人lpl基因突變體抗動脈粥樣硬化的製作方法

2023-06-23 04:59:26 1

專利名稱：人lpl基因突變體抗動脈粥樣硬化的製作方法
技術領域：
本發明為不易感動脈粥樣硬化動物樹鼩LPL cDNA及具有較高生物活性的人LPL突變體的獲得，涉及生物醫學高技術中新基因、新蛋白質的開發與應用領域。
背景技術：
動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，也是缺血性心腦疾病的重要病理基礎。無論是在人體內發生的還是用高脂高膽固醇飲食誘導實驗動物產生的AS，均與血漿脂質和脂蛋白的異常有密切關係，因此，脂質代謝紊亂是AS形成的一個重要危險因素。
脂蛋白脂防酶(lipoprotein lipase，LPL)是水解乳糜微粒(Chylomicron，CM)和極低密度脂蛋白(verylow density lipoprotein，VLDL)中甘油三酯(triglyceride，TG)的關鍵酶，其主要作用是分解CM和VLDL中的TG，並在脂蛋白之間轉移膽固醇，磷脂和載脂蛋白，代謝產物游離脂肪酸為組織提供能量，或再酯化為TG，儲存在脂肪組織中，代謝後的VLDL轉化為中間密度脂蛋白(immediate density lipoprotein，IDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，分解後的CM表面脂質脫落，形成新生的HDL，因此LPL在清除體內富含TG的脂蛋白和形成HDL的過程中起關鍵作用。
1987年Wilson等成功克隆並測定了人LPL的cDNA序列，並推導出其蛋白的一級結構。人的LPL基因大約35Kb，定位於8P22，其cDNA全長約3.5Kb。研究表明LPL基因含有10個外顯子，9個內含子；外顯子1編碼5』非翻譯區，外顯子10編碼3』非翻譯區，外顯子10遠比其它外顯子大。人LPL核苷酸編碼475個胺基酸殘基，其中包含27個胺基酸的信號肽序列及448個胺基酸殘基的成熟多肽。已知哺乳類動物的LPL胺基酸序列的同源性很高，超過90％，鳥類與哺乳類相比，同源性大約在70％左右。
樹鼩(Tree shrew，TS)是分布在我國雲南等地的一種低級靈長目的食蟲動物。八十年代初，我們發現樹鼩血漿中具有高水平的HDL，平均佔血漿總脂蛋白的70％-75％，血漿中總膽固醇的水平接近於人(158mg/dl)。當餵飼樹鼩高脂高膽固醇飲食18--32周後，它們體內血漿總膽固醇濃度雖然升高，但HDL-C比例增高，而LDL-C在總膽固醇中的比例下降，病理檢查其主動脈等部位無明顯AS病變形成。因此，樹鼩被認為具有特殊脂質代謝機制的不易感動脈粥樣硬化動物，但樹鼩不易感動脈粥樣硬化的機制目前尚不十分了解，為深入探討該動物不易感動脈粥樣硬化的原因，我們課題組目前已經成功克隆了樹鼩下列幾種與脂蛋白代謝相關的基因，如APOAI、APOCI、APOE、APOCII、PLTP、LCAT、APOAV和CETP等，初步分析了它們的結構特點，並與人以及其它動物的相同基因進行了比較。但目前為止，尚未有對樹鼩LPL基因相關的報導。
發明目的克隆樹鼩LPL基因，推導出其相應的蛋白質胺基酸序列，比較人與樹鼩LPL活性；。同時根據樹鼩LPL的序列特點及與人LPL的差異，對人LPL序列的相應胺基酸處進行定點突變，比較野生型LPL與突變體活性的差異，從而為動脈粥樣硬化等疾病的基因診斷和基因治療以及新藥篩選提供可能的理論指導和依據。
內容與要求應用RNA提取與純化技術、Smart-race PCR技術、分子克隆、DNA序列測定技術、分子生物學軟體、Real-time PCR技術、蛋白質的表達與純化技術、抗血清製備、DNA定點突變技術、細胞培養技術、Westernblot技術、放射性同位素法測定LPL活性等技術方法首次獲得編碼樹鼩LPL的cDNA全長，應用Real-timePCR技術分析樹鼩LPL的組織特異性分布，純化原核表達的目標蛋白質並免疫家兔製備抗血清，應用定點突變技術獲得人LPL的四個突變體，應用放射性同位素方法分別對野生型人及樹鼩LPL，人LPL的突變體進行功能的分析比較。
該基因/蛋白達到的技術指標為1.樹鼩LPL cDNA序列全長為3295bp，其中開放閱讀框架1437bp，5』端非翻譯區129bp，3』端非翻譯區1729bp。序列中出現的第一個ATG的+4位鹼基為G，符合真核基因轉錄起始的要求，可以作為有效起始密碼子。該cDNA的終止密碼子為TGA，距3』末端poly(A)加尾信號AATAAA的下遊23bp處為由16個腺苷酸組成的poly(A)尾，表明該序列為一個完整的cDNA。
2.經過SignalP Server分析，確定樹鼩LPL前體蛋白在20和21位殘基之間有一個斷裂位點。因此，樹鼩LPL前原蛋白由一個含有20個胺基酸疏水性信號肽序列(M-A-S-K-A-L-L-L-V-A-L-G-V-W-L-Q-S-L-A-A)和一個458個胺基酸構成的成熟蛋白組成。通過DNAMAN軟體的預測，該蛋白的分子量約為53KD，等電點8.51，為一偏鹼性的蛋白質。
3.應用DNAMAN軟體對樹鼩與人的LPL親疏水性結構進行預測分析，結果顯示兩者親疏水性區域分布基本一致(見圖2)。
4.以樹鼩LPL的成熟蛋白構建原核表達載體，在大腸桿菌中獲得大量表達。經親和純化後產物免疫紐西蘭大耳白兔，製備了高滴度抗LPL抗體。
5.樹鼩LPL mRNA在不同組織之間的表達相差極大以絕對優勢高表達LPL的兩種組織分別是心肌和脂肪組織；只有少量表達LPL的組織包括腎臟、腦、肝臟和肺；幾乎不表達LPL的組織是脾、膽囊、睪丸及肌肉組織(見圖4)。
6.應用重疊延伸指導的定點突變方法，成功構建了4個人LPL突變體E92Q(GAG→CAG)、Q106K(CAG→AAG)、H330Q(CAT→CAG)、Q402E(CAG→GAG)(見圖5，6)。
7.野生型樹鼩LPL的活性大約是野生型人LPL活性的8倍，經統計分析，P＜0.05，此差異具有統計學意義(見圖8)。
8.與野生型人LPL活性相比，E92Q、H330Q的活性較高，約為野生型人LPL活性的7-8倍，經統計，P＜0.05，具有統計學意義；而另兩個突變體Q106K、Q402E的活性與野生型人LPL相比，P＞0.05，因此，Q106K、Q402E的活性與野生型人LPL相比，無明顯差別(見圖9)。


圖1.樹鼩LPL cDNA各段的擴增結果及檢測結果上，中，下圖1X174-DNAmarker；2以樹鼩cDNA一鏈為模板，外側引物的擴增結果；3內側引物對擴增產物的鑑定；4以陽性質粒為模板，外側引物的擴增結果；5陽性質粒的內側巢式PCR圖2.樹鼩LPL與人LPL胺基酸的疏水比較圖藍色樹鼩LPL的疏水圖；黑色人LPL的疏水圖。
結果顯示樹鼩與人LPL胺基酸疏水圖基本重疊，說明二者的胺基酸組成大體一致。
圖3.樹鼩各組織LPL的Real-Time PCR示意4.樹鼩LPL mRNA的組織特異性分布結果顯示樹鼩LPL mRNA在不同組織之間的表達相差極大以絕對優勢高表達LPL的兩種組織分別是心肌和脂肪組織；只有少量表達LPL的組織包括腎臟、腦、肝臟和肺；幾乎不表達LPL的組織是脾、膽囊、睪丸及肌肉組織圖5.E92Q，Q106K的定點突變測序結果上圖E92Q(GAG→CAG)；下圖Q106K(CAG→AAG)圖6.H330Q，Q402E的定點突變測序結果上圖H330Q(CAT→CAG)；下圖Q402E(CAG→GAG)
圖7.轉染不同載體的COS7細胞培養基的Western blotting1未轉染的COS7細胞；2轉染pcDNA3.1的COS7細胞；3轉染TS.LPL的COS7細胞；4轉染H.LPL的COS7細胞；5轉染E92Q的COS7細胞；6轉染Q106K的COS7細胞；7轉染的H330Q的COS7細胞；8轉染的Q402E的COS7細胞。
從圖中可見，未轉染的COS7細胞、轉染pcDNA3.1的COS7細胞及轉染野生型樹鼩LPL表達載體的COS7細胞均不與抗體出現反應；野生型人LPL與人LPL的四種突變體轉染的細胞培養基與鼠抗人LPL抗體出現了交叉反應，且突變體的分子量與野生型LPL的大小一致，說明人LPL的四個突變體與野生型LPL一樣，都是以二聚體的形式分泌的。但是，從圖中我們可以觀察到，各組LPL與抗體反應的程度存在差異，這種差異間接反應了野生型LPL與人LPL突變體之間分泌LPL存在量的差別。
圖8.野生型人、樹鼩LPL活性的比較從圖可見，野生型樹鼩LPL的活性大約是野生型人LPL活性的8倍，經統計分析，P＜0.05，此差異具有統計學意義。
圖9.野生型人LPL與各突變體總LPL活性的比較圖中顯示，與野生型人LPL活性相比，E92Q、H330Q的活性較高，約為野生型人LPL活性的7-8倍，經統計，P＜0.05，具有統計學意義；而另兩個突變體Q106K、Q402E的活性與野生型人LPL相比，P＞0.05，因此，Q106K、Q402E的活性與野生型人LPL相比，無明顯差別。
具體實施例方式1.樹鼩肝組織總RNA的提取及檢測取健康五月齡的雄性樹鼩，無菌手術快速取出數克動物肝組織，立即凍於液氮中。稱取約1克的樹鼩肝臟組織，置於幹烤後預冷的研器內，在液氮中研細後放入預先加入了10mL的TRIZOL試劑的50mL離心管中，經Polytron勻漿器勻漿30s處理後，於12000轉/min(4℃)，離心10min。小心將上清轉移到另一個50 mL的離心管中，室溫(15-30℃)放置5min，按0.2mL氯仿/1mL TRIZOL試劑的比例加入氯仿2.0mL，劇烈振蕩15s，在室溫下放置3min，以10000轉/min(4℃)離心15min。小心吸取上層含總RNA的水相，以每管600μL分裝於1.5mL的離心管中。每管加入等體積的異丙醇，室溫(15-30℃)沉澱10min，然後以10000轉/min(4℃)離心10min。吸棄上清，用DEPC水配製的75％乙醇溶液洗鹽，於6000轉/min再次離心5min(4℃)。棄上清，沉澱在室溫下乾燥10min，溶於DEPC水中，再於58℃放置10min。
進行RNA甲醛變性凝膠電泳以觀察RNA的完整性。RNA甲醛變性凝膠電泳將適量的瓊脂糖加熱溶於DEPC水後，冷卻至60℃，加入5×MOPS凝膠電泳緩衝液和甲醛，至終濃度分別為1×和2.2mol/L，灌制凝膠，於室溫放置30min以上，以使凝膠凝固。在滅菌的Eppendorf管中，混合4.5μL RNA(10-20ug)，2.0μ15×MOPS電泳緩衝液，3.5μL甲醛及10μL甲醯胺，混勻後於65℃溫育15min，加入2μL甲醛凝膠加樣緩衝液，凝膠預電泳(5V/cm)15min，然後加樣，按3-4V/cm電壓電泳。
2.cDNA-鏈的合成普通的cDNA-鏈的合成按SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑說明書進行，20μl反應體積含5μg無DNA的總RNA，1×PCR緩衝液，2.5mmol/LMgCl2，10mmol/LDTT，500μmol/L dNTPs，10μmol/L oligodT12-18，Superscript II逆轉錄酶200單位。42℃保溫60min，70℃保溫15min後於-20℃保存。
3.特異引物和檢測引物的設計根據其它已知種屬相同基因的cDNA序列設計合適的引物以人LPL cDNA序列為主要參照，在已知種屬動物大鼠、小鼠、雞LPLcDNA序列的高度同源區內確定合適的位置，先分別設計出兩對擴增樹鼩LPL基因cDNA編碼區的特異引物以及兩對檢測引物，再根據擴增片段的測序結果，結合參考其它種屬LPL基因cDNA編碼區序列，5′-UTR序列和3′-UTR序列，分別設計出相應引物。
4.目標片段的回收及檢測採用博大公司出產的DNA快速回收試劑盒進行PCR產物的回收。將目的擴增片段從普通瓊脂糖凝膠中切下，置於1.5mL離心管中(膠的體積約100μL)。用Tip輕輕搗碎凝膠，加入3倍體積(約300μL)的溶膠液，50℃水浴3min，使膠完全融化。玻璃奶充分混勻，向已融化的凝膠液中加入10μL，顛倒混勻，在冰浴中放置10min，其間每隔3min混勻一次。室溫下12000轉/min，離心30s。吸棄上清，沉澱中加入250μL漂洗液(濃縮漂洗液和無水乙醇按3∶7的比例配製成的工作液)，輕輕吹打使沉澱分散混勻，室溫下12000轉/min，離心30s。吸棄上清，重複一次漂洗過程。室溫下12000轉/min再離心10s，棄淨上清。沉澱於37℃恆溫箱中乾燥30min，加入15μLddH2O，混勻，於60℃水浴5min，12000轉/min於4℃離心1min。小心回收上清，重複上述過程(此次向沉澱中加入10μL ddH2O)，兩次回收的上清合併，備用。應用巢式PCR對回收片段進行PCR檢測。以回收片段為模板，分別用相對應的內測引物，進行PCR擴增。取5μLPCR產物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳鑑定，如出現與預測片段長度相符的擴增帶，則說明回收片段混合物中含有目的基因片段，可進行連接。
5.回收片段與載體的連接與轉化應用Promega公司的DNA連接試劑盒(pGEM-T easy vector system I)進行連接。用預先冷卻的無菌吸頭吸取感受態細胞懸液100μL轉移到無菌1.5mL離心管中，向管中加入DNA連接產物，輕輕旋轉混勻內容物，在冰中放置30min。將1.5mL離心管放到預先加溫至42℃的循環水浴中，精確計時90s。迅速將離心管轉移到冰浴中，冷卻2min，勿振蕩。加入預先加溫至37℃的LB液400μL。37℃搖床上，200轉/分，旋轉45min使細胞復甦。預先鋪好含Amp的LB平板，並加上40μL的X-gal(20mg/mL)和4μL的IPTG(200mg/mL)，用無菌玻璃塗布器將X-gal和IPTG塗布於整個平板表面，於37℃培養1小時直至所有液體消失。取轉化後的菌液100μL，均勻塗布於瓊脂培養基表面，室溫放置30min後倒置於37℃恆溫箱中培養12-16小時。取出平板在4℃放置至少4-6小時，讓藍色充分顯現，鑑定藍白斑，選取白斑陽性克隆準備提取質粒。
6.重組質粒的提取及鑑定無菌條件下，挑取分隔良好的白斑單菌落於預先加好3mL含Amp的LB培養液的15ml搖菌管中，37℃劇烈振搖培養過夜。將3ml培養物分兩次倒入1.5ml離心管中，4℃ 12000g離心30s，棄去培養液，倒置離心管使培養液儘量流盡，菌液儘可能乾燥。將細菌沉澱重懸於冰預冷的100μL溶液I(葡萄糖50mmol/L；Tris-Cl，pH 8.0，25mmol/L；EDTA，pH 8.0，10mmol/L)中，劇烈震蕩。加200 μ L溶液II(NaOH0.2mol/L，SDS 1％，新鮮配製)，蓋緊管口，快速顛倒離心管數次混合內容物，置於冰上。加入冰預冷的150μL溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，顛倒數次使白色物質均勻但動作不要劇烈，將離心管置於冰中5min。4℃，12000g離心2min，將上清轉移到另一個離心管中。加入等體積的酚氯仿(1∶1)混合液抽提一次，收集水相，加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置5min，4℃12000g離心5min，棄上清，室溫下放置，使沉澱乾燥。加1ml 70％乙醇洗滌沉澱，4℃12000g離心2min，棄去上清液，在空氣中乾燥沉澱10min。用30μl去離子水重新溶解質粒DNA，加入無DNA酶的胰RNA酶(RNaseA)至終濃度20μg/ml，37℃放置60min以消化RNA。質粒DNA稀釋10倍，取0.5μL為模板，分別用cDNA編碼區的特異引物及檢測引物進行PCR擴增，以初步鑑定插入片段是否為目的片段。
7.DNA測序及結果分析採用雙脫氧末端終止法和自動螢光測序儀測序。每個片段挑選三個陽性克隆，正反雙向測序。將序列測定結果通過Blast方式向GenBank資料庫查詢，進行同源性比較，以確定該序列是否與人及其它種屬動物的LPL基因有高度同源性，如具有高度同源性，則可證實獲得的該cDNA片段是目的基因編碼區的一部分。如與人及其它種屬動物的相同基因沒有同源性，則表明擴增產物比較複雜，需重新設計引物或嚴格控制擴增條件。
8.Real-Time PCR分析樹鼩LPL mRNA的組織特異性分布應用TRIZOL試劑提取樹鼩各種組織總RNA。進行RNA甲醛變性凝膠電泳以觀察RNA的完整性。將各個組織的總RNA同時進行反轉，反轉體系中各種組織RNA均定量為5μg；以β-actin作為內對照，應用以SyBr-Green為螢光物質的Real-Time PCR技術分析樹鼩LPL mRNA在不同組織的相對表達量。靶基因的相對表達量2β-actin(CT)-sample(CT)9.LPL原核表達載體的構建及誘導表達以樹鼩cDNA一鏈為模板，在引物設計時，上遊引物SP3引入SmaI酶消化位點，下遊引物SP2引入XhoI酶消化位點，使用高保真的DNA聚合酶擴增LPL的成熟蛋白。擴增產物和原核表達載體pET43.1a經過雙酶切消化，電泳、純化回收後16℃連接過夜。PCR產物的檢測，片段的回收和鑑定，連接，轉化，克隆鑑定，陽性克隆質粒的提取、鑑定和純化，DNA測序和測序結果比較分析等方法同前述。pET43.1a-ABCAl重組質粒轉化到含有T7 RNA聚合酶的E.Coli BL21(DE3)感受態細胞中，陽性克隆在LB液體培養基中生長到A600nm為0.6之後，加異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM，誘導3小時後，12000g離心收集菌體，PBS洗滌後，離心沉澱加入2xSample buffer，DTT和水，混勻煮沸裂解10min，取10ul進行6％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色檢測蛋白。
10.目的蛋白的純化目的蛋白的純化根據Novagen公司His Bind Kit試劑盒說明書進行，以100ml細菌培養物中上清的純化為例說明，具體操作過程如下所述，a)10000g 10min，收集細胞。棄上清，並儘可能的吸淨上清。用40ml的1×Bindingbuffer重懸沉澱。
b)超聲，每5ml一次，每次15sec pulse+15 sec off直到15min pulse+15min off。
c)5000g 15min收集上清。
His·Bind純化準備過程(1ml)a)準備5ml 1×Charge Buffer，13ml 1×Binding Buffer，6ml 1×Wash Buffer，6ml 1×Strip Buffer。用幾毫升的消毒去離子水來溼潤乾燥的樹脂柱。用一戴手套的手指封住柱口。
b)輕輕顛倒混勻His·Bind Resin的小瓶直到完全重懸。吸取2ml slurry於柱中。靜置，使其重力下沉降後約為1ml。
c)當storage buffer降到column bed的上方時，依次加入a)3ml消毒去離子水b)5ml 1×Charge Bufferc)3ml 1×Binding BufferColumn層析過程(1ml)a)當1×Binding Buffe降到column bed的上方時，加入準備好的樣品約5ml。控制流速為10ml/h(3-4drop/min)。
b)用10ml 1×Binding Buffer洗column。
c)用6ml 1×Wash Buffer洗column，先用20mM的低濃度咪唑的1×Wash Buffer開始洗起。
d)用6ml 1×Strip Buffer將蛋白與Ni2+一起洗脫下來。分管接取洗脫物，約每管1ml。
11.LPL抗血清的製備可溶性抗原與完全福氏佐劑(Freund』Adjuvant，GIBCO)等體積混勻，背部10-20個點注射於紐西蘭大耳白兔，2mg/只，共免疫3隻動物。第一次免疫，抗原與完全佐劑混合，間隔4周以後進行加強免疫。加強免疫時抗原與不完全佐劑(不含卡介苗)混合，加強免疫的間隔時間為10天。兩次加強免疫後，採耳血1ml檢測效價。
12.人LPL突變體真核表達載體的構建應用重疊延伸法產生特異位點進行誘變以野生型人LPL真核表達載體為模板，以突變點為中心，把人LPL分成兩部分分別擴增，然後將獲得的兩部分搭接擴增，得到突變體全長。成功獲得四個突變體E92Q，Q106K，H330Q，Q402E。具體方法如下引物92-1 5 GCTGTCACGGGCTCAGCAGCATTACCCAGTGTC 392-2 5 GACACTGGGTAATGCTGCTGAGCCCGTGACAGC 3106-15 CCAAACTGGTGGGAAAGGATGTGGCCCGG 3106-25 CCGGGCCACATCCTTTCCCACCAGTTTGG 3330-15 GACTGAGAGTGAAACCCAGACCAATCAGGCCTTTGAG 3330-25 CTCAAAGGCCTGATTGGTCTGGGTTTCACTCTCAGTC 3402-15 CAGTCCCGGCTTCGCCATTGAGAAGATCAGAGTAAAAGC 3402-25 GCTTTTACTCTGATCTTCTCAATGGCGAAGCCGGGACTG 3HLP1 5 CGGAATTCATGGAGAGCAAAGCCCTGC 3HLP2 5 CCGCTCGAGTCAGCCTGACTTCTTATTCAGAGAC 3擴增短片段的體系ddH2O 15.3(μL) ddH2O 15.3(μL)10*buffer 2 10*buffer 2dNTP Mix(2.5mM)1 dNTP Mix(2.5mM)1HLP1(10μM)0.5 330-1/402-1(10μM) 0.592-2/106-2(10μM) 0.5 HLP2(10μM)0.5模板 0.5 模板 0.5Pyrobest 0.2 Pyrobest 0.2
+)20μL +)20μL反應條件
擴增長片段的體系ddH2O15.3(μL) ddH2O 15.3(μL)10*buffer2 10*buffer 2dNTP Mix(2.5mM) 1 dNTP Mix(2.5mM)192-1/106-1(10μM)0.5HLP1(10μM)0.5HLP2(10μM) 0.5330-2/402-2(10μM) 0.5模板 0.5模板 0.5Pyrobest 0.2 Pyrobest 0.2
+)20μL +)20μL反應條件 同一突變點相對應的長短片段進行搭接將PCR產物分別電泳回收，將對應的長短片段回收產物混合後作為搭接的模板。
反應體系如下反應條件 混合模板1.5Pyrobest0.2
+)20μL
13.COS7細胞培養在37℃水浴鍋中化開凍存的細胞，用75％酒精消毒凍存管外壁①加1ml預熱的完全培養基到凍存管內，然後將凍存管內細胞轉到無菌的15ml離心管內；②加5ml完全培養基並輕輕混勻，重複加5ml完全培養基並再次混勻；③室溫1000轉/分，離心10分鐘後，去除培養液上清；④加10ml完全培養基輕輕混勻細胞。將細胞轉到100mm的培養皿中。當細胞到達80-90％時傳代一次。
14.COS7細胞的轉染(1)轉染前24小時，在六孔板內接種適量細胞，轉染時細胞密度以40-60％為宜。
(2)轉染前1小時，更換新鮮的完全培養液，將六孔板置37℃，5％CO2培養。
(3)配製培養液(6孔板，3ml培養液/孔)①取5ug DNA，加入稀釋液(100mm NaCl)中至總體積為100ul，輕輕混勻，室溫放置。轉染的分組如下第一組未轉染的COS7細胞；第二組轉染載體pcDNA3.1；第三組轉染野生型人LPL表達載體；第四組轉染野生型樹鼩LPL表達載體；第五組轉染突變體E92Q；第六組轉染突變體Q106K；第七組轉染突變體H330Q；第八組轉染突變體Q402E。
②取轉染試劑2ul，加入稀釋液中至總體積為100ul，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。
③將稀釋的轉染試劑逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，室溫放置15分鐘。
(4)將轉染液輕輕混勻，逐滴加入3ml培養液中，輕輕混勻培養液，置37℃，5％CO2培養。
(5)轉染後6小時，更換新鮮的無血清培養液。
15.細胞培養基的Western blotting分析(1)電泳以80V電壓電泳出濃縮膠，改為120V電壓電泳分離膠，溴酚藍距離膠底部1cm處，斷開電壓。
(2)取下膠板，根據預染marker的提示，去除多餘的膠，並在膠的一角作標記。
(3)將膠浸在蛋白轉移buffer(不含甲醇)中至少10-20分鐘。也可用含甲醇的蛋白轉移buffer淋洗膠。
(4)準備PVDF膜①用100％甲醇溼潤膜(10 seconds)②蒸餾水衝洗膜1*5min③蛋白轉移buffer中平衡至少10min。
(5)蛋白質轉膜在半乾式電轉移槽中從陽極導引即按如下順序依次按方電轉緩衝液浸溼的濾紙，PVDF膜，凝膠，電轉緩衝液浸溼的濾紙。
100V 1h(80-320cm2膠)，注意使用冷轉移buffer，保持轉移過程低溫。
(6)轉移結束後，將膜取出，在膠作記號的相應部位在膜上也作同樣的標記，用PBS輕洗膜，並將膜進一步作裁剪。
(7)封閉封閉液0.1％(v/v)Tween 20，5％(w/v)脫脂奶粉，0.25-3％BSA(溶於PBS)。
室溫1h。
(8)用PBS-T輕輕淋洗膜兩次。之後，用過量的PBS-T洗膜，1*5min。
(9)一抗孵育用封閉液稀釋一抗(鼠抗人LPL單抗5D2)至最佳滴度(1∶1000)，室溫孵育1h或4℃過夜。
(10)將膜用PBS-T淋洗後，PBS-T充分洗滌2*10min。
(11)二抗孵育用封閉液稀釋二抗(辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠多抗)至適當滴度(1∶2000)，室溫孵育1h。
(12)將膜用PBS-T淋洗後，PBS-T充分洗滌3*10min。
(13)ECL顯色①洗膜1×TBS-T(0.05％Tween-20)，3×5min；1×TBS，5min。
②1∶1混合reagent A和B，用量0.125ml/cm2。
③傾去膜上的TBS，將混合液加到膜上，注意蛋白面朝上。室溫孵育1分鐘。
④傾去多餘的發光試劑，可以用鑷子將膜夾起，用吸水紙從膜邊緣將多餘水分吸掉。
⑤用保鮮膜將膜緊緊包起來，蛋白面朝上，注意避免氣泡或皺褶的產生。
⑥將封好的膜蛋白面朝上用透明膠粘在暗盒中。
⑦在暗室中，安放膠片。將膜曝光1min。
⑧自顯影16.LPL活性的測定(1)配製底物應用液(一次最多可離心18管，包括2管TG DOSE，2管空白)，以10管為例①準備大鼠血清0.1ml，62.5℃，孵育10min。置於冰上。
②稱量無水乳劑0.2g(0.16ml)，置於冰上。(備註10ml＝12.5g)③取出存於-20℃的BSA-肝素1ml用0.3M Tris-Hcl緩衝液(PH8.5)1∶5稀釋。
④在0.16ml乳劑中，加0.74ml(10*0.074)的BSA-肝素稀釋液，混勻。
⑤再加0.1ml大鼠血清於第四步的管中，混勻。
(2)玻璃試管的準備TG dose 2管，Blank 2管，每個樣品2管每管加入底物應用液(第一步的混合液)100ul(注意槍頭應單獨棄於放射性物質的地方)。
(3)樣品管中加入100ul細胞培養液，空白管和TG dose管中加入100ul PBS。
(4)Vortex充分混勻，置於37℃水浴箱內1小時(100轉/分)(5)加3.25ml抽提液在每管中後，再加入碳酸-硼酸緩衝液(中止液)1.05ml。Vortex混勻3次，15妙/次(6)室溫下離心3000rpm，15min(細胞室)(7)吸取上清1ml，分別加入至記數瓶中。TG dose管中還應加入100ul底物應用液。
(8)每瓶中各加10ml閃爍液(9)測值，將試管中的液體入塑料瓶(閃爍杯)中，蓋上蓋子。
樹鼩LPL cDNA全長及編碼的胺基酸序列CCCTTTAAAGGGCGACCTGCCCTGCGCCTGCCGCCGCCCCAGCCGTCTCCCTCCTCGGCT 60CAGCCCCGCGGTCAGTCGGTCCGCGCGCACGTCGGCGCCGCGCAGCTCTCACAGAAGAAC 120GCAGCCGAGATGGCGAGCAAAGCTCTGCTCCTGGTGGCCCTGGGCGTGTGGCTCCAGAGT 1801 M A S K A L L L V A L G V W L Q SCTGGCCGCCTTCCGCGGAGGGGTGGCCACCGCCGACCGAGTTGCAGGAGGAAGAGATTTC 24018 L A A F R G G V A T A D R V A G G R D FATGGACATCGAAAGTAAATTTGCCCTCAGGACCCCTGAAGACACAGCCGAAGACACATGC 30038 M D I E S K F A L R T P E D T A E D T CCATCTTATTCCTGGGGTTGCAGAGTCTGTAGCTAACTGCCACTTCAACCACAGCAGCAAA 36058 H L I P G V A E S V A N C H F N H S S KACCTTCGTGGTGATCCATGGCTGGACGGTGACCGGGATGTACGAGAGTTGGGTGCCGAAG 42078 T F V V I H G W T V T G M Y E S W V P KCTGGTGGCCGCCCTGTACAAGCGGGAGCCTGACTCTAACGTGGTGGTGGTGGACTGGCTG 48098 L V A A L Y K R E P D S N V V V V D W LTCGCGGGCCCAGCAGCATTACCCAGTGTCTGCCGGCTACACCAAGCTCGTGGGGAAGGAC 540118S R A Q Q H Y P V S A G Y T K L V G K DGTGGCCAGGTTCATCAACTGGATGGAGGAGGAATTTAACTACCCACTGGATAATGTCCAT 600138V A R F I N W M E E E F N Y P L D N V HCTCTTAGGATACAGTCTTGGAGCCCACGCTGCTGGTGTGGCAGGAAGTCTGACCAATAAG 660158L L G Y S L G A H A A G V A G S L T N KAAGGTGAACAGGATCACCGGCCTCGATCCTGCCGGACCTAACTTTGAGTATGCAGAAGCC 720178K V N R I T G L D P A G P N F E Y A E ACCAAGTCGCCTTTCTCCCGATGATGCGGATTTTGTGGATGTCCTGCACACGTTCACCAGA 780198P S R L S P D D A D F V D V L H T F T RGGGTCTCCCGGCCGAAGCATCGGGATCCAGAAACCAGTGGGGCATGTTGACATTTATCCC 840218G S P G R S I G I Q K P V G H V D I Y PAATGGAGGCACTTTTCAGCCGGGGTGTAACATTGGGGAGGCCATCCGTGTGATTGCAGAG 900238N G G T F Q P G C N I G E A I R V I A EAGAGGCCTCGGAGATGTGGACCAGCTGGTGAAATGCTCCCACGAACGCTCCATCCATCTC 960258R G L G D V D Q L V K C S H E R S I H LTTCATCGACTCCCTGTTGAACGAGGAAAGTCCGAGTAAAGCCTACCGGTGCAACTCGAAG 1020278 F I D S L L N E E S P S K A Y R C N S KGAGGCCTTCGAGAAAGGGCTCTGTCTGAGCTGCAGGAAGAACCGCTGCAACAACTTGGGC 1080298 E A F E K G L C L S C R K N R C N N L GTATGAGATTAATAAGGTCCGAGCCAAACGCAGCAGCAAGATGTACCTGAAGACCCGCGCT 1140318 Y E I N K V R A K R S S K M Y L K T R ACAGATGCCCTACAAAGTCTTCCACTACCAAGTCAAGATTCACTTTTCTGGGACTGAGAGT 1200338 Q M P Y K V F H Y Q V K I H F S G T E SGATAAGCAGACCAACCAGGCCTTCGAGATCTCTCTGTATGGCACCGTGGCTGAGAGCGAG 1260358 D K Q T N Q A F E I S L Y G T V A E S EAACATCCCCTTCACCCTGCCTGAGGTTGCCACGAATAAGACCTACTCGTTCCTGATCTAC 1320378 N I P F T L P E V A T N K T Y S F L I YACGGAGGTGGACATCGGGGAACTTCTGATGCTGAAGCTCGCGTGGAAGAGTGACTCCTAC 1380398 T E V D I G E L L M L K L A W K S D S Y
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1.本發明涉及參與不易感動脈粥樣硬化動物樹鼩脂代謝的關鍵酶——LPL。包括互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質的胺基酸序列。其特徵在於樹鼩LPL的cDNA全長為3295bp，相應編碼蛋白質有478個胺基酸。
2.根據權利要求1所述之樹鼩LPL基因/蛋白，其特徵在於該蛋白氨基端的20個胺基酸組成疏水性信號肽序列。
3.根據權利要求1、2所述之樹鼩LPL基因/蛋白，其特徵在於該基因的表達具有組織特異性。該基因在心肌和脂肪組織中呈高水平轉錄表達；在脾、膽囊、睪丸及肌肉組織中幾乎不表達。
4.根據權利要求1、2、3所述之樹鼩LPL基因/蛋白，其特徵在於樹鼩LPL的活性顯著高於人LPL，前者大約是後者的8倍。
5.根據權利要求1、2、3、4所述之樹鼩LPL基因/蛋白，其特徵在於以樹鼩LPL的序列為基準，對人的LPL進行定點突變得到4個突變體E92Q；Q106K；H330Q；Q402E。LPL活性的分析結果顯示，人LPL突變體E92Q，H330Q的活性顯著高於野生型人LPL的活性，約為野生型活性的7-8倍；而另外兩個突變體Q106K，Q402E的活性與野生型相比則無明顯變化。
全文摘要
本發明涉及具有較高活性的人LPL突變體的獲得。內容包括樹鼩LPL cDNA一鏈序列及編碼蛋白質的胺基酸序列；分子生物學軟體分析預測樹鼩LPL與人LPL蛋白的結構異同；Real－time PCR技術分析樹鼩LPL基因的組織特異性表達，並與人LPL的組織特異性表達進行比較；以樹鼩的序列為基準，構建人LPL的四個突變體E92Q；Q106K；H330Q；Q402E；應用放射性同位素方法對野生型人LPL，野生型樹鼩LPL，突變型人LPL的活性進行比較，結果表明野生型樹鼩的LPL活性遠遠高於野生型人LPL活性，大約是人LPL活性的8倍；人LPL突變體E92Q，H330Q的活性顯著高於野生型人LPL的活性，約為野生型活性的7－8倍；而另外兩個突變體Q106K，Q402E的活性與野生型人LPL活性相比則無明顯變化。本研究結果為進一步系統研究動脈粥樣硬化的發病機制及對動脈粥樣硬化的基因治療具有重要意義。
文檔編號A61P9/10GK101070546SQ20061007888
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月12日 優先權日2006年5月12日
發明者周冰, 陳保生, 曾武威 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所