑(它會產生閉塞磷酸鹽的功能)存在下，用保護好的核苷與保護好的腺苷-2′-磷酸二酯縮合，從而形成完全保護的二核苷-單磷酸三酯。
用去三苯甲基試劑使所得到的完全保護的縮合物在末端5′位處脫去三苯甲基，並用腺苷-2′-磷酸二酯縮合，如上所述地保護，從而形成一種完全保護的2′，5′三核苷二磷酸雙三酯，或2′，5′三聚物核心，然後用適當的去保護試劑處理該完全保護的三聚物核心，從而完全去除保護並轉化成2′，5′-三聚物核心。
此外，這些由作為2-5A合成酶底物的，從核苷酸形成的2′，5′-寡聚腺苷酸類似物也可以通過酶催化製得，例如根據美國專利4，464，359中所述的方法，該文獻通過參考結合入本文。
三聚物核心2′，5′-A-A-ara-A的製備過程在Engles J.，Tetrahedron Lett.21，4339(1980)，中報導，該文獻通過具體結合在本文中，由此用喹啉-8-磺醯基-3-硝基-1，2，4-三唑作偶聯劑，用完全保護的N6，3′-O-二苯甲醯基-5′-O-三苯甲基腺苷醯(2′-O-三溴乙基-5′)N63′-O-二苯甲醯基腺苷-2′-(三溴乙基氰基乙基磷酯縮合核苷N6，2′-O-，3′-O-三苯甲醯阿糖-呋喃腺苷。通過用三氟化硼/甲醇進行脫三苯甲基過程，然後對三溴乙基部分進行電化學解保護。(CH3CN，Hg池，在陽極電解液中的NaHCO3)從而使得到的三聚物三酯進行最後的脫保護。用丁銨/甲醇使該二酯物脫去苯甲醯，從而形成腺苷醯-(2′，5′)腺苷醯(2′，5′)9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤。
2′，5′-I3的製備過程描述在Charubala等人的Tetrahedran Lett 23 4789(1982)中，通過參考，該文獻被具體結合在本文中。
三聚物核心2′，5′-木-A3和四聚物核心2′，5′-木-A4的製備過程描述在Grosselin，G和Imbach，J.L.的Tetrahedron Lett.22，4699(1981)中，該文獻通過參考被結合在本文中。由此，可以通過下列方法合成三聚物和四聚物核心木-A3和木-A4用叔-丁基二甲基甲矽烷基氯化物處理N6-3′-O-二苯甲醯基化的木呋喃糖，從而產生N6-3′-O-二苯甲醯基化的木呋喃糖的甲矽烷化衍生物，用甲醇鈉脫去該衍生物的苯甲醯基，形成了2′-甲矽烷基衍生物，用單甲氧基三苯甲基基團保護該2′-甲矽基衍生物上的原始羥基，並將所得到的5′-三苯甲基化-2′-甲矽烷基衍生物與等摩爾當量的苯甲酸酐(溶於吡啶中)在4-二甲基氨基吡啶存在下進行反應，從而產生N6和3-O-苯甲醯基化-5′-三苯甲基化-2′-甲矽烷基化衍生物，用氟化四丁銨除去叔-丁基二甲基甲矽烷基基團就可以得到N6和3-O-二苯甲醯基化-5′-三苯甲基化衍生物，隨後使該衍生物苯甲醯化，脫去三苯，結果產生N6，2′，3′-O-三苯甲醯木腺苷。
將前面的N6和3-O-二苯甲醯化-5′-三苯甲基化衍生物與過量的O-氯苯-磷-二-(1，2，4-三唑)在乙腈-吡啶混合物中進行反應然後再與含水三乙胺反應，結果形成了2′-磷酸三酯，用N6，2′，3′-O-三苯甲醯木腺苷在1-1，3，5-三甲基苯磺醯基-3-硝基-1，2，4-三唑存在下與該磷酸三酯縮合，從而產生完全保護的二核苷磷酸三酯，然後用對-甲苯磺酸在氯仿和甲醇的混合物(4∶3)中處理該產物使之脫去三苯甲基，將脫去三苯甲基的產物的磷酸三酯進行最後縮合，並用矽膠色譜法進行純化，結果產生完全保護的三核苷二磷酸三酯(三聚物核心閉塞體)通過用四甲基胍鹽-順-4-硝基苯甲醛肟、氨水和80%乙酸處理該保護好的三聚物核心，即可以獲得完全解除保護的三聚物核心。
ENHA的製備過程可以根據EVans等人在J.AmChem.Soc.924751(1970)中所述的工藝進行，然後與適當保護的腺苷縮合，並如前所述地進行保護，縮合和解除保護，結果形成2′，5′-EHNA-A-A，用同樣方式，可以由dCF和腺苷製得2′，5′-C-C-dCF.dCF的製備方法列於美國專利US3，923，785和Backer等人的J.Am.Chem.Soc1016127(1979)中，這兩篇文獻均通過參考結合在本文中。類似地用同樣方法通過縮合由市場上買到的5，6-二氯苯並咪唑核糖(Sigma目錄，No.D5893)可以製得2-5A類似物5，6-二氯苯並咪唑基-(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑基-(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑核苷。
用於實施本發明的2′，5′-寡聚腺苷酸類似物的製備在下列非限制性實施例中被說明。
例1結構被修飾了的2′，5′-腺苷酸三聚物核心的製備通常以下列方式製備各種結構修飾了的新型2′，5′-腺苷酸三聚物核心類似物按照Charubala，R.Uhlmann.E.和Pfleiderer，W.在LiebigsAnn.Chem.，2392(1981)中和Char-ubalaR.，Pfleiderer.W.，在TetrahedronLett，214077(1980)中所述的方法，由腺苷或蟲草品製備一毫摩爾適當保護了的，具有反應劑(Ⅰ)通式的腺苷-2′-磷酸二酯。適當保護的腺苷-2′-磷酸二酯的例子由列於表1中的化合物
1和2代表。
表1化合物名稱化合物編號RR′吡啶嗡N6苯甲醯-3′-O--叔-丁基二甲基甲矽烷基-5′1OSiTBD2-氯苯-O-對-甲氧基三苯甲基腺苷-2-(2-氯苯)-磷酸酯吡啶嗡N6-苯甲醯-5′-O--對-甲氧基三苯甲基-3′-脫2H2-氯苯氧腺苷-2′-(2-氯苯)-磷酸酯將反應劑(Ⅰ)和具有原反應劑(Ⅱ)通式的保護好的核苷結合起來，反應劑(Ⅱ)以列於表2中的化合物3-9為例
表2化合物化合物名稱編號RR′XN6-苯甲醯基-2′，3′-2-O-叔-丁3OSiTBDSiTBDN基二甲基甲矽烷基-腺苷N6，2′-O-二苯甲醯基-3′-脫氧腺苷4HBZNN6-苯甲醯基-2′-O-乙醯基-3′-5HACN脫氧腺苷
N6，2′－0－二苯甲醯基－3′－0－正一戊 60－正－C5H11BZ N基腺苷N6，2′－0－二苯甲醯基－3′－0－正一 70－正－C7H15BZ N庚基腺苷N6－笨甲醯基－2′－O－叔－丁基二甲基甲 8 NHCOOCH2CH2
NO2SiTBD N矽烷基－3′一對一硝基苯一乙氧基羰基氨基－3′－脫氧腺苷2′.3′一二－O－叔一丁基一二甲基甲矽烷9OSiTBDSiTBD N基一殺結核菌素化合物3和9的製備過程如下用單甲氧基三苯甲基氯化物(在吡啶中)處理N6-苯甲醯基化的腺苷，從而產生5′-單氧基三苯甲基衍生物，用叔-丁基二甲基甲矽烷基氯(在吡啶和甲基咪唑的混合物中)處理該衍生物，形成N6-苯甲醯基-2′，3′-二-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-5′-單甲氧基三苯甲基腺苷，用乙酸除去三苯甲基基團，結果產生化合物3。化合物9可以用N6-苯甲醯基化殺結核菌素起始類似地合成得到。這些製備方法已在Charubala等人的Liebigs Ann.Chem.2392(1981)中描述。
化合物4的製備過程如下用單甲氧基三苯甲基氯處理N6-苯甲醯基化的3′-脫氧腺苷，從而產生N6-苯甲醯基-5′-O-單甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷，通過用苯甲醯氯使2′-羥基基團苯甲醯基化，隨後再用80%乙酸進行30分鐘脫三苯甲基，將上述產物轉化成N6-2′-O-二苯甲醯基-3′-脫氧腺苷，在Tetrahedron Lett 21，4077(1980)中，描述了該製備方法。
化合物5的製備過程如下在吡啶中，用叔-丁基二苯氯矽烷將N6-苯甲醯腺苷轉化成5′-甲矽烷基化腺苷，用原乙酸三乙酯，然後用三氟化硼/乙醚和碘化鈉(在CH3CN中)處理(0℃，1小時)，該5′-甲烷基化腺苷，結果產生3′-碘乙醯基衍生物，再用三丁基氫化錫在甲苯中，80℃處理1小時，以及用氟化四丁銨(在四氫呋喃中)進行脫甲矽烷基，將該碘乙醯基衍生物轉變成化合物5，該製備方法在Engles.J.的Teterahedron Lett.21 4339(1980)中已描述，該文獻被參考結合在本文中。
化合物6和7的製備過程如下用三苯甲基氯在吡啶中處理N6苯甲醯基腺苷並回流2小時，用氯仿萃取以分離出N6-苯甲醯基5′-三苯甲基腺苷。通過用硫酸鈉乾燥除去氯仿相中的水，利用製備性矽膠薄層色譜(在氯仿/乙醇中)分離出N6-苯甲醯基-2′，5′-二-O-三苯甲基腺苷和N6-苯甲醯基-3′，5′-二-O-三苯甲基腺苷，分別用正-戊基氯和正-庚基氯處理分離出的化合物(在氫氧化鈉在甲苯中的懸浮液中回流)就可以製得化合物6和7，通過在乙酸中加熱回流，隨後加入乙醚和水使該溶液中和，其反應產物用氯仿萃取，然後用氯仿∶甲醇(4∶1)在矽膠平板上進行薄層層析，通過在乙酸中回流加熱1小時，冷卻，用乙醚萃取，然後再濃縮，冷卻除去三苯甲基和苯甲醯基基團，從而產生晶體化合物6和7，該製備方法可以根據Blank.H.U.Franne.D.，Myles，A和Pfleiderer，W.，在JustusLiebigsAnn.Chem.742，34(1970)中所述的方式進行，該文獻被參考結合在本文中。
化合物8的製備如下將1毫摩爾3′-氨基-3′-脫氧腺苷與1.2毫摩爾1-甲基-3-硝基苯乙氧基-羧基咪唑鎓氯在二甲基甲醯胺中反應，然後加入六甲基二矽氮烷以封閉2′，5′和6-氨基位置，在室溫下將在吡啶中的1.1毫摩爾苯甲醯氯加入，結果產生保護好的N6-苯甲醯基2′，5′-二甲矽烷基腺苷，將反應混合物倒入甲醇-NH3中以除去2′和5′甲矽烷基基團將它與MMTr氯化物在吡啶中反應，產生5′-MMTr衍生物，然後向該5′-MMTr衍生物中加入叔-丁基二甲基甲矽烷基氯(在吡啶和1-甲基咪唑的混合物中)，並象例1中那樣脫去5′-三苯甲基，結果形成了化合物8。
將反應劑(Ⅰ)和反應劑(Ⅱ)結合起來可以製得具有二聚物(Ⅲ)通式的中間物，其製備過程如下將0.95毫摩爾反應劑(Ⅱ)和縮合劑2，4，6-三異丙基甲苯磺醯氯(2毫摩爾)和1-甲基咪唑(6毫摩爾)結合在一起並在室溫下攪拌1小時，加入30毫升含水磷酸鹽緩衝劑(pH7)，停止反應，用150毫升氯仿進行萃取，用50毫升水將該氯仿物衝洗兩次，並在硫酸鈉上乾燥1-2小時，然後過濾，將該氯仿液蒸發至較少體積然後放到矽膠柱(20×2.5釐米)上進行純化，先用氯仿，然後用氯仿/甲醇(99/1，容積/容積)進行色譜分析以提洗該完全保護的二核苷單磷酸三酯，從而產生了通式如(Ⅲ)的二聚物，經過蒸發即能得到二聚物(Ⅲ)的固體泡沫體，二聚物(Ⅲ)以表3中化合物10-17為代表。
將1毫摩爾完全保護的二聚物(Ⅲ)室溫下在20毫升的2%對-甲苯磺酸在二氯甲烷/甲醇中(4/1，容積/容積)攪拌30分鐘以脫去三苯甲基，加入20毫升磷酸鹽緩衝液(pH7)，然後用200毫升二氯甲烷萃取幾次，用水衝洗其有機相，通過硫酸鈉乾燥，蒸發至較小體積，然後放到矽膠柱(20×2.5釐米)上進行提純，先用氯仿(400毫升)，然後用氯仿/甲醇(98/2容積/容積)進行提洗，蒸發其主要組分獲得產率為80-90%的脫去三苯甲基的二核苷單磷酸三酯(二聚物(Ⅲ))，以表3中化合物18-25為例。
由5′-脫去三苯甲基的二聚物(Ⅲ)可以如下製得完全保護的，以下面表4中的化合物26-34為代表的，具有三聚物(Ⅳ)通式的2′，5′-三核苷二磷酸雙三酯。
以3毫摩爾2，4，6-三異丙基甲苯磺醯氯和9毫摩爾1-甲基咪唑作為縮合劑，用1毫摩爾5′-脫去三苯甲基的二聚物(Ⅲ)(化合物18-25)在10毫升無水吡啶中縮合1.05毫摩爾起始腺苷-2′-磷酸二酯(反應劑(Ⅰ))，按上面所述的方式在2小時以後完成，用磷酸鹽緩衝劑停止反應，然後用二氯甲烷進行萃取，並以氯仿以及氯仿/甲醇(99/1～98/2，容積/容積)進行矽膠層析，結果產生70～90%完全保護的三聚物(Ⅳ)(化合物26-34)，它是一種色譜純淨的非晶形粉末。
可以將該完全保護的2′，5′-三核苷二磷酸雙三酯，三聚物(Ⅳ)解除保護以形成三聚物核心(Ⅴ)，其過程如下。
用0.073克對-硝基苯甲醛肟和0.07克四甲基胍的溶液在2毫升雙噁烷水中(1/1，容積/容積)將0.01毫摩爾三聚物(Ⅳ)在室溫下處理16小時，從而使O-氯苯基團去保護，在蒸發至幹並和水共蒸發四次以後，加入20毫升濃氫氧化氨，將該溶液在室溫下攪拌2天，從而使乙醯基團去保護，將該溶液再次蒸發，將其殘留物溶解於25毫升水中並用氯仿衝洗四次，每次用10毫升將其水層蒸發至乾燥並與無水吡啶(每次10毫升)共蒸發10次，然後用2毫升，0.5M無水氟化四丁銨在無水吡啶的溶液中將該殘留物處理16小時，從而除去叔-丁基二甲基甲矽烷基基團，蒸發後，用5毫升，80%乙酸在室溫下將殘留物處理6小時，從而使對一甲氧基三苯甲基基團斷裂，將溶液再次蒸發，將殘留物溶解在15毫升水中，並用氯仿(每次5毫升)萃取4次，將含水層蒸發，並和水共蒸發若干次，直到乙酸氣味消失，將其殘留物溶解在10毫升水中，並加到DEAE-SephadexA-25柱(60×1釐米)上用梯度為0.001～0.5M的碳酸氫三胺進行離子交換層析，將其主要組分蒸發，然後和水共蒸發若干次，將該水溶液冷凍乾燥分離出三聚物核心(Ⅴ)，一種完全脫保護的2′，5′-三核苷二磷酸酯，得到70～90%的非晶形固體，表5中化合物35-45代表了三聚物核心(Ⅴ)。
表5化合物名稱化合物號R R1R2R3X2′，5′-A-A-C35HOHOHHN2′，5′-C-A-C36HHOHHN2′，5′-A-A-Tu37HOHOHOHCH2′，5′-A-A-A- 38 H OH OH O-n-C6H11N3′-O-戊基2′，5′-A-A-A- 39 H OH OH O-n-C7H16N3′-O-庚基2′，5′-A(Si)-40HOSiTBDOSiTBDOHNA(Si)-A2′，5′-C-C-A41HHHOHN2′，5′-A-C-C42HOHHHN2′，5′-A-A- 43 H OH OH NH2N3′-氨基2′，5′-三苯甲基-A344 MMTr OH OH OH N2′，5′-三苯甲基-C345 MMTr H H H N2′，5′-C-C-C- 46 H2O3P H H H N5′-單磷酸酯例23′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基腺苷醯基(2′，5′)3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基腺苷醯基(2′，5′)腺苷的製備除了省去用氟化四丁銨作處理以解除保護的步驟以外，按照例1中所述的工藝處理0.01毫摩爾N6-苯甲醯基-3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-5′-O-對甲氧基三苯甲基腺苷醯基(2′-O-氯苯基-5′)N6-苯甲醯基-3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基腺苷(2′-O-氯苯-5′)N6，2′-O-3′-O-三苯甲醯腺苷(化合物31，表4)，從而得到2′，5′-A(si)-A(si)-A(化合物40，表5)例3腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-氨基-3′-脫氧腺苷的製備根據例1中所述的解除保護過程處理0.01毫摩爾N6-苯甲醯基-3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-5′-O-對甲氧基三苯甲基腺苷醯(2′-O-氯苯基-5′)N6-苯甲醯基-3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基腺苷醯基(2′-O-氯苯基-5′)N6-苯甲醯基-2′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-3′-對-硝基苯乙氧基羰基氨-3′-脫氧腺苷(化合物34，表4)其中對-硝基苯乙氧基羰基基團和甲矽烷基基團在β-消除過程中被氟化四丁銨同時裂解，以後經過脫羧基，就能產生2′，5′-A-A-3′-氨基(化合物43，表5)例45′-O-對-甲氧基三苯甲基腺苷(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷的製備過程按照Charubala，R.，Uhlmann，E.，和Pfleiderer，W.，在Liebigs Ann Chem.，2392(1981)中所述的方法製備0.01毫摩爾N6-苯甲醯基-3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基-5′-O-對-甲氧基三苯甲基腺苷醯基(2′-O-氯苯-5′)N6-苯甲醯基-3′-O-叔-丁基二甲基甲矽烷基腺苷醯基(2′-O-氯苯-5′)N6，N6-2′-0，3-O-四苯甲醯基腺苷，然後按照例1所述的解除保護方法(除了省去最後一步乙酸處理以外)處理上述產物，將產物2′，5′-三苯甲基-A3(化合物44，表5)分離，用DEAE-Sephadex A-25色譜法提純，並冷凍乾燥，從而形成非晶形粉末狀純淨化合物44，產率為85%例55′-O-對-甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷醯(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯(2′，5′)3′-脫氧腺苷的製備根據Charubala，R.，和Pfleiderer.W.在Tetrahedron Lett.21，4077(1980)中所述的方法製得0.01毫摩爾N6-苯甲醯基-5′-O-對-甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷醯基(2′-O-氯苯-5′)N6-苯甲醯基-3′-脫氧腺苷醯(2′-O-氯苯-5′-)N6，N6，2′-O-三苯甲醯基-3′-脫氧腺苷，然後按照例1中所述的解除保護方法(除了省去了用氟化四丁銨和乙酸處理的步驟以外)處理上述產物，將產物2′，5′-三苯甲基-C3(化合物45，表5)分離，用DEAE-Sephadex A-25色譜法進行提純並冷凍乾燥，從而得到非晶形純淨化合物。
本發明三聚物核心分子的5′-單磷酸酯可以由完全保護的2′，5′-三核苷二磷酸雙三酯通過如例1中所述的脫三苯甲基過程，隨後再與二-對硝基苯-乙基磷醯氯反應來製得，經過例1中所述的萃取、層析及除保護就會得到5′-單磷酸三聚物的分離物。該製備過程以例6中的方法為例。
例65′-O-磷醯-3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷的製備0.1毫摩爾N6-苯甲醯基-5′-O-對-甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷醯(2′-O-氯苯-5′)N6-苯甲醯基-3′-脫氧腺苷醯基(2′-O-氯苯-5′)N6，N6，2′-O-三苯甲醯基-3′-脫氧腺苷的製備過程如下由3′-脫氧腺苷通過苯甲醯基化，5′-甲苯磺醯化以及2′-磷醯化，用三異丙基甲苯磺醯基-硝基-1，2，4-三唑處理其反應產物N6-苯甲醯基(2-三乙基氨-O-氯苯磺醯基-5)-5′-甲苯磺醯基-3′-脫氧腺苷和2′-氰基乙基磷醯基-O-氯苯-3′-脫氧腺苷從而形成二核苷磷酸三酯，N6-苯甲醯基(2-O-氯苯磷醯基-5)3′-脫氧腺苷，用N6，2′-O-二苯甲醯基-3′-脫氧腺苷縮合由此形成的完全保護的二聚物，從而形成三聚物，根據Charubala R.和Pfleiderer，W.在Tetrahedron Lett.21 4077(1980)中所述的方法製得0.01毫摩爾該三聚物，並用2毫升，2%對-甲苯磺酸溶液在二氯甲烷/甲醇中，(7/3，容積/容積)在室溫下處理30分鐘以除去對-甲氧基三苯甲基基團，在製備平板上用氯仿/甲醇(95/5容積/容積)進行矽膠色譜法提純，從而得到90%產率的5′-解除保護的類似物。
將該產物溶解於1毫升無水吡啶中，並用0.27毫摩爾二-硝基苯-乙基-磷醯氯以Himmelsbach，F.和Pfleiberer，W.在Tetrahedron Lett.23，4973(1982)中所述的形式在室溫下處理1小時，在用15毫升氯仿稀釋後，用磷酸鹽緩衝液(pH7)將該反應混合物萃取三次，將其有機層用Na2SO4乾燥，過濾、蒸發並和10毫升甲苯共蒸發，重複三次，將其殘餘物在製備平板上進行矽膠色譜提純(在氯仿/甲醇中，9/1容積/容積)從而產生81%的5′-O-雙-對-硝基苯乙基磷醯基-N6-苯甲醯基-3′-脫氧腺苷醯基-(2′-O-氯苯-5′)N6苯甲醯基-3′-脫氧腺苷醯基(2′-O-氯苯基-5′)N6，2′-O-三苯甲醯基-3′-脫氧腺苷它是一種非晶形固體。
根據例1中所述的解除保護方法用O-硝基苯甲醛肟處理0.01毫摩爾上述最後的物質，從而除去O-氯苯保護基團。在蒸發至乾燥並和無水吡啶共蒸發若干次後，將該去除保護的產物溶解於10毫升、0.5M的二氮二雜環〔4，3，0〕十一碳烯在無水吡啶中的溶液中，並在室溫下攪拌36小時，從而通過β-消除使對-硝基苯乙基基團斷裂，將其溶液再次蒸發，然後用20毫升濃氫氧化氨在室溫下處理24小時，通過DEAE-Sephadax層析並對主要組分進行冷凍乾燥可以使三聚物核心5′-單磷酸酯(化合物46，表5)提純及分離。
本發明的四聚物核心分子可以通過以下的例7或例8中的方法來製得。
例7腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷的製備將0.5毫摩爾完全保護的、具有化學式(Ⅵ)的化合物47和0.4毫摩爾N6-苯甲醯基-3′-脫氧腺苷醯基(2′-O-氯苯-5′)N6，2′-O-二苯甲醯基-3′-脫氧腺苷(化合物24，表3)溶解在5毫升無水吡啶中。
在加入1毫摩爾2，4，6-三異丙基苯磺醯基氯和3毫摩爾1-甲基咪唑以後，將混合物在室溫下攪拌2小時，將其溶液用400毫升氯仿稀釋，用400毫升水衝洗兩次，然後將其有機層用硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發至幹，其殘留物用50毫升甲苯共蒸發兩次，先用氯仿，後同氯仿/甲醇(99/1-98/1，容積/容積)梯度在矽膠柱(20×2.5釐米)進行色譜法提純，蒸發後，主要組分能產生固體泡沫體狀化合物48(表6)，產率為80%化合物48是一種完全保護的，如下列四聚物核心(Ⅶ)通式的2′，5′-四核苷三磷酸三三酯，按照例1中所述的方法將保護基團解除，即能產生2′，5′-A-A-C-C(化合物49，表6)經DEAESephadex色譜法，蒸發及冷凍乾燥，結果以80%的產率產生非晶性固體。
表6化合物編號 R R1R2R348BzMMTrSiTBD2-氯苯基49HHHH
例83′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷的製備將0.1毫摩爾N6-苯甲醯基-5′-O-對-甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷醯基(2′-O-氯苯-5′)N6-苯甲醯基-3′-脫氧腺苷醯(2′-O-氯苯-5′)N6，N6，2′-O-三苯甲醯基-3′-脫氧腺苷(化合物50，表7)，一種完全保護的，如反應劑(Ⅷ)通式的2′，5′-三核苷二磷酸雙三酯用2毫升，2%對-甲苯磺酸的二氯甲烷/甲醇(4/1，容積/容積)溶液在室溫下處理30分鐘。
表7化合物號R50MMTr51H
加入20毫升磷酸鹽緩衝劑(pH7)停止反應，將該溶液用200毫升氯仿萃取若干次，將有機層用水洗，通過硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發至較小體積，從而在製備矽膠平板上用氯仿/甲醇，(95/5，容積/容積)進行提純。用氯仿/甲醇，(4/1，容積/容積)提洗其主帶，從而在蒸發後產生5′-去除三苯甲基的化合物51(表7)，產率為80%。
然後用0.1毫摩爾吡啶鎓N6-苯甲醯基-5′-O-對-甲氧基三苯甲基-3′-脫氧腺苷-2′-(2-O-氯苯)磷酸酯(化合物2，表1)在0.6毫升無水吡啶中，在0.2毫摩爾2，4，6-三異丙基甲苯磺醯氯和0.6毫摩爾1-甲基咪唑存在下將0.05毫摩爾化合物51(表7)在室溫下縮合2小時，用100毫升氯仿稀釋該溶液，並用水洗兩次，通過硫酸鈉乾燥並蒸發至較小容積，在製備矽膠平板上用氯仿/甲醇(95/5，容積/容積)進行分離，用氯仿提洗其主帶。經蒸發即能產生完全保護的2′，5′-四核苷三磷酸三三酯化合物52(表8，如後)，它是一種非晶性固體，產率為84%。
根據例1中所述的方法除去化合物52上的封閉基因，隨後進行DEAE-Sephadex色譜法並冷凍乾燥，結果產生四聚物核心2′，5′-C-C-C-C(化合物53，表8)以70%的產率得到一種非晶性固體，化合物53的結構如四聚物核心(Ⅸ)通式。
從完全保護的2′，5′-四核苷三磷酸三三酯通過例1中所述的5′-脫三苯甲基方法，然後再與二-對-硝基苯乙基磷醯氯反應可以製得本發明四聚核心分子的5′-O-單磷酸酯，經過如例1中所述的萃取、色譜法、解封即能使5′-O-單磷酸酯四聚物分離。
該製備過程舉例於上面的例6中。
表8化合物號 R R1R252BzMMTr2-氯苯基53HHH本發明三聚物和四聚物核心分子的5′-二磷酸酯和5′-三磷酸酯可以如下製備在1毫升的二甲基甲醯胺中的成為無水三丁銨鹽形式的0.1毫M單磷酸酯化核心以及0.5毫M1.1-羰基二咪唑中加入0.5毫M溶解於5毫升二甲基甲醯胺中的焦磷酸三丁銨，室溫下20小時以後，用5毫升甲醇處理該反應物，蒸發至幹並在2×20釐米DEAE纖維柱上進行色譜層析，隨著三乙銨碳酸氫鹽線性梯度(0-0.4M，3升，pH為7.5)分離5′-雙和三磷酸酯，該方法在Hoard，D.E.和Ott，D.G.，在J.Amer.Chem.Soc.87，1785-1788(1965)中描述了，該文獻通過參考被結合在本文中，然後通過DEAE-SephadexA25和SephadexG-10色譜，將5′-雙磷酸酯和5′-三磷酸酯提純。
通過對2′，5′-寡聚腺苷酸分子上的2′-端核苷、糖苷配基和/或核糖基部分作結構修飾，可以提供能有效抑制病毒複製，尤其是反轉錄病毒如HIV複製的分子，這些合成分子比天然存在的2′，5′-寡聚腺苷酸分子更具有生物學活性，代謝上更穩定。
本發明化合物的抗反轉錄病毒活性可以通過下列實驗方法來證實，在這些方法中，本發明的任何一種核心化合物或它們的5′-單，-雙-，或三磷酸酯對應物可以代替下列實驗中的任意一種類似物，具有本說明書中對這樣一些化合物所公開的功效。
根據下列實驗，可以看到2′，5′-寡聚腺苷酸類似物能在體外明顯抑制HIV-1反轉錄酶活性並保護靶細胞免受HIV-1感染。
例9體外抑制HIV-1反轉錄酶活性細胞和病毒。用高HIV-1允許的T-細胞系MT-2的細胞(Miyoshi等人，nature294770-771(1981))作為HIV-1(HTLV-ⅢB)感染過的靶細胞HIV-1(HTLV-ⅢB)是在H9細胞中產生的(Popovic等人，Science 224497-500(1984))，將原種培養物生長，維持在含有12%熱未活化的母牛血清和50微克艮他黴素/毫升的RPMI-1640中，並在37℃下培養，這項研究中給出的感染多重性(即感染的病毒粒子/細胞)的病毒滴度可以由50%組織培養感染劑量值計算得到，該劑量值可以通過在MT-2細胞上進行終點微滴定獲得(如Montefios等人在J.Clin.Microbiol.26231-235(1987)中所述)反轉錄酶分析測定，將無細胞(0.45微摩爾過濾過的)調節的H9/HTLV-ⅢB培養物上清液，通過在Beckman JA-20轉子中以18，000轉/分鐘在20℃下離心4小時，使病毒濃縮。將從50毫升調節過的培養物液體獲得的病毒粒子溶解在0.5毫升含有1.7克摩爾Tris-Hcl(pH7.8)3毫摩爾二硫蘇糖醇(DTT)，55毫摩爾Kcl，0.32%重量/容積三硝甲苯X-100和33%甘油的溶液中，將該病毒溶胞產物貯藏在-20℃下並用作為HIV-1反轉錄酶源，加入10微升酶以後，反轉錄酶反應在100微升反應體積中進行，該反應體積中含有40毫摩爾Tris-Ncl((pH7.8)，4毫摩爾DTT，50毫摩爾Kcl，10毫摩爾MgCl2，0.0325%重量/容積三硝基甲苯X-100，3微摩爾〔33H〕DTTP(80居裡/毫摩爾，NEN)以及聚(A)、(dT)15(2.5微克/毫升)樣板始物，在調節水體積使反應體積保持不變以後，以不同濃度加入抑制劑，在潮溼環境中，將反應物在37℃下培養1小時，加入2毫升，10%冷三氯乙酸停止反應在0.45微米乙酸纖維素微孔濾器上收集其沉澱物，然後將它溶解在10毫升3a70B含水閃爍體中，並用BeckmanLS6800液體閃爍分光劑計算其每分鐘計數。
感染測定.通過體外微滴度感染測定，(如Montefior等人，同上面文獻中所述)可以觀察到並定量測定各種化合物的抗-HIV-1的活性。簡而言之，即將MT-2細胞一式三份加入到96孔、含有2倍連續稀釋效應物的微稀釋平板中。加入病毒，使之大量感染HIV-1，將該平板在潮溼的5%CO2/空氣的環境中於37℃下培養4天，然後通過聚-L-賴氨酸粘滯細胞的活體染色(中性紅)吸收定量測定的活的細胞數，作為細胞致病效果的測量。此時，病毒對比孔(沒有效應物存在的細胞和病毒)中細胞溶解量高於90%;百分保護值由發生在細胞對比孔(沒有病毒和效應物存在的細胞)和病毒對比孔之間的A540讀數範圍確定。
細胞毒性測定.細胞毒性可以用MT-2細胞在微孔稀釋板中如上所述地進行定量測定，除了其中省去了病毒並且用空(空白)孔代替病毒對比孔以外。居於細胞對比孔和空白孔之間的A540讀數範圍可以被用來計算經過3天培養後試驗孔中存活細胞的百分數。
2-5A類似物對HIV-1反轉錄酶活性的作用示於表9和圖1中，例如用2′，5′-蟲草品三聚物核心(C3)，三聚物5′-單，雙，和三磷酸酯(PC3，P2C3，P3C3)，2′，5′-蟲草品四聚物5′-單磷酸酯(PC4)，還有2′，5′-A-C-A。可以看到取決於濃度的酶活性的抑制作用，(圖1)。2′，5′-蟲草品三聚物5′-三磷酸酯(P3C3)是最有效的抑制劑(60微摩爾時100%抑制)，其次是5，6-二氯苯並咪唑核苷2′，5′-三聚物(200微摩爾時73%抑制)，2′，5′-PC4(100微摩爾時58%抑制)，2′，5′-A-A-ara-A(200微摩爾時53%抑制)，2′，5′-A-C-A(200微摩爾時50%抑制)(表9)表92-5A類似物對HIV-1反轉錄酶活性的作用2-5A或2′，5′類似物濃度(微摩爾)百分抑制a(腺苷)A4000A3200 0pA3200 29p3A3200 0蟲草品(C)4000C3200 31pC3200 5p3C360 100C4200 39pC4100 58A-C-C20042A-A-C20016C-A-C 200 36bA-C-A20058A-A-C-C 200 35bA-A-C-A2007pI3200 35
A-A-ara-A20053Tu-Tu-Tu20041xylo-A4200 15A-A-A-3′-氨基20043EHNA-A-A200365，6-二氯苯並咪唑基(2′，5′)-200735，6-二氯苯並咪唑基(2′，5′)-5，6-二氯苯並咪唑核苷a.對比反應值(即沒有抑制劑存在時)高於180，000cpm.而空白反應(無酶存在)值低於12，000cpm。
b.兩次或兩次以上實驗的平均值。
圖2中表示了用某種2-5A類似物進行感染測定的結果，參照圖2，可以看到2′，5′-蟲草品三聚物核心(Ⅰ)和5′-單磷酸酯(Ⅳ)(外源濃度為8-250微摩爾)以及2′，5′-A-C-A(Ⅴ)(外源濃度為1-8微摩爾)具有的取決於濃度的抗HIV-1活性，由失配dsRNA(數據未示出)提供的最佳抗HIV-1活性分別為84%，80%和81%。這是相當明顯的抗HIV活性，由此我們可以認為該失配dsRNA是一種有效的體外抗-HIV藥物，參見Montefior等人，Proc.natl.Acad.Sci.USA 842985-2989(1987)。2′，5′-PC4(Ⅵ)在濃度為12.5-50微摩爾時取決於濃度的抗HIV-1活性效力較低，C3和A-C-A在最有效濃度時不顯出細胞毒性，而PC3和PC4在某些最佳抗病毒濃度時具有較弱毒性。
與此相反，蟲草品(Ⅰ)(0.31-10微摩爾)和2′，5′-寡聚腺苷酸三聚物核心(Ⅱ)(8-250微摩爾)則不具備抗病毒活性，當蟲草品外源濃度高於2.5微摩爾時顯示細胞毒性，而2′，5′-寡聚腺苷酸三聚物核心在任何濃度下未觀察到毒性。2′，5′-蟲草品四聚物5′-單磷酸酯(Ⅵ)在體外具有較弱的抗-HIV-1活性(外源濃度為12.5至50微摩爾時，保護率為30%-38%)，但當其濃度高於50微摩爾時則對細胞有毒(數據未列出)在相同的感染測定中，2′，5′-木-A4在濃度為150微摩爾時具有100%的抑制(濃度為75微摩爾時為91%)，而2′，5′-A-A-A-3′-氨基在濃度為75微摩爾時能100%抑制，在這些劑量下沒有觀察到毒性。
當與其它藥物結合使用時，2-5A類似物的抗-HIV活性能有所增加，這一點可以由下列實驗證實。
例10在本例中將測試2′，5′-C3對重組α-幹擾素(rIFN-αA)和幹擾素的失配dsRNA誘導物體外抗病毒活性增效或消效的能力。每一種藥物單獨或結合地取8種無毒性濃度進行標準格子體分析，用Chou和Talay在Adu.Enzyme Regul.2227-55(1984)中所述的方法對這些數據進行處理。簡而言之，由百分保護值計算結合的藥物效果，由劑量一效果曲線的斜率計算出結合指數(CI)，並對該百分保護值或影響分數作圖，CI值小於1時表示增效，大於1時表示消效，等於1時表示相加，這些結果被表示在圖3中2′，5′-蟲草品三聚物核心和rIFN-αA以及失配dsRNA在每一種藥物劑量最有效時具有強力增效作用，rIFN-αA的增效作用強於失配dsRNA。
針對合成或分析過程引用的所有文獻通過參考均結合在本文中。
本發明還可以以其他的特定形式體現而不脫離其實質或基本屬性。因此，應該將所附的權利要求書而不是說明書作為本發明的範圍。
權利要求
1.治療哺乳動物的以2-5A通道缺陷為特徵的失調症的組合物的製備方法，它包括將至少一種化學式為
的化合物或它的一種藥用鹽與一種藥用載體結合，其中n為1至8的正整數，m為0，1，2或3，R，只要所有R在同一化合物中不都是羥基，則每個R可以相同或不同地選自於氫、羥基、氨基，C1-C10烷氧和-OSi(CH3)2C(CH3)3。
2.根據權利要求1的方法，其中n為1-3。
3.根據權利要求2的方法，其中2′一端核苷酸上的R基團不是羥基。
4.根據權利要求1，用來治療反轉錄病毒感染的方法。
5.根據權利要求4，用來治療HIV感染的方法。
6.根據權利要求2的方法，其中每個R可以相同或不同地選自於氫和羥基。
7.根據權利要求6的方法，其中化合物選自於3′-脫氧腺苷醯基-(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷，以及5′-單，雙，三磷酸酯以及它們的藥用鹽。
8.根據權利要求7的方法，其中化合物包含5′-三磷酸酯或其藥用鹽。
9.根據權利要求6的方法，其中化合物是選自於3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷。其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
10.根據權利要求6的方法，其中化合物是選自於腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷，其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
11.根據權利要求6的方法，其中化合物是選自於腺苷醯基(2′，5′)-腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷，其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
12.根據權利要求6的方法，其中化合物是選自於3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷，其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
13.根據權利要求6的方法，其中化合物是選自於腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷，其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
14.根據權利要求13的方法，其中化合物是包含腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)腺苷或其藥用鹽。
15.根據權利要求6的方法，其中化合物是選自於腺苷醯基(2′，5′)-腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯(2′，5′)3′-脫氧腺苷，其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
16.根據權利要求6的方法，其中化合物選自於腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯(2′，5′)腺苷，其5′單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
17.根據權利要求5的方法，其中每個R是相同的或不同的，由羥基和氨基中選出。
18.根據權利要求17的方法，其中化合物選自於腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-氨基-3′-脫氧腺苷，其5′-單，雙，三磷酸酯，以及它們的藥用鹽。
19.根據權利要求18的方法，其中化合物是包含腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)3′-氨基-3′-脫氧腺苷，或其藥用鹽。
20.治療哺乳動物的以2-5A通道缺陷為特徵的失調症的組合物的製備方法，還包括將至少一種下列化合物，或其5′-單，雙，三磷酸酯或它們的藥用鹽中選出的化合物與一種藥物載體結合;3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)-(R)-3′-(2-脫氧-β-D-赤戊呋喃糖基)-3，6-7.8-四氫咪唑〔4，5-d〕〔1，3〕二氮雜草-8-酚。腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)殺結核菌素。殺結核菌醯(2′，5′)殺結核菌醯(2′，5′)殺結核菌素。腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)9-β-D-阿糖呋喃腺苷，肌苷醯基(2′，5′)肌苷醯基(2′，5′)肌苷，木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷，木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷，赤-9(2-羥基-3-壬基)腺苷醯基(2′，5′)-腺苷醯基(2′，5′)腺苷，5，6-二氯苯並咪唑基(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑基(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑。
21.根據權利要求20，用來治療反轉錄病毒感染的方法。
22.根據權利要求21，治療HIV感染的方法。
23.根據權利要求20的方法，其中化合物是包含3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)3′-脫氧腺苷醯基(2′，5′)-(R)-3-(2-脫氧-β-D-赤戊呋喃糖基)-3，6，7，8-四氫咪唑〔4，5-d〕〔1，3〕二氮雜草-8-酚，其5′-單，雙，三磷酸酯，或它們的藥用鹽。
24.根據權利要求20的方法，其中化合物包含腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)殺結核菌素，其5′單，雙，或三磷酸酯，或它們的藥用鹽。
25.根據權利要求20的方法，其中化合物包含腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)9-β-D-阿糖呋喃腺苷，其5′單，雙或三磷酸酯，或它們的藥用鹽。
26.根據權利要求20的方法，其中化合物包含肌苷醯基(2′，5′)肌苷醯基(2′，5′)肌苷，其5′單，雙，或三磷酸酯，或它們的藥用鹽。
27.根據權利要求20的方法，其中化合物包含木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷，其5′單，雙，或三磷酯，或它們的藥用鹽。
28.根據權利要求20的方法，其中化合物包含木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷醯基(2′，5′)木腺苷，其5′單，雙，或三磷酸，或它們的藥用鹽。
29.根據權利要求20的方法，其中化合物包含殺結核菌醯基(2′，5′)殺結核菌醯基(2′，5′)殺結核菌素，其5′單，雙，或三磷酸酯，或它們的藥用鹽。
30.根據權利要求20的方法，其中化合物包含赤-9(2-羥基-3-壬基)腺苷醯基(2′，5′)腺苷醯基(2′，5′)腺苷，其5′單，雙，或三磷酸酯或它們的藥用鹽。
31.根據權利要求20的方法，其中化合物包含5.6-二氯苯並咪唑基(2′，5′)5.6-二氯苯並咪唑基(2′，5′)5，6-二氯苯並咪唑核苷，其5′單，雙，或三磷酸酯，或它們的藥用鹽。
全文摘要
2′、5′-寡聚腺苷酸的合成類似物是有效的治療試劑，尤其是對HIV感染。其中，所述腺苷酸上的糖苷配基，該糖基部分，和/或端部該苷已被修飾，該類似物可用於治療以療以2-5A通道缺陷為特徵的失調症的組合物和方法中。
文檔編號A61K31/7052GK1040321SQ8910623
公開日1990年3月14日 申請日期1989年6月9日 優先權日1988年6月9日
發明者羅伯特·J·薩哈道爾尼克, 沃爾福岡·坡夫雷德勒 申請人:坦普爾大學