一種人類環氧合酶-2的製作方法

2023-06-21 10:56:26 1

一種人類環氧合酶-2的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於增加人環氧合酶-2的表達在轉化細胞中，並檢測優先和獨立的DNA組成的人類環氧合酶-2的cDNA連接到3'側翼序列的人類環氧合酶-1方法測量cyclogenase-2在樣品。
【專利說明】一種人類環氧合酶-2
[0001]

【技術領域】
本發明涉及醫藥領域，尤其是一種人類環氧合酶-2。
_2] 發明背景
本發明包括一種人類環氧合酶-2蛋白包括人類高表達環氧合酶-2 (C0X-2)的cDNA和哺乳動物表達載體系統的高水平表達。
[0003]發揮非留體類抗炎藥的抗炎，止痛和退熱活性，並抑制激素誘導的子宮收縮和某些類型癌的生長，通過抑制前列腺素G / H合成酶，也被稱為環氧合酶。直到最近，只有一種形式的環氧合酶其特徵在於，這對應於環氧合酶-l(COX-l)，最初在牛的儲精囊中確定的構成enyme。最近一種可誘導形式的環氧合酶(環氧合酶_2; C0X-2))的基因已被克隆，測序，其特徵在於從雞，小鼠和人源。cyclooxygnase-2是不同於這也被克隆,測序,其特徵在於從綿羊，小鼠和人源的環氧合酶-1。環氧合酶-2的是快速和容易的代理，包括有絲分裂原，內毒素，激素，細胞因子和生長因子誘導的一些。由於前列腺素的生理和病理作用，我們得出的結論是本構酶，環氧合酶-1，負責大部分基底的內源性前列腺素釋放，因此其生理功能是非常重要的，其中包括維護胃腸道的完整性和腎的血流量。與此相反，可誘導形式的酶，環氧合酶-2主要負責迅速誘導的酶會發生響應劑作為抗炎劑，激素，生長因子和細胞因子等的病理作用的前列腺素。因此，環氧合酶-2的選擇性抑制劑將有類似的傳統的非留體類抗炎藥(NSAID)的抗炎，解熱和鎮痛性質，會抑制激素誘導的子宮收縮，將具有潛在的抗癌作用，但也將有能力都會下降，誘發一些機制為基礎的副作用。特別是，這種選擇性抑制劑應該有一個潛在的胃腸道毒性，腎的副作用降低的潛力，減少出血時間的影響，可能是阿司匹林敏感的哮喘患者的能力下降，誘發哮喘發作減少。
[0004]因此，本發明的一個目的是提供檢測和材料，以識別和評估的藥物是有效的抑制齊U，環氧合酶-2和環氧合酶-2的活性。
[0005]這也是本發明的一個目的是提供檢測和材料，來識別和評估優先或選擇性地抑制環氧合酶-2超過環氧合酶-1和環加氧酶-1活性和C0X-2活性的藥物製劑。


【發明內容】

[0006]本發明包括一種人類環氧合酶-2蛋白包括人類高表達環氧合酶-2 (C0X-2)的cDNA和哺乳動物表達載體系統的高水平表達。
[0007]本發明還包括檢測，以確定和評估的藥物是有效的抑制劑，環氧合酶-2和環氧合酶-2的活性。本發明還包括檢測，以確定和評估的藥物製劑，優選地或選擇性地抑制環氧合酶-2和環氧合酶-2超過環氧合酶-1和環氧化酶-1活性的活性。
[0008]本發明還包括重組DNA分子，其中的核苷酸序列編碼人環氧合酶-2蛋白編碼基因的3』側翼序列連接到人的環氧合酶-l，C0X-2/C0X-l核苷酸序列的融合和系統的表達載體的人類環氧合酶-2蛋白的表達增強。

【具體實施方式】
[0009]在一個實施例中，本發明包括一個用於確定檢測環氧合酶-2的活性的樣品，包括以下步驟:(a)將(I)的人骨肉瘤細胞的製備，(2)的樣品中，樣品包括一個假定的環氧合酶-2的抑制劑，和(3)花生四烯酸，以及(b)確定在步驟(a)中產生的前列腺素的量E.sub.2。
[0010]為了本說明書的目的，人骨肉瘤細胞旨在包括，但不限於市售的人骨肉瘤細胞系，如那些可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)，美國馬裡蘭州羅克維爾，如骨肉瘤143B(ATTCCRL 8303 )和骨肉瘤143B PML BK TK (ATCC CRL 8304，我們發現骨肉瘤143.98.2，它最初是由威廉.薩格登博士，癌症研究麥克安德爾實驗室，威斯康星大學麥迪遜分校，獲得有用。現在我們已經在布達佩斯條約「與ATCC骨肉瘤143.98.2存款項下的鑑別骨肉瘤143.98.2(ATCC CRL 11226)於 1992 年 12 月 22 日。
[0011]為了本說明書的目的，應被定義為骨肉瘤細胞的製備人骨肉瘤細胞的單層或懸浮液的水溶液，其中的一部分會催化的合成的前列腺素E.sub.2 (PGE.sub.2)。此外，該製劑含有緩衝液如Hank氏平衡鹽溶液。
[0012]於本實施例中是屬人骨肉瘤細胞是從骨肉瘤的細胞類型，包括骨肉瘤143B和143B PML BK TK 143的家庭。我們已經使用了骨肉瘤143.98.2。
[0013]為了本說明書的目的還包括骨肉瘤細胞的製備人骨肉瘤微粒，其中的一部分會催化合成PGE.sub.2。的微粒可以通過以下方式獲得，從這裡所公開的任何骨肉瘤細胞系，如下所述。
[0014]第二實施例，本發明包括一種組合物，該組合物包括(a)的骨肉瘤細胞的製備，具有約103，約109骨肉瘤細胞，每毫升的細胞製備物，及(b) 0.1 50之間的。mu.1無過氧化物的花生四烯酸的每毫升的細胞準備。
[0015]通常情況下，細胞的製備將作為單層生長，使用的8.2.times.10.sup.42.times.10.sup.6每孔細胞的等分試樣(約I毫升工作容積)中所描述的下面的協議。花生四烯酸是通常使用的量為I至20微升每孔約I毫升的工作容積。
[0016]骨肉瘤微粒時使用的，而不是全部的細胞，細胞製劑一般含有50至500微克每毫升的細胞製備的微粒體蛋白。花生四烯酸是通常使用的量為I至20。每毫升的細胞製備mu.1 酸。
[0017]第三實施例，本發明包括一個用於確定檢測的環氧合酶-1活性的樣品，包括以下步驟:(a)將(I)的細胞製備，表達環氧合酶-1的細胞，但不表達環氧合酶_2，(2)樣品，樣品包括一個假定環加氧酶-1抑制劑，(3)花生四烯酸，以及(b)確定在步驟(a)中產生的量PGE.sub.2。
【權利要求】
1.生產人類環氧合酶-2，包括:Ca)轉染哺乳動物細胞的表達載體的編碼人環氧合酶-2; (b)培養轉染的細胞，及(c)從轉染的細胞中回收人環氧合酶-2; 編碼人環氧合酶-2的表達載體包括一個第一位置97至1909的序列的核苷酸序列，它包括其中；ID; NO:19或簡併變體和第二個核苷酸序列，包含SEQ ; ID; NO:13，它的3』的第二個核苷酸序列的5』末端的第一個核苷酸序列所附帶。
2.根據權利要求1所述的方法，其中哺乳動物細胞是選自下列組成的組:CV-1細胞，COS-1 細胞，COS-7 細胞，3T3 細胞，NIH/3T3 細胞，HeLa 細胞，C127I 細胞，BS-C-1 細胞，MRC-5細胞。
3.根據權利要求1的方法，其中選自下列組成的組:牛痘病毒表達載體的哺乳動物的質粒表達載體，該表達載體。
【文檔編號】C12N9/02GK104513815SQ201310448689
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月28日 優先權日:2013年9月28日
【發明者】陳晴川 申請人:上海滿益科技有限公司