控制共聚聚酯組成的培養方法
2023-06-21 22:32:51 1
專利名稱：控制共聚聚酯組成的培養方法
技術領域：
本發明涉及控制由微生物產生的共聚聚酯組成的培養方法。
背景技術：
在多數的微生物中，在菌體內儲存聚酯作為能量儲備物質現在已經公知。其代表例是聚-3-羥丁酸(以下簡稱P(3HB))。P(3HB)是熱塑性高分子，在自然環境中被生物分解，因此，作為對環境無害的綠色塑料而受到關注。但是由於P(3HB)的結晶度高，而且具有堅硬、易碎的性質，因此從實用性考慮，其應用範圍受到限制。因此，一直以來都在開展以改善其性質為目的的研究。
其中，開發了包含3-羥丁酸(以下簡稱3HB)和3-羥戊酸(以下簡稱3HV)的共聚物P(3HB-co-3HV)的製造方法(特開昭57-150393號公報；特開昭59-220192號公報；特表平11-500008號公報)。一般認為，該P(3HB-co-3HV)與P(3HB)相比，其富有柔軟性，因此能夠應用於廣泛的用途。在這些專利文獻中的共聚物的製造方法，與以前的P(3HB)的製造方法同樣地在前期使菌體增殖，在後期限制氮或磷培養微生物，從而製造共聚物。另外，對於P(3HB-co-3HV)，隨著3HV含有率的增加柔韌性會發生變化，因此，還一直在進行控制3HV的組成比的研究。例如，在特開昭57-150393號公報或者特開昭63-269989號公報中使用丙酸，另外，在特公平7-79705號公報中使用丙烷-1-醇，並通過改變向這些培養基中的添加量而使3HV的含有率變化，從而製造3HV含有率為10-90mol％的P(3HB-co-3HV)。然而，在實際的情況中，即使增加P(3HB-co-3HV)的3HV的含有率，隨之產生的物性的變化也很小，尤其柔韌性也不會提高至能夠滿足用於薄膜等使用的程度，因此，只能用於洗髮劑瓶或者一次性剃刀的手柄等硬成型品領域。
在這樣的狀況下，為了克服上述3HB和3HV的共聚物的缺點，對含有3HB和3HV以外的羥基酸，例如3-羥基丙酸(以下簡稱3HP)、3-羥基己酸(以下簡稱3HH)、3-羥基辛酸(以下簡稱3HO)、3-羥基壬酸(以下簡稱3HN)、3-羥基癸酸(以下簡稱3HD)、3-羥基月桂酸(以下簡稱3HDD)等作為構成成分的共聚聚酯進行了積極地研究(Poirier Y.，Nawrath C.，Somerville C，BIO/TECHNOLOGY，13，142-150，1995年)。其中，應該關注的是對於含有3HB和3HH的共聚聚酯，特別是僅含3HB和3HH的共聚物P(3HB-co-3HH)及其製備方法的研究(特開平5-93049號公報；特開平7-265065號公報)。這些專利文獻的P(3HB-co-3HH)的製造方法是使用由土壤分離的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，並由油酸等脂肪酸或者橄欖油等油脂進行發酵生產的方法。另外，還開展了對於P(3HB-co-3HH)性質的研究(Y.Doi，S.Kitamura，H.Abe，Macromolecules 28，4822-4823，1995年)。在該報導中，把碳原子數12或12以上的脂肪酸作為唯一的碳源培養豚鼠氣單胞菌(A.caviae)，並發酵生產3HH含有率為11-19mol％的P(3HB-co-3HH)。其結果很明顯，隨著3HH含有率的增加，該P(3HB-co-3HH)由P(3HB)堅硬、易碎的性質逐漸顯示出柔韌的性質，並顯示出超過P(3HB-co-3HV)的柔韌性。
另外，還報導了下列技術，克隆豚鼠氣單胞菌(A.caviae)的聚羥基鏈烷酸(PHA)合酶基因，將該基因重組到具有90％或90％以上的高聚羥基丁酸(PHB)蓄能的真養羅爾斯通屬(R.eutropha)，使用所得重組菌株，以脂肪酸作為碳源而生產P(3HB-co-3HH)(T.Fukui，Y.doi，J.Bacteriol.，vol.179，No.15，4821-4830，1997年；特開平10-108682號公報)。其中，報導了通過把辛酸鈉作為碳源，從而能夠生產3HH含有率為10-20mol％的P(3HB-co-3HH)。此外，最近在使用上述重組菌株生產聚酯的時候，還公開了使用多種碳源的方法，並且現已知道作為碳源使用的油脂或者脂肪酸的碳原子數對於P(3HB-co-3HH)的3HH合有率有所影響(特開2001-340078號公報)。
現在普遍認為，如果能夠在較大的任意範圍內控制P(3HB-co-3HH)等共聚聚酯的單體單元的組成比，尤其是控制3HH含有率製造共聚物的話，就可以由生產的堅硬共聚物直到能夠發酵生產柔軟的共聚物，並可以期待應用於從電視機殼體等要求有硬度的物體，直到要求絲或薄膜等柔韌性物體的廣泛領域。
如上所述，對於P(3HB-co-3HH)等共聚聚酯，從實現實用化、商業化以及滿足消費者要求的方面來看，確立能夠任意控制其組成比的技術是最重要的。另一個成為實用化障礙的是生產成本問題。與此相對，在以前的共聚聚酯的製造方法中，為了聚合3HB以外的單體單元或者為了提高其含有率，需要向培養基中添加高價的特定的脂肪酸(特表平11-500008號公報；特開2001-340078號公報)。此外，在P(3HB-co-3HH)的情況下，在已經公開的任何方法中，菌體的產率都很低，而且為了提高3HH含有率，不但需要高價的碳源還存在產率下降的趨勢，因此，以前的方法不能作為使該聚合物實用化的生產方法而進行應用。如上所述，控制共聚聚酯單體單元的組成比對於將其應用於廣泛領域是必不可少的。因此，期待著開發一種能夠低成本地實現高的菌體產率和聚合物含量，且任意地控制共聚聚酯組成的生產方法。
發明概述鑑於上述現狀，本發明提供一種能夠控制生物降解性共聚聚酯的組成，且低成本地實現高產率的生產方法。
本發明者進行了各種研究，特別對發酵原料、價格、供應穩定性、質量穩定性、菌體或者聚合物的收率等進行了研究，其結果是成功地實現了使用廉價油脂作為碳源的培養基，培養儲備共聚聚酯的微生物，並且保持高產率，而且，即使不使用高價脂肪酸等作為碳源，也能夠把聚合物組成良好地控制在任何範圍內。
即，本發明的要點是涉及當使用微生物生產共聚聚酯時，在整個培養期間把作為碳源使用的油脂的比基質供給速率(比基質供給速度)控制為定值的培養方法，或者將培養時期分成菌體增殖期和聚酯儲備期2個階段，並在各個階段把比基質供給速率控制為定值的培養方法。進一步涉及通過選擇油脂種類和/或油脂的比基質供給速率的控制值，任意地控制生成的共聚聚酯組成的培養方法。
發明詳述以下，詳細地描述本發明。
本發明的控制共聚聚酯組成的培養方法，其特徵在於，利用微生物生成共聚聚酯，在整個培養期間把作為碳源使用的油脂的比基質供給速率控制為定值，或者將培養時期分成菌體增殖期和聚酯儲備期2個階段，並在各個階段把比基質供給速率控制為定值。如上所述，本培養方法應用於使用微生物生產生物降解性共聚聚酯的時候。
對於本發明培養方法能夠應用的共聚聚酯，沒有特別地限制，是使至少2種單體單元聚合得到的共聚聚酯。該共聚聚酯的代表性物質，具體地可以列舉包含3HB和3HH的共聚聚酯P(3HB-co-3HH)或者包含3HB和3HH和3HV三種成分的共聚物以及包含由假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌產生的3HB、3HH、3HO、3HD、3HDD等多成分作為其構成要素的共聚物(I.K.P.Tan，K.S.Kumar，M.Theanmalar，S.N.Gan，B.Gordon III，Appl.Microbiol.Biotechnol.47，207-211，1997；R.D.Ashby，T.A.Foglia，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49，431-437，1998)。其中，從通過改變共聚聚酯單體單元的組成比特別是改變3HH的含有率，聚酯的特性會發生很大變化的角度考慮，優選含有3HH作為其單體單元之一的共聚物，更優選P(3HB-co-3HH)。
在本發明的培養方法中，對於使用的微生物沒有特別的限制，可以使用由天然分離的微生物或者保藏在菌株保藏機構(例如IFO、ATCC等)的微生物等。具體地可以使用產鹼菌屬(Alcaligenes)、羅爾斯通屬(Ralstonia)、豚鼠氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)等的菌類。
另外，當上述微生物在野生型狀態下不能生產目標共聚物或者其產量較低的情況下，可以向上述微生物導入目標共聚聚酯的聚合酶基因而進行轉化，使用得到的轉基因微生物。當製備轉基因微生物時，可以使用利用含聚酯聚合酶基因的重組載體等普通的方法，對於該載體，可以使用在該菌體內能夠自我複製的質粒載體。還可以把該聚酯聚合酶基因直接重組到宿主的染色體中，宿主可以使用產鹼菌屬(Alcaligenies)、羅爾斯通屬(Ralstonia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)等菌類。
對於在本發明的共聚聚酯的生產中使用的聚酯聚合酶基因沒有特別地限制，優選由豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)分離的基因，例如，可以使用特開平10-108682號公報中記載的基因片斷。
另外，可以按照公知的方法向微生物中導入重組載體。例如，可以使用接合法、鈣法或者電穿孔法等。
作為本發明中使用微生物的一例，可以優選使用向真養羅爾斯通菌(Ralstonia eutropha)中導入源自豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)的聚酯聚合酶基因的Ralstonia eutropha PHB-4/p JRDEE32d13菌株(T.Fukui，Y.Doi，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49，333-336，1998)。
而且，根據布達佩斯條約，將該Ralstonia eutropha PHB-4/p JRDEE32d13菌株，以名稱為真氧產鹼菌AC32(Alcaligenes eutrophus AC32)，保藏編號為FERM BP-6038，在平成9年8月7日在位於日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保管中心進行國際保藏。
在本發明的培養方法中，為生產共聚聚酯，從價格、供應穩定性、質量穩定性、菌體或者聚酯收率等角度考慮發酵原料，使用廉價的油脂作為主要的碳源。這裡所謂的「主要」是指佔全部碳源的50％或50％以上。除油脂以外的碳源例如可以列舉葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等糖類。
除碳源以外的營養物可以使用含氮源、無機鹽類、維生素類和其他有機營養物的培養基。碳源例如可以列舉氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽等的無機碳源；腖、肉提取物、酵母提取物等有機氮源。無機鹽類例如可以列舉磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。維生素類例如可以列舉維生素B1、維生素B12、維生素C等。其他的有機營養物例如可以列舉甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等胺基酸等。然而，由降低生產成本的觀點考慮，優選使用最少量的腖、肉提取物、酵母提取物等有機氮源；甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等胺基酸等；維生素B1、維生素B12、維生素C等維生素類。優選使作為高價有機氮源的腖、酵母提取物、肉提取物等的用量維持在最少量。
一般來說，優選在對氮或者磷等增殖所需的營養物進行某種程度限制的條件下利用微生物生產聚酯。在本發明中也可以進行那樣的營養物限制，其中，更優選對氮或者磷進行限制，進一步優選不對氮進行限制而對磷進行限制。而且，對磷進行限制並不是指在培養基中完全不含磷原子，而是指最低限度地含有作為增殖所需的營養物的磷，即為根據磷規定菌體增殖量的狀態，而且並不排除在培養基中以無機鹽的形式含有磷的情況。
在本發明中作為碳源使用的油脂，可以使用大豆油、玉米油、棉籽油、棕櫚油、棕櫚核油、椰子油、花生油等能夠比較穩定地供應的天然油脂；對這些油脂進行分餾而得到的各餾分(例如，棕櫚W油精油(パ一ムWオレイソ油，對棕櫚油進行2次無溶劑分餾而得到的低熔點餾分)、棕櫚核油油精(パ一ム核油オレイソ，對棕櫚核油進行1次無溶劑分餾而得到的低熔點餾分)等)的分餾油脂；對這些天然油脂或者其餾分進行化學或者生物化學處理而得到的合成油；進一步混合上述這些油脂而得到的混合油等。其中，優選天然油脂、分餾油脂，從成本的角度出發，更優選使用天然油脂或者廉價的分餾油脂。
通過適當地選擇所使用的油脂的種類，能夠控制構成共聚聚酯單體單元的種類及其組成比。例如，在含有3HH的共聚聚酯的生產中，在想要獲得3HH含有率高的共聚聚酯的情況下，優選使用含有月桂酸作為構成油脂脂肪酸的油脂，通常稱為月桂酸油脂的油脂。含有月桂酸作為構成脂肪酸的油脂可以列舉棕櫚核油或椰子油等天然油脂、棕櫚核油油精等分餾油脂或含有這些月桂酸油脂的混合油等。
進一步對P(3HB-co-3HH)的情況進行詳細描述，當使用月桂酸類油脂時，可以製得具有4-20mol％較高的3HH含有率的P(3HB-co-3HH)，當使用大豆油、玉米油、棉籽油、棕櫚油、花生油或者它們的分餾油脂等情況下，可以獲得1-10mol％的較低3HH含有率的P(3HB-co-3HH)。此外，通過使用混和了2種或2種以上這些油脂的油脂，並隨意地改變其混合比例，就能夠任意地控制P(3HB-co-3HH)的3HH含有率。
另外，特別優選作為碳源使用的油脂是含有月桂酸作為其構成脂肪酸的油脂，而且在限制磷的條件下對其進行培養。
一般來說，當在微生物的培養中添加油脂的情況下，作為添加方法，可以考慮一次性大量添加、分開添加、連續或者間歇進料等方法，根據本發明者的研究結果判斷如下，如果一次性大量添加，由於生成的脂肪酸會表現出細胞毒性，使由脂肪酸引起的發泡變得劇烈，導致實際操作陷入困難的狀況。因此，在本發明中，採用使用泵等對碳源油脂進行連續進料或者間歇進料的方法。本發明者們對碳源油脂的最合適的添加方法進行了研究，結果發現通過設計出進料方法，不僅避免了發泡等操作上的問題，而且還能夠控制生成的共聚聚酯的組成。以下，對本發明的培養方法中實施的油脂的進料方法進行詳細地描述。
在本發明的培養方法中，對碳源油脂所進行的進料，使其比基質供給速率在整個培養期間或者在培養的菌體增殖期和聚酯儲備期的各自階段時期內大致保持定值。
上述比基質供給速率是指單位時間內單位淨重菌體所提供的油脂量，即為定義單位淨重菌體的油脂進料速率的培養變量。另外，所謂菌體的淨重，是指由全部菌體的重量減去所含聚酯的重量而得到的菌體重量(乾燥菌體重量)。即，比基質供給速率是利用下式(1)求得的值。
比基質供給速率＝油脂進料速率(g/h)/菌體的淨重(g)＝單位時間的油脂供應量(g/h)/(全部菌體的重量(g)-聚酯的含量(g))在本發明中，為了設定比基質供給速率並將其控制為定值，需要預測菌體淨重的變化。本發明者們對菌體淨重的變化進行了專心地研究，結果成功地通過預備實驗估計出實用的菌體淨重增殖曲線，從而完成了本發明。
根據本發明者們的研究結果，在能夠抑制發泡、且實現穩定培養的油脂的進料速度範圍內，在培養液中存在的油脂的滯留量(佔全部培養液量(培養基+菌體+油脂)的油脂的容積比例)低於10％或10％以下時，沒有發現根據攪拌條件和換氣條件決定的油脂液滴直徑發生大的變化。因此，受液滴表面積控制的基質攝入速率也沒有大的偏差，其結果是可以認為如果油脂種類以及其他培養條件相同，在能夠穩定運轉的油脂進料速度範圍內，菌體淨重的變化可以大致由單一增殖曲線(ひとつの增殖曲線)表示。
另外，生物降解性聚酯的生產是在如下所述控制氮或者磷的培養條件下進行的，因此在氮或者磷耗盡後，菌體淨重幾乎沒有變化而恆定。因此，如果規定了油脂種類和培養條件，在該條件下，在油脂供應並不是不夠充足、而且不是過量供應的範圍內，可以適當地使油脂的進料速率變化(在實際操作中，一邊觀察上清液中的油脂層厚度，一邊調節進料速度)，並採集菌體淨重的變化數據。這樣可以得到菌體的淨重增殖曲線。以此作為基礎，為了使比底物填料速度在整個培養期間或者在上述特定的階段期間內成為設定的某一定值，可以根據上式(1)計算油脂的進料速率，並按照該計算結果連續地(階段性地)或者間隙地改變油脂的進料速率。
另外，作為間接的方法，還可以測定通風排氣中的氧濃度、二氧化碳濃度，並通過氧消耗速率或者二氧化碳產生速率估計菌體的淨重，從而能夠實時地控制比基質供給速率。然而，根據本發明者們的研究結果確認，在氮或磷沒有耗盡的菌體增殖期和耗盡後的聚酯儲備期內，上述的呼吸特性存在著很大變化，因此，優選事先詳細地對增殖期以及生產期的呼吸特性進行研究。
在本發明中，在把油脂的比基質供給速率控制為某一定值的情況下，存在如下2種控制方法，第一種是在整個培養期間把油脂的比基質供給速率控制為某一定值的方法，第二種是把整個培養期間分成菌體增殖期和聚酯儲備期2個階段，在各個階段設定不同的比基質供給速率，並在各個階段期間內控制比基質供給速率為設定的定值的方法，可以使用上述任意1種方法。為了在整個培養期間內或者培養的特定階段期間內把油脂比基質供給速率控制為某一定值，需要連續地(階段性地)或者間歇地變化油脂的進料速率，使其滿足設定的比基質供給速率值。
為了連續地(階段性地)變化油脂的進料速率，例如可以利用計算機控制進料速率。另外，當間歇地或者階段地使進料速率變化時，儘管可以自動的進行控制，但是，從手動也能夠控制進料速率的角度考慮，人工操作很方便。當間歇地或者階段地使進料速率變化時，嚴格地講，並不是總要完全滿足預先設定的比基質供給速率的值，而是可以使其平均值滿足上述設定的比基質供給速率的值。
如上所述，通過本發明的培養方法，即在整個培養期間或者在培養的特定階段期間內，控制油脂的比基質供給速率，並使之成為設定的某一定值，從而首次達到了通過以預培養方法所不能達到的提高共聚聚酯產率和控制單體單元組成比，其中，所述的以前的培養方法是在培養初期全部添加規定量的油脂，或者在培養期間內以固定的油脂進料量進行進料培養，不根據比基質供給速率而憑經驗變化油脂的添加量的方法。
在本說明書中，所謂整個培養期間是指用於生產聚酯的主培養(本培養)中的從培養開始直到培養結束的整個時期。另外，所謂「在整個培養期間把比基質供給速率控制為某一定值」，即在菌體增殖期和聚酯儲備期兩個期間內選擇相同的某一定值的比基質供給速率，並將油脂的進料速率控制為所選擇的該值。這裡所謂的培養的菌體增殖期和聚酯儲備期，在將培養期間大致分成2個階段的情況下，分別是指在培養基中存在足量的氮或磷，活躍地進行菌體增殖，聚酯的儲備速率不是那麼大的前半階段(菌體增殖期)和培養基中的氮或磷的濃度下降，菌體的增殖受到限制，聚酯的儲備速率增大的後半階段(聚酯的儲備期)。根據各自的培養階段設定不同的比基質供給速率值，並在各個階段的時期內，通過將比基質供給速率控制為所設定的某一定值進行培養，從而能夠更有效地提高共聚聚酯的產率和控制單體單元的組成比。
應用於本發明方法的油脂比基質供給速率的範圍也是根據所用油脂的種類和培養階段而確定的，大致為0.05～0.20(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1，優選為0.06～0.15(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1，更優選為0.07～0.12(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1。
在本發明中，首次發現比基質供給速率越小，P(3HB-co-3HH)的3HH含有率就越高。因此，當想要獲得3HH含有率高的P(3HB-co-3HH)的情況下，可以較低(例如0.06～0.08(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1)地設定比基質供給速率進行培養。另外，當根據培養階段變化比基質供給速率時，通過較高(例如，0.09～0.13(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1)地設定培養前半期菌體增殖期的比基質供給速率值，較低(例如，0.06～0.08(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1)地設定培養後半期聚酯儲備期的比基質供給速率值，能夠在不降低共聚聚酯產率的同時更有效地提高3HH含有率。
另外，如上所述，通過適當地選擇油脂種類，也能夠控制生產的共聚聚酯的組成。因此，通過改變油脂種類或者油脂的比基質供給速率的控制值，進一步通過選擇兩者適當的組合，能夠把生產的共聚聚酯的組成，例如P(3HB-co-3HH)的3HH含有率等控制為期望的組成或者比例。
培養溫度可以是該細菌能夠生長的溫度，優選為20～40℃，更優選為25～35℃。對於培養時間沒有特別地限制，可以為1～7天左右，優選為40～70小時。
在如上所述生產聚酯的時候，在利用生產聚酯培養基的主培養中進行比基質供給速率的控制、油脂種類的選擇和氮或磷的控制等。而且，在利用生產聚酯培養基的主培養之前，為了事先使菌體增殖到某種程度，通常預先利用種培養基(種培地)或者預培養基進行培養。在這種情況下，在種培養基或者預培養基中使用的營養物可以使用與上述相同的物質，這些培養基的培養溫度可以分別與利用上述生產聚酯培養基的主培養相同，培養時間分別優選為1～2天。
另外，當使用轉基因微生物時，例如，在利用預培養基進行培養時，還可以添加與存在於載體的抗性基因相應的卡那黴素、氨苄青黴素、四環素等抗生素。
在本發明中，對於從微生物菌體回收共聚聚酯的方法沒有特別地限制，可以採用公知的溶劑提取法、物理粉碎法、化學處理等，例如可以使用如下方法。培養結束後，使用離心機，從培養液分離菌體，利用蒸餾水以及甲醇等洗滌該菌體後，使之乾燥。使用氯仿等有機溶劑從該乾燥菌體種提取聚酯。通過過濾等，由含有該聚酯的有機溶劑溶液除去菌體成分，向該濾液中添加甲醇或己烷等弱溶劑使聚酯沉澱。利用過濾或者離心分離而除去上清液，使之乾燥，並回收聚酯。
例如可以利用氣相色譜法或者核磁共振法等對所得聚酯的單體單元進行分析。
附圖的簡要說明
圖1表示在使用棕櫚核油油精的2次預備實驗中，每單位培養液量的乾燥菌體淨重(g/L)的實測值(圖中的▲、◆)變化和通過其求得的每單位培養液量的乾燥菌體淨重的增殖曲線。
圖2表示把比基質供給速率設定為0.09(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1的情況下，棕櫚核油油精的每單位培養液量的進料速率((g-oil/h)L)的理論值(虛線)和實際上在實施例中進料油脂的每單位培養液量的進料速率的階段性變化圖(實線)。
實施發明的最佳方式下面通過實施例進一步對本發明進行詳細地描述。在以下的實施例中的任何共聚聚酯都生產P(3HB-co-3HH)。當然，本發明的技術範圍並不限於這些實施例，並不限於生產P(3HB-co-3HH)。
例如，通過改變使用的微生物或聚酯聚合酶基因的種類、使用其他油脂作為碳源、添加特定的脂肪酸，可以生產P(3HB-co-3HH)以外的其他共聚物。
而且，在下述各表中，如果沒有特別指出，比基質供給速率的單位為(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1。
(實施例1)按照如下過程培養Ralstonia eutropha PHB-4/p JRDEE32d13菌株(T.Fukui，Y.Doi，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49，333-336，1998)(以下簡稱Red13菌株)。根據布達佩斯條約，將Red13菌株，以名稱為真氧產鹼菌AC32(Alcaligeneseutrophus AC32)，保藏編號為FERM BP-6038，在平成9年8月7日在位於日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心進行國際保藏。
種培養基的組成為1w/v％肉提取物、1w/v％細菌胰蛋白腖、0.2w/v％酵母提取物、0.9w/v％Na2PO4·12H2O、0.15w/v％KH2PO4(pH6.8)。
預培養基的組成為1.1w/v％Na2PO4·12H2O、0.19w/v％KH2PO4、1.29w/v％(NH4)2SO4、0.1w/v％MgSO4·7H2O、2.5w/v％棕櫚W油精油、0.5v/v％微量金屬鹽溶液(在0.1N鹽酸中溶解1.6w/v％FeCl3·6H2O、1w/v％CaCl2·2H2O、0.02w/v％CoCl2·6H2O、0.016w/v％CuSO4·5H2O、0.012w/v％NiCl2·6H2O得到的溶液)、5×10-6w/v％卡那黴素。
聚酯生產培養基的組成為0.385w/v％Na2PO4·12H2O、0.067w/v％KH2PO4、0.291w/v％(NH4)2SO4、0.1w/v％MgSO4·7H2O、0.5v/v％微量金屬鹽溶液(在0.1N鹽酸中溶解1.6w/v％FeCl3·6H2O、1w/v％CaCl2·2H2O、0.02w/v％CoCl2·6H2O、0.016w/v％CuSO4·5H2O、0.012w/v％NiCl2·6H2O得到的溶液)、0.05w/v％的BIOSPUREX200K(消泡劑コグニスヅヤパソ公司制)。碳源使用分餾棕櫚核油得到的低熔點餾分棕櫚核油油精，並在整個培養期間使比基質供給速率分別為0.08、0.09、0.10(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1進行進料。
使用預備試驗的結果求得以控制比基質供給速率為基礎的乾燥菌體淨重的增殖曲線，其中所述的預備試驗使用棕櫚核油油精一邊觀察培養上清液中的油脂層的厚度，一邊調節進料速度而進行培養。即，如圖1所示，根據預備試驗中每單位培養液量的乾燥菌體淨重的變化數據，到培養36小時時為直線增殖，其後每單位培養液量的乾燥菌體淨重保持恆定。
在圖2以及表1中，表示了利用圖1求得的乾燥菌體淨重的增殖曲線，當比基質供給速率設定為0.09(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1時，棕櫚核油油精的每單位培養液量進料速率的理論值(虛線)和實際上在實施例中進料油脂的每單位培養液量進料速率的階段性變化圖(實線)。
而且，在圖1、2以及下述表1～8中，L表示每1L培養液量(培養基、菌體、油脂的總體積)，h表示時間。
表1
將Red13菌株的甘油儲料(グリセロ一ルストツク)(50μl)接種至種培養基(10ml)，在進行24小時培養後，以0.2v/v％接種至裝有3L預培養基的5L缸發酵桶(丸菱バイオエンヅ公司制MDL-500型)。操作條件為，培養溫度30℃、攪拌速度500rpm、通風量1.8L/min，一邊把PH控制在6.7-6.8之間，一邊進行28小時培養。使用7％氫氧化氨水溶液進行PH調節。
聚酯的生產培養是在裝有6L生產培養基的10L缸發酵桶(丸菱バイオエソヅ公司制MDL-1000型)接種1.0v/v％預培養種母(前培餋種母)。操作條件為，培養溫度28℃、攪拌速度400rpm、通風量3.6L/min、PH控制在6.7～6.8之間。使用14％的氫氧化銨溶液調節PH。進行60小時培養，培養進行至第16小時之後，每隔4小時進行取樣，通過離心分離回收菌體，利用甲醇進行洗滌後，冷凍乾燥，測定乾燥菌體的重量。
向約1g所得乾燥菌體中添加100ml氯仿，室溫下攪拌一晝夜，提取菌體內的聚酯。過濾菌體殘渣後，利用蒸發器把總體積濃縮至30ml後，緩慢加入約90ml己烷，充分攪拌後，靜置1小時。過濾析出的聚酯後，在50℃下真空乾燥3小時。測定乾燥的聚酯重量，計算菌體內聚酯的含量。
並且，向所得約20mg乾燥聚酯中添加2ml的硫酸-甲醇混合液(15∶85)和2ml的氯仿並密封，在100℃下加熱140分鐘，得到聚酯分解產物的甲酯。冷卻後，向其中一點一點加入1.5g碳酸氫鈉進行中和，並靜置直到停止產生二氧化碳。添加4ml二異丙基醚，充分混合後，離心，利用毛細管氣相色譜儀對上清液中的聚酯分解產物單體單元的組成進行分析。氣相色譜儀是使用島津公司生產的GC-17A，毛細管柱是使用GLサイエンス公司生產的NEUTRA BOND-1(柱長25m、柱內徑0.25mm、液膜厚0.4μm)。溫度條件為，以8℃/分的速度從初始溫度100℃升溫至200℃，進一步以30℃/分的速度從200℃升溫至290℃。
在表2中表示比基質供給速率的控制對共聚聚酯組成比以及產率帶來的影響。
表2P(3HB-co-3HH)產量(g/L)
3HH含有率(mol％)
由上述結果可以知道，把比基質供給速率控制得越低，產率會略有降低，但是共聚聚酯中的3HH含有率提高。另外還觀察到當比基質供給速率的設定值越低，就能越好地抑制培養中發泡的狀況。
(實施例2)除了使用大豆油代替棕櫚核油油精以外，利用與實施例1同樣的培養基和條件進行培養，得到表3所示的結果。
表3P(3HB-co-3HH)產量(g/L)
3HH含有率(mol％)
如表3所示可以知道，通過使用大豆油，並與使用棕櫚核油油精時同樣較低地控制比基質供給速率，也能提高聚酯中的3HH含有率。然而，在相同的比基質供給速率條件下，對使用大豆油和使用棕櫚核油油精的3HH含有率進行比較可以知道，使用大豆油的3HH含有率明顯偏低，由於作為基質使用的油脂不同，即使把比基質供給速率控制為相同值，所得3HH含有率也存在差異。
與實施例1同樣地將比基質供給速率的設定值控制為最低值0.08(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1時，能夠良好地抑制發泡。
(實施例3)除了基質使用玉米油、棉籽油、棕櫚W油精、棕櫚核油、椰子油、花生油替代棕櫚核油油精，並針對各個油脂分別將比基質供給速率控制為0.06(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1以及0.12(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1以外，利用與實施例1相同的培養基和條件進行培養，得到表4所示結果。在表4中匯總了針對各種油脂，比基質供給速率的控制對共聚聚酯產率以及3HH含有率帶來的影響(只對培養至第60小時的結果進行比較)。
表4
如表4所示可以知道，對於任一種油脂，通過將比基質供給速度控制為較低，產率會略有下降，共聚聚酯中的3HH含有率會提高。另外還可以知道，由於作為基質使用的油脂不同，即使將比基質供給速率控制為相同的值，也能確認培養至第60小時的3HH組成存在明顯差異，利用作為月桂系油脂的椰子油、棕櫚核油，能夠獲得具有約7～14mol％較高3HH含有率的P(3HB-co-3HH)，使用玉米油、棉籽油、棕櫚W油精、花生油，能夠獲得具有約3～6mol較低3HH含有率的P(3HB-co-3HH)。表4的結果表明通過選擇油脂種類或者比基質供給速率的設定值，或者通過確切地組合上述選擇，不但能夠保證高產率，而且還能夠製得具有希望3HH含有率的共聚聚酯。
(實施例4)除了基質使用3種棕櫚核油油精和大豆油的混合油，即混合油A(棕櫚核油油精/大豆油＝75/25(v/v))、混合油B(棕櫚核油油精/大豆油＝50/50(v/v))、混合油C(棕櫚核油油精/大豆油＝25/75(v/v))以外，利用與實施例1同樣的培養基和條件進行培養，得到表5～7所示的結果。在表5～7中匯總了針對各種混合油脂，比基質供給速率的控制對共聚聚酯產率以及3HH含有率帶來的影響。
表5混合油A(棕櫚核油油精/大豆油＝75/25(v/v))P(3HB-co-3HH)產量(g/L)
3HH含有率(mol％)
表6混合油B(棕櫚核油油精/大豆油＝50/50(v/v))P(3HB-co-3HH)產量(g/L)
3HH含有率(mol％)
表7混合油C(棕櫚核油油精/大豆油＝25/75(v/v))p(3HB-co-3HH)產量(g/L)
3HH含有率(mol％)
如表5～7所示可以知道，對於任一種混合油脂，通過將比基質供給速度控制為較低，產率會略有下降，共聚聚酯中的3HH含有率會提高。另外還可以知道，混合油中的棕櫚核油油精的比例越多，3HH含有率就越高。這些結論也可以認為是由合併表5～7以及棕櫚核油油精、大豆油分別為100％情況時而得到的結果得出的。表5～7所示的結果表明除了通過組合實施例3所示的油脂種類和比基質供給速率，還通過混合多種油脂，並進一步調節它們的混合比例，能夠保證高產率，同時還能夠製得具有理想3HH含有率的聚酯。
(實施例5)除了把棕櫚核油油精作為碳源，並將直至培養36小時的菌體增殖期的比基質供給速率控制為0.09(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1，然後將培養36小時以後的聚酯儲備期的比基質供給速率控制為0.08(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1以外，與實施例1同樣地進行培養。
表8
把表8所示結果與實施例1表2所示結果進行比較可以知道，通過在聚酯儲備期少許降低比基質供給速率進行培養，與在整個培養期間將其控制為0.09(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1的情況相比，能夠獲得在不降低產率的條件下，與在整個培養期間將其控制為0.08(g；油脂)×(g；乾燥菌體淨重)-1×(h；時間)-1的情況相同或更高的3HH含有率。
產業利用性在本發明的方法中，通過選擇作為碳源使用油脂的比基質供給速率控制值，進一步地通過適當地組合油脂比基質供給速率控制值和油脂種類，能夠任意地控制使共聚聚酯的物性發生很大變化的聚酯組成，而且能夠穩定地獲得高產率，其中所述共聚聚酯為生物降解性聚合物。因此，能夠在工業上低成本地生產、提供應用範圍廣泛的共聚聚酯。此外，通過控制比基質供給速率，可以良好地抑制由過量供應油脂而引起的發泡，能夠進行穩定地培養。
權利要求
1.一種培養方法，其特徵在於，在利用微生物生產共聚聚酯的過程中，在整個培養期間內把油脂的比基質供給速率控制為定值，其中所述油脂為作為碳源使用的油脂。
2.一種培養方法，其特徵在於，在利用微生物生產共聚聚酯的過程中，在培養的菌體增殖期和聚酯儲備期改變油脂的比基質供給速率，並在各個階段將其控制為定值，其中所述油脂為作為碳源使用的油脂。
3.如權利要求1或2所述的培養方法，其特徵在於，通過選擇油脂的種類和/或油脂的比基質供給速率的控制值，對生產的共聚聚酯組成進行控制。
4.如權利要求1～3中任一項所述的培養方法，其特徵在於，作為碳源使用的油脂是包含選自大豆油、玉米油、棉籽油、棕櫚油、棕櫚核油、椰子油、花生油，以及分餾這些油脂得到的分餾油脂中至少一種油脂的油脂。
5.如權利要求1～4中任一項所述的培養方法，其特徵在於，作為碳源使用的油脂是含有月桂酸作為其構成脂肪酸的油脂，並且在限制磷的條件下進行培養。
6.如權利要求1～5中任一項所述的培養方法，其特徵在於，微生物是屬於選自羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、豚鼠氣單胞菌屬(Aeromonas)、產鹼菌屬(Alcaligenes)以及埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物。
7.如權利要求1-6中任一項所述的培養方法，其特徵在於，微生物是重組聚酯聚合酶基因得到的轉基因微生物。
8.如權利要求1～7中任一項所述的培養方法，其特徵在於，共聚聚酯是含有3-羥基己酸的共聚聚酯。
全文摘要
本發明的目的是開發一種低成本地獲得高產率，而且能夠任意地控制生物降解性共聚聚酯組成的技術。本發明涉及一種培養方法，其特徵在於，當使用微生物生產共聚聚酯時，在整個培養期間把作為碳源使用的油脂的比基質供給速率控制為定值的培養方法，或者將培養時期分成菌體增殖期和聚酯儲備期，並在各個階段把比基質供給速率控制為定值的培養方法。另外，本發明涉及一種通過選擇油脂種類和/或油脂比基質供給速率的控制值對生產的共聚聚酯組成進行控制的培養方法。
文檔編號C12P7/62GK1703502SQ200380101089
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月10日 優先權日2002年10月10日
發明者中嶋敏光, 小田原修, 橫溝聰 申請人:株式會社鍾化