含il-ii和毒素基因片段的分子導向藥物的基因克隆及表達的製作方法

2023-06-23 15:50:11

專利名稱：含il-ii和毒素基因片段的分子導向藥物的基因克隆及表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含白介素II和免疫毒素基因片段的分子導向藥物的基因克隆及表達，具體地將涉及含白介素II和綠膿毒素基因片段的分子導向藥物的基因克隆及表達，及其在克隆和表達過程中使用的載體，工程菌和表達產物。
導向治療目前已成為現代治療學中十分看好的一隻獨秀，具有很強的生命力，所述的導向治療即利用特異地結合細胞表面受體的配基作為載體將毒性基團(TOXICMOIETY)等彈頭引導至體內非正常組織，將其殺死從而達到治療作用。早在本世紀初，德國的Paul Eeh根據抗原抗體結合原理，提出了針對腫瘤細胞的″魔彈″的概念(Himmelwell，F.1960.The collected Papersof Paul Ehrich Vol，3 Pergamon)，此後，全世界眾多的科學家在此基礎上進行了大量有益的研究探討，使導向藥物的研究有了巨大的發展。作為導向藥物的彈頭經歷了重金屬、同位素、抗生素、細胞因子及酶抑制劑等過程進年來廣泛採用的是毒性極強的細菌性或植物來源的蛋白毒素，如綠膿毒素、白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素和蒴蓮根毒素等。這種以蛋白毒素作為彈頭的導向藥物又稱為免疫毒素，它成為當前導向藥物的主流。
免疫毒素的發展經歷了三個階段，第一階段的免疫毒素是由包含A、B肽鏈的完整毒素和抗體的交聯物，本領域技術人員熟知，白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素和蒴蓮根毒素等均由A、B兩條鏈組成，單獨的一條肽鏈對細胞或整個動物都沒有毒性。B鏈負責結合到大部分細胞膜的受體上，A鏈穿透細胞膜完成抑蛋白合成的致死作用，參見Moolten，F.L.and Cooperband，S.R.(1990).Science 169，68-70；Mool ten，F.L.，Capparell，N，J.，Zajdel，S.H.and Cooperband，S.R.(1975).J.Nat.Cancer Inst.55，473-477。為了產生強列而有選擇性的細胞毒作用，人們將毒素的A鏈連接到與細胞結合的實體，如抗體分子上，完全去除毒素的B鏈，利用完整毒素所遇到的非特異性結合的問題就可以解決，這樣的結合物對動物無毒性，此乃第二代免疫毒素。參見Masuho，Y.，Hara，T.andTeruhisa，N.(1979).Biochem.Biophys.Res.Commun.91，143-151；Masuho Y.and Hara，T.(1980).Gann 71，759-765；Miyazaki，H.，Beppu，M.，Terao，T.and Osawa，T(1980).Gann 71，766-774.。
近年來，隨著現代分子生物學特別是基因工程和蛋白工程的發展，已對很多作為載體的配體及作為彈頭的毒素的分子結構和基因結構有了深入的了解，使設計免疫毒素不必再採用分子量很大的整個毒素分子和整個抗體分子，而是選用配基中與受體結合的功能區(DOMAIN)的基因和毒素中跨膜和毒性基團的基因，按導向治療的目的要求，在基因水平上組合出新的重組免疫毒素基因，並可按照人為修飾改造不同的基團，使其功能按照人們的要求發生一定程度的改變，這種重組的基因片段表達後即可產生第三代的免疫毒素，即基因工程重組免疫毒素，也稱分子導向藥物。這種毒素的載體通常採用蛋白抗體的最小結合片段、細胞生長因子、激素和CD4等，而彈頭則通常採用細菌毒素，如去掉結合部位的綠膿毒素PE40及白喉毒素DT388。由於第一、第二代毒素是應用某些異型雙功能交聯劑使毒素和抗體通過二硫鍵或硫醚鍵交聯，這種化學製備方法比較複雜，得率低，欠安全，而且在體內不穩定，加速了免疫毒素的降解，毒素部分含有的糖殘基使得這類免疫毒素在體內很快被清除，毒素和抗體的結合物由於分子量大，因此滲透性差，並且容易引起機體對這類免疫毒素的免疫中和反應，而基因工程重組毒素中毒性基團與導向載體的偶聯是基因之間的融合，且對彈頭和載體的修飾可使免疫毒素分子量達到最小，這樣就增強了免疫毒素的特異性、穩定性、滲透性，降低了免疫原性，另外應用基因工程的方法，易於大規模生產，高產率，高純度以及成本低廉，如見Siegall CB et al.，FASER J，1989；32647；Chaudhary VK et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，1990；871066； Batra JKet al.，Bio Chem.1990；26515198等等。
現有技術中已知，EP0-369-316-A2中Ju，GraceW等人用人的完整的IL-2 cDNA取代綠膿毒素基因PE中的細胞結合區Domain I，表達出IL-2-PE40融合蛋白，實驗證明該融合蛋白對攜帶有IL-2R的活化T細胞有顯著殺傷作用，而對沒有IL-2R的T細胞沒有毒性作用(Lorberboum-Galsi H et al.Proc.Acad.Sci.USA，1988 851922)。因此，這類藥物在治療或預防移植排斥、自身免疫性疾病、I型糖尿病、類風溼性關節炎、T淋巴細胞白血病、愛滋病、克隆氏病等疾病中超重要作用。
值得注意的是，現有技術還是存在著不足，這種IL-2-PE40融合蛋白同時存在著由IL-2和綠膿毒素所造成的免疫源性，容易引起毒付作用。本發明人在實踐中發現，IL-2分子前的60個胺基酸的基因片段，本文以下簡稱IL-2(60)，是IL-2分子同受體結合的結合功能區(BINDING DOMAIN)，因此，IL-2(60)基因區段可以在由IL-2R陽性細胞疾病的分子導向治療中充當靶向性部分。這種對IL-2-PE40基因結構的改變或修飾所產生的益處對本領域技術人員來說是不言而寓的。
本發明的目的在於提供一種含有白介素Ⅱ結合功能區的基因片段直接與綠膿毒素基因片段融合的核苷酸序列。
本發明的另一目的在於提供一種含有上述核苷酸序列的重組表達載體。
本發明的再一目的在於提供一種合有上述重組表達載體的大腸桿菌；以及本發明的再一目的在於提供一種由合上述重組表達載體的大腸桿菌表達出的融合蛋白，該重組表達載體合有白介素II結合功能區的基因片段直接與綠膿毒素基因片段融合的核苷酸序列。
為了完成本發明之目的，本發明採用如下技術方案本發明涉一種含有白介素II基因片段和綠膿毒素基因片段的核苷酸序列，其特徵是所述的白介素Ⅱ結合受體功能區的基因片段直接與綠膿毒素基因片段融合。其中，所述的白介素II基因片段具有第一功能區的功能。所述的綠膿毒素基因片段具有第二和第三功能區的功能。本發明之綠膿毒素可穿透受體細胞，並攜帶該融合蛋白進入胞內(區段二)，和在胞內破壞細胞正常蛋白合成，從而致死細胞(區段三)。本發明擴增並克隆了綠膿毒素基因PE40區，該基因區段編碼穿透細胞膜的Domain II和抑制蛋白合成的Domain III區，而不合綠膿毒素中同細胞膜結合的Domain I區，因而可以作為分子導向藥物構建中的毒素部分廣泛應用。本發明的關鍵在於選用了儘可能短的彈體，即只用與細胞受體結合部分的功能區蛋白的基因片段，如IL-2部分蛋白基因片段，同綠膿毒素蛋白基因片段，如PE40，融合形成一核苷酸序列，這種核苷酸序列的例子可以是序列表中序列標識號1的序列。
本發明還涉及一種重組表述載體，該載體含有白介素II結合功能區的基因片段直接與綠膿毒素基因片段融合的核苷酸序列。所述的重組表達載體可是重組質粒pZMl0。
當然，本發明還涉及合有pZM-10表達載體的大腸桿菌，即E.coli JBDE3/(tets)/pZM-10。該菌已於1994年8月22日在中國武漢CCTCC保藏，其保藏號為CCTCC M 94054。
另外，本發明還涉及由所述的含有pZM-10表達載體的大腸桿菌，即E.coli JBDE3/(tets)/pZM-10表達出的蛋白，該蛋白的胺基酸序列為下文序列表中所述的序列標識號2的序列中所對應的胺基酸序列。
外源基因在大腸桿菌中的表達，可因宿主細胞啟動子，SD序列與起始密碼ATG之間的距離及表達產物等諸多因素的影響而不同。本發明將IL-2(60)-PE40插在pBV220上，插入pT7-10中則表達量較高，由於SD序列與ATG之間的距離是相同的，因此，被認為這可能是由於T7啟動子和PRPL啟動子對不同基因作用不同的緣故。PE40基因中G＋C含量接近70％，比較起來，T7啟動子可能有較強的推動RNA聚和酶超越二級結構進行轉錄的功能。美國哈佛醫學院構建的pT7-7表達系統可以把表達質粒存放在其它宿主中，在需要表達時，才將其轉入含T7 RNA聚合酶的表達宿主，如JBDE3，這樣就保證了重組表達質粒的穩定性和可靠性。本發明中構建的JBDE3/IL-2(60)-PE40-pT7-7的表達近二年來一直很穩定也說明了這一點。
外源基因在原核細胞中高水平表達，往往會形成不溶性的包涵體。包涵體的形成避免了細菌蛋白的降解，也會降低對細胞的毒性，但也引起蛋白復性的問題，在鹽酸胍裂解後，通過復性後柱層析等方法純化可得到均一的融合蛋白。
本發明的優點如下首先，本發明中的IL-2(60)通過Asp-Glu-Leu-Met與PE40(253aa-613aa)連接。
另外，本發明所採用的PE40與EP0-369-316-A2中的PE40也有所不同，其一為PE272胺基酸由Phe(TTC)變為Ser(TCC)；其二為PE338aa由Leu(CTG)變成Leu(CTT)；其三為PE459aa由Ser(AGC)變成Asn(AAC)。
其次，本發明中大膽地採用了IL-2分子中的前60個胺基酸[即IL-2(60)]作為導向載體，它只含有IL-2 N-端前60個胺基酸，從理論上講保留了IL-2分子與其受體的結合部位，而又不合IL-2生物活性所必需的肽段部分，同國外報導的完整IL-2同PE40融合物相比，由於分子量減少了38KD。本發明將IL-2-PE40改建成IL-2(60)-PE40是重大的設計改變。這一改變切去了IL-2第二和三功能區段，保留了IL-2的第一功能區段。這種改變不僅改變了IL-2的三維立體結構，也改變了IL-2PE40的三維立體結構。這一改變保持了IL-2-PE40的功能，即生物活性。
再次，把IL-2改變為IL-2(60)的優點之一是，切去了在IL-2第二和三兩個區段中的兩個半胱氨酸(Cys)。這樣，避免了在蛋白質純化的過程中，經變性與復性處理經常造成三個Cyc之間二硫鍵錯配導致IL-2失活的危險。在IL-2(60)中只有一個Cyc，其硫鍵顯然是游離的。因為，由於勢能關係，它不會與PE40中距離較遠的4個Cyc發生錯配。
本發明的IL-2(60)-PE40經變性與復位後，生物學活性很強，說明沒有二硫鍵配錯失活的情況發生。
再者，動物與臨床試驗表明，IL2有較大的毒副作用，主要原因在於IL-2的第二和第三區段。本發明切除了IL-2的上述區段，消除了IL-2引起毒副作用的根源。
最後，IL-2-PE40臨床上易引起免疫過敏反應，主要原因是PE40。本發明將其改變成IL-2(60)-PE40，縮短了肽鏈(分子量變小)，在免疫原性方面比IL-2-PE40要弱。
因此有希望成為一種有應用前途的臨床新藥，在抗器官移植排斥、自身免疫病、成人T淋巴細胞白血病及AIDS等方面發揮作用。
附圖簡要說明

圖1是實施例7中所述的重組質粒pZM-1的構建圖。
圖2是實施例8中所述的重組質粒pZM-4的構建圖。
圖3是實施例9中所述的重組質粒pZM-7的構建圖。
圖4是實施例10中所述的重組質粒pZM-10的構建圖。
圖5是實施例11中PE40的PCR擴增產物的瓊脂糖電泳分析結果其中，(1.0％agarose)1Temple DNA2-7PCR(pE40)產物8標記物 pBR322/BstNI9標記物 λDNA/EcoRI＋HindIII圖6是實施例12中重組質粒pZM-1的酶切鑑定電泳分析圖其中，1pZM-l/EcoRI 4pZM-1/BamHI2pZM-1/PstI 5pUCl9/EcoRI3pZM-1/AccI6標記物λDNA/EcoRI＋HindIII21226，5148，4973，4277，3530，2027，1904，1584，1330，983，831，125圖7是實施例12中重組質粒pZM-1的酶切鑑定電泳分析圖其中，2，3，4，5pZM-1/EcoRI＋PstI1λDNA/EcoRI＋HindIII圖8是實施例13中重組質粒pZM-1的酶切鑑定電泳分析圖其中，2，3，4，5pZM-1/ApaI1λDNA/EcoRI＋HindIII圖9是實施例14中重組質粒pZM-4的酶切鑑定電泳分析圖其中1pZM-4/EcoRI＋PstI2pZM-4/PstI3pBR322/BstNI4標記物λDNA/EcoRI＋HindIII圖10是實施例15中所述的重組質粒pZM-7的酶切分析電泳圖，其中ApZM-7/SacIBpZM-7/SacI＋EcoRICpBR322/MspI DpBR322/BstNIE標記物λ/EcoRI＋HindIII圖11是實施例16中所述的重組質粒pZM-10的酶切分析電泳圖，其中，1標記物λ/EcoRI＋HindIII2pZM-10/PstI＋NdeI3pZM-10/NdeI4pZM-10/PstI圖12是實施例18中所述的IL-2(60)-PE40的純化電泳圖2IL-2(60)-PE401蛋白標記(200，97，68，43，29，18，14KD)圖13是實驗例1中所述的IL-2(60)-PE40對CTLL和P815細胞的細胞毒性。
圖14是實驗例1中所述的IL-2(60)-PE40對L1210和KB細胞的細胞毒性。
以下將結合附圖實施例進一步描述本發明的技術方案
綠膿毒素基因PE40區的克隆和序列分析以下為實施例1-14中採用的實驗材料菌種、質粒、DNAPAl03購自ATCC，分泌綠膿毒素的標準綠膿桿菌菌株DH5α其基因型為sup E44，Δlac U169，(φ80 lac ZΔM15)hsdRl7，rec A1，end A1，gyr A96，thi-1，rel A1JM103其基因型為ΔLac pro，thi，StrA，Sup E，end A，Sbc B15，hsd R4，F′tra D36，pro A B，Lac lq，ZΔM15pUC19pBV220預防醫學科學院病毒所構建，含λCI857，λPRPL串聯啟動子，核糖體rrnB基因轉錄終止信號單鏈寡核苷酸41mer和43mer，IL-2(60)的PCR引物起始引物(33mers)NdeI5′＞AGCA GAATTCAT[TAG GCA CCT ACT TCA AGT TCT]＜3′EcoRI半引物(32mers)5′＞AGAC GAGCTC GTC[TAG ACA CTG AAG ATG TIT C]＜3′SaCT
以上的引物由中國科學院微生物所合成λDNA/EcoRI＋HindIII華美生物工程公司產品(分子量大小分別為21226，5148，4973，4277，3530，2027，1904，1584，1330，985，831，125bp)pBR322/BstNI協和友誼公司產品(分子量大小分別為1857，1060，929，383bp)工具酶PCR擴增試劑盒為上海復旦大學產品T7 DNA測序試劑盒為美國Promaega公司產品T4 DNA連接酶和大腸桿菌聚合酶I大片段為德國Boehringer Manheim公司產品蛋白酶K為美國BRL公司產品溶菌酶和RNase為美國Sigma公司產品SalI等其他限制性內切酶為協和友誼公司產品化學試劑胰蛋白腖和酵母浸出物為英國Oxoid公司產品X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)，CsCl，ATP和溴乙錠為德國Boehringer Manheim公司產品回收用瓊脂糖、IPTG、和TEMED為美國BRL公司產品Sephadex G-50為Pharmacia公司產品α-35S-dATP為Amersham公司產品SDS為華美生物工程公司產品丙烯醯胺為日本進口分裝N-N′-甲叉雙丙烯醯胺為Merck公司產品分析純尿素為中國醫藥公司北京分公司進口分裝其它分析純試劑均為北京化學試劑商店的國產分析純試劑主要培養基及緩衝液1.培養基各種培養基均按文獻J.Sambrook等人的方法配製(J.Sambrook et al.，MolecilarCloning，a Laboratory Manual，Second Edition)2.緩衝液TE，STE，TAE，TBE，均按上述J.Sambrook等人的方法配製Klenow反應緩衝液(10×)0.5mol/L Tris·Cl(PH7.6)0.1mol/L MgC12實施例1.細菌Total DNA的製備單菌落接種100ml LB過夜培養，6,000rpm，15分鐘離心收集菌體，STE洗細胞兩次，加5ml TE懸浮細胞，加5mg溶菌酶，0.5 ml EDTA(100mM)，然後37℃短暫水浴至溶液變粘(3-5分鐘)，迅速加入SDS至1％濃度，蛋白酶K至50-100ug/ul，用玻棒溫和地十分小心地混勻。37℃水浴20-30分鐘，然後用TE稀釋至50ml，酚抽提五次，氯仿抽提三次，每次用大口徑移液管(出口直徑大於0.3cm)將粘稠的水相轉移，二倍體積乙醇沉澱，70％乙醇洗滌後乾燥(不要等完全乾燥，否則極難溶解)，加0.5ml TE，水浴振蕩溶解。實施例2.寡核苷酸引物的純化按Narang，S.A.等人和Itakura，K.等人的方法(Narang，S.A.et al.，Chemic al synthesis ofdeoxyoligonucleotides by the modified trestermethod.Met hods Enzymol.65610；Itakura，K.et al.，Synthesis and use of syntheticoligonucleotides.Annu.Rev.Biochem.53323)合成的每管DNA樣品，用500ul飽和尿素溶解，加150ul尿素飽和的6×溴酚蘭載樣buffer，用16％聚丙烯醯胺凝膠(7mol/L尿素)電泳分離(用製備性梳子，每孔長12.5cm，高4.5cm，厚0.4cm)，600V，10小時後，溴酚藍遷移至底部時結束電泳，剝落凝膠，平鋪於螢光矽膠板上，紫外燈照射觀察，切下移動最慢的DNA片段帶，以0.5N Nacl水溶液浸泡切下的凝膠，37℃水浴過夜。玻璃棉濾除凝膠塊，收集濾液，於UV-120-02分光光度計上測260nm波長的OD260值。估算粗產品的量。然後，SEP-PAK C18反相柱進一步純化，SEP-PAK C18反相柱先用甲醇過夜浸泡，再依次用10ml甲醇，60％甲醇水溶液和雙蒸水洗滌柱子。將上述浸泡濾液反覆上柱4-6次，直至洗脫液的OD260＜0.1(或洗脫液OD260小於上柱前總OD260的5-10％)將DNA結合到柱上。洗脫前先用10ml雙蒸水洗滌柱子，以洗去無機鹽離子。然後用2ml新配製的60％甲醇反覆洗柱子3-5次，使大部分DNA洗脫下來，OD260定量。合併所有洗脫液，測OD260定總量。分裝成約400ul一小管在eppendorf管中進行冷凍抽乾，-20℃存放。實施例3質粒的製備採用鹼裂解法，系根據上述J.Sambrook等人介紹的方法改進挑選單個菌落接種到5ml含抗菌素的LB培養基中，37℃活化過夜，次日轉種到100ml LB培養基中，37℃震搖培養至OD600≈0.8時，加入氯黴素達170ug/ml，使質粒擴增。繼續在37℃培養18-24小時後，離心5,000rpm，4℃收集細菌，混懸於6ml溶液I(50mM葡萄糖，50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，含溶菌酶3mg/ml)。冰浴10分鐘後，加溶液II(1％SDS，0.2N NaOH)12ml。冰浴5分鐘，加溶液III(3M KAc，2MHAc，pH4.8)9ml，冰浴30分鐘後，離心7,000rpm，4℃，30分鐘去沉澱，加等體積酚氯仿(1∶1)抽提，然後加0.6倍體積的異丙醇，離心沉澱DNA。按上述J.Sambrook等人相同的方法進行質粒的酶切。實施例4.DNA片段的回收與純化DNA電泳後，將所需DNA片段從瓊脂糖凝膠上切下並電洗脫回收，回收的DNA分別用Elutip TM-d柱純化，方法如下(1)柱的預處理用5ml注射器吸取2ml高鹽溶液(1.0M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.4)緩慢通過柱子，再取另一5ml注射器吸取5ml低鹽溶液(0.2MNaCl，20mM Tris-HCl，pH7.4)通過柱子。
(2)上柱DNA樣品溶於低鹽中緩慢通過柱子，DNA結合於其上，用2-3ml低鹽溶液洗注射器，並緩慢過柱。
(3)洗脫用高鹽溶液400ul緩慢過柱，收集過柱液，再次緩慢過柱，另取新高鹽溶液400ul同法處理，合併過柱液，乙醇沉澱回收DNA。實施例5 DNA片段的連接與轉化將內切酶切成線狀的載體與插入片段按一定比例(1∶5-10)混合，65℃水浴後，迅速置於冰浴中，依次加入10×T4連接酶緩衝液和T4DNA連接酶，反應體積為10-20ul，4℃連接過夜或16℃連接4小時。
取5ul連接混合物，稀釋到100ul 75mM CaCl2中，再力200ul CaCl2致敏的宿主細胞，冰浴1小時，再42℃2分鐘，然後加入等量LB，在37℃或30℃(當質粒上帶PL啟動子時)震搖1小時，然後塗在含抗菌素的平板上培養。按上述相同的J.Sambrook等人文獻的方法進行小量快速抽提質粒。實施例6.PCR擴增PE40基因PCR擴增方法參見文獻(Henry A.ErlichPCRTechnology，principles and Applications forDNA Amplification，Stockton Press，1989)提供的一些方法，在新的0.5ml eppendorf管中，依次加入PA103總DNA(OD260＝4)2ul引物(50pmol/ul) 各1ul10×buffer 5ul
dNTPs(5mM) 2ulBSA(10ug/ul) 1ulDMSO 5uldH20 32.5ul混勻離心，37℃變性7分鐘，3,000rpm離心20秒，迅速加3u(1.5ul)Taq DNA聚合酶，輕輕混勻，再加入35ul石蠟油覆蓋表面，3,000rpm離心5秒，70℃延伸1.5分鐘後便進入PCR循環。循環條件為變性94℃，1分鐘；退火57℃，30秒；延伸70℃，1.5分鐘。從第五個循環開始，退火溫度改為67℃，其餘不變，經20個循環後，70℃保溫10分鐘結束反應，並取少量樣品1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。經鑑定後的反應物經酚氯仿抽提後，加入1/2體積的7.5M NH4Ac和2.5體積乙醇混勻後室溫10分鐘，離心去除過量的dNTP並沉澱DNA。實施例7.重組質粒pZM-1(PE40-pUC19)的構建如圖1，將擴增出的PE40基因利用ECORI和PstI插入pUC19，轉化JM103感受態細胞，含有插入片段的轉化子12-16小時內可在X-gal IPTG的LB/Amp平板上形成白色菌落，小量快速抽提質粒，酶切鑑定重組體。實施例8.重組質粒pZM-4(PE40-pBV220)的構建PE40經測序驗證後，從pZM-1中用EcoRI和PstI切下PE40插入同酶切的pBV220中(見圖2)，獲得表達重組體PE40-pBV220，命名為pZM-4。實施例9重組質粒pZM-7(IL-2(60)-PE40-pBV220)的構建參見圖3，從白介素II中用EcoRI和SacI切下IL-2(60)插入同酶切的PE40-pBV220，得重組質粒(IL-2(60)-PE40-pBV220)，命名為pZM-7。實施例10.重組質粒pZM-10(IL-2(60)-PE40-pT7-7)的構建參見圖4，從本發明製得的pZM-7中，用NdeI和PstI切下IL-2(60)-PE40插入同酶切的pT7-7，得重組質粒(IL-2(60)-PE40-pT7-7)，命名為pZM-10。
最終製得的重組質粒，如pZM-10具有如下文中序列號3的序列。實施例11 PCR擴增的PE40基因在PCR反應過程中，由於設計的引物含有較多非配對鹼基，它只能同自身擴增出的模板配對，採用兩步退火法以儘可能提高反應的退火溫度來提高擴增的特異性，反應產物的瓊脂糖凝膠電泳如圖5所示，2-7均為特異擴增出的1086bp左右的基因，與預計PE40基因大小相等。其結果參見圖5。實施例12重組質粒pZM-1(PE40-pUC19)的酶切鑑定
PE40-pUC19中，插入片段PE40為1086bp，pUC19為2686bp，共計3772bp。由於PE40利用pUC19中EcoRI和PstI位點插入，pUC19中將不再有BamHI，PE40中有一個BamHI位點，因此，EcoRI，PstI，AccI，BamHI和ApaI酶切均產生3772bp的一條帶，EcoRI和PstI雙酶切將產生1086bp＋2686bp兩條帶，圖6，7和8電泳結果與以上分析相符合。實施例13 PE40基因的序列分析經序列分析結果表明，擴增出的PE40基因同文獻報導相比較，有三處突變(1)PE 272胺基酸由Phe(TTC)→Ser(TCC)；(2)PE338胺基酸由Leu(CTG)→Leu(CTT)；(3)PE459胺基酸由Ser(AGC)→Asn(AAC)。經自動測序儀(ABI381型)測序核對無誤，產生變化的兩個胺基酸均不是文獻報導中的重要活性位點，PE459胺基酸處於PE中613個胺基酸的最後部分，不會對三級結構產生很大影響。
經測定，本發明製得的PE40之序列為GAGCTCATGG GCGGCAGCCT GGCCGCGCTG ACCGCGCACC AGGCTTGCCA CCTGCCGCTG 60GAGACTTCCA CCCGTCATCG CCAGCCGCGC GGCTGGGAAC AACTGGAGCA GTGCGGCTAT 120CCGGTGCAGC GGCTGGTCGC CCTCTACCTG GCGGCGCGGC TGTCGTGGAA CCAGGTCGAC 180CAGGTGATCC GCAACGCCCT GGCCAGCCCC GGCAGCGGCG GCGACCTGGG CGAAGCGATC 240CGCGAGCAGC CGGAGCAGGC CCGTCTTGCC CTGACCCTGG CCGCCGCCGA GAGCGAGCGC 300TTCGTCCGGC AGGGCACCGG CAACGACGAG GCCGGCGCGG CCAACGCCGA CGTGGGTAGC 360CTGACCTGCC CGGTGGCCGC CGGTGAATGC GCGGGCCCGG CGGACAGCGG CGACGCCCTG 420CTGGAGCGCA ACTATCCCAC TGGCGCGGAG TTCCTCGGCG ACGGCGGCGA CGTCAGCTTC 480AGCACCCGCG GCACGCAGAA CTGGACGGTG GAGCGGCTGC TCCAGGCGCA CCGCCAACTG 540TAGGAGCGCG GCTATGTGTT CGTCGGCTAC CACGGCACCT TCCTCGAAGC GGCGCAAAGC 600ATCGTCTTCG GCGGGGTGCG CGCGCGCAAC CAGGACCTCG ACGCGATCTG GCGCGGTTTC 660TATATCGCCG GCGATCCGGC GCTGGCCTAC GGCTACGCCC AGGACCAGGA ACCCGACGCA 720CGCGGCCGGA TCCGCAACGG TGCCCTGCTG CGGGTCTATG TGCCGCGCTC GAGCCTGCCG 780GGCTTCTACC GCACCAGCCT GACCCTGGCC GCGCCGGAGG CGGCGGGCGA GGTCGAACGG 840CTGATCGGCC ATCCGCTGCC GCTGCGCCTG GACGCCATCA CCGGCCCCGA GGAGGAAGGC 900GGGCGCCTGG AGACCATTCT CGGCTGGCCG CTGGCCGAGC GCACCGTGGT GATTCCCTCG 960GCGATCCCCA CCGACCCGCG CAACGTCGGC GGCGACCTCG ACCCGTCCAG CATCCCCGAC 1020AAGGAACAGG CGATCAGCGC CCTGCTGGAC TGCGCCAGCC AGCCCGGCAA ACCGCCGCGC 1080GAGGACCTGA AGTAA 1095實施例14重組質粒pZM-4(PE40-pBV220)的酶切鑑定pZM-4由1086bp的PE40經EcoRI和PstI雙酶切後插入3666bp的pBV220構成，PstI單酶切應產生一條4752bp帶，EcoRI和PstI雙酶切後產生3666bp和1086bp兩條帶，圖9電泳結果與以上分析相符合。IL-2(60)-PE40融合蛋白的基因克隆、表達及純化以下為實施例15-18中使用的實驗材料菌種、細胞、質粒、DNACTLL20細胞(ATCC TIB214)可長期培養的IL-2依賴的鼠T淋巴細胞系；P815細胞 (ATCC TIB 64)鼠肥大細胞瘤；KB細胞(ATCC CCL 17)人表皮癌細胞；L1210細胞 (ATCC CCL 219)鼠淋巴細胞白血病細胞；MLA上清 含MLA細胞分泌的IL-2；pBR322/MspI協和友誼公司產品(分子量大小為622，527，404，309，242，238，217，201，190，180，160bp )工具酶NdeI為美國BRL公司產品其餘同第一部分化學試劑及其它3H-Leu為中國原子能研究院同位素所產品MEM基本培養基為美國GIBCO公司產品胎牛血清為天津血研所產品液閃液(鹼裂解細胞用)(1)PPO5g(2)POPOP 0.15g(3)甲苯667ml(4)Triton X-100332ml閃爍液(1)PPO 6g(2)POPOP 0.2g(3)甲苯1000ml其餘同上述實施例中使用的試劑。實施例15重組質粒pZM-7(IL-2(60)-PE40)的酶切分析鑑定重組質粒pZM-7大小約為4832bp，EcoRI和SacI都是單切點，故SacI酶切產生4832bp的片段，EcoRI和SacI雙酶切可將IL-2(60)從中切出，得到一條180bp的IL-2(60)帶和一條4746bp的PE40-pBV220帶。圖10顯示結果與以上數據相符合。實施例16重組質粒pZM-10的酶切分析鑑定重組質粒pZM-10應為3.7Kb，PstI和NdeI都是單切點，各自單酶切應成3.7Kb的一條帶，雙酶切則成兩條帶2.45Kb(載體pT7-7)＋1.26 Kb(IL-2(60)-PE40)，酶切分析的電泳結果與以上數據相符合。如圖11電泳結果與以上分析相符合。實施例17重組質粒pZM-7(IL-2(60)-PE40-pBV220)和
pZM-10(IL-2(60)-PE40-pT7-7)的誘導表達pZM-7和pZm-10採用本領域公知的技術分別轉化大腸桿菌JBDE3，30℃過夜培養，但是，LB培養基中不加卡那黴素；培養溫度均為37℃；在OD650＝0.4時，加1mM IPTG誘導一個半小時，離心收集菌體。
以上表達產物個收集3ml表達菌體，經1ml10％三氯醋酸沉澱，1.5ml丙酮洗滌二次，加入1×SDS載樣緩充液100μl，100℃煮3分鐘，立即淬入水中，4000rpm離心3分鐘，取10-15μl作12％SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。
pZM-7經誘導表達量很低(圖片略)，而pZM-10在JBDE3中有較高的表達，經快速凝膠掃描顯示，表達量可佔細胞可溶性蛋白總量的17.96％。
經對大腸桿菌JBDE3/pZM-10的穩定性測定表明合有pZM-10表達載體的大腸桿菌，即JBDE3/pZM-10是穩定的。實施例18 pZM-10表達的IL-2(60)-PE40融合蛋白的純化如圖12所示，經過Sephacryl S-200層析柱和超濾後，復性的IL-2(60)-PE40的純度已達到85％以上。實驗例1 IL-2(60)-PE40融合蛋白的生物活性測定根據設計，IL-2(60)-PE40應該對含有IL-2R的CTLL細胞有特異性殺傷，而對無IL-2R的P815細胞和KB細胞則無毒副作用。從表1和圖13，14中的數據，我們可以發現在IL-2(60)-PE40濃度為2.5ug/ml時，對CTLL細胞的抑制率可達64.8％，而此濃度對P815細胞和KB細胞均無抑制作用。除此之外，IL-2(60)-PE40還對L1210細胞有很強的殺傷能力，其機制尚不清楚。
表1 IL-2(60)-PE40抑制蛋白合成的能力
序列表序列標識號1序列長度1281bp鏈數單鏈分 子 型質粒DNA特徵從1bp至180 bp為ILII的結合功能區(BINDING DOMAIN)從193 bp至1275 bp為綠膿毒素基因片段來源人和綠膿桿菌性質IL-2與綠膿毒素融合蛋白的表達性重組體ATGGCACCTA CTTACCGTTC TACAAAGAAA ACACAGCTAC AACTGGAGCA TTTACTGCTG 60GATTTACAGA TGATTTTGAA TGGAATTAAT AATTACAAGA ATCCCAAACT CACCAGGATG 120CTCACATTTA AGTTTTACAT GCCCAAGAAG GCCACAGAAC TGAAACATCT TCAGTGTCTA 180GACGAGCTCA TGGGCGGCAG CCTGGCCGCG CTGACCGCGC ACCAGGCTTG CCACCTGCCG 240CTGGAGACTT CCACCCGTCA TCGCCAGCCG CGCGGCTGGG AACAACTGGA GCAGTGCGGC 300TATCCGGTGC AGCGGCTGGT CGCCCTCTAC CTGGCGGCGC GGCTGTCGTG GAACCAGGTC 360AGCCAGGTGA TCCGCAACGC CCTGGCCAGC CCCGGCAGCG GCGGCGACCT GGGCGAAGCG 420AGCCGCGAGC AGCCGGAGCA GGCCCGTCTT GCCCTGACCC TGGCCGCCGC CGAGAGCGAG 480CGCTTCGTCC GGCAGGGCAC CGGCAACGAC GAGGACGGCG CGGCCAACGC CGACGTGGAG 540AGCCTGACCT GCCCGGTCGC CGCCGGTGAA TGCCGGGGCC CGGCGGACAG CGGCGACGCC 600CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG GCGACGGCGG CGACGTCAGC 660TTCAGCACCC GCGGCACGCA GAACTGGACG GTGGAGCGGC TGCTCCAGGC GCACCGCCAA 720CTGGAGGAGC GCGGCTATGT GTTCGTCGGC TACCACGGCA CCTTCCTCGA AGCGGCGCAA 780AGCATCGTCT TCGGCGGGGT GCGCGCGCGC AACCAGGACC TCGACGCGAT CTGGCGCGGT 840TTCTATATCG CCGGCGATCC GGCGCTGGCC TACGGCTACG CCCAGGACCA GGAACCCGAC 900GCACGCGGCC GGATCCGCAA CGGTGCCCTG CTGCGGGTCT ATGTGCCGCG CTCGAGCCTG 960CCGGGCTTCT ACCGCACCAG CCTGACCCTG GCCGCGCCGG AGGCGGCGGG CGAGGTCGAA 1020CGGCTGATCG GCCATCCGCT GCCGCTGCGC CTGGACGCCA TCACCGGCCC CGAGGAGGAA 1080GGCGGGCGCC TGGAGACCAT TCTCGGCTGG CCGCTGGCCG AGCGCACCGT GGTGATTCCC 1140TCGGCGATCC CCACCGACCC GCGCAACGTC GGCGGCGACC TCGACCCGTC CAGCATCCCC 1200GACAAGGAAC AGGCGATCAG CGCCCTGCCG GACTACGCCA GCCAGCCCGG CAAACCGCCG 1260CGCGATTACC TGAAGTAATA G 1281序列標識號2序列長度1280 bp鏈數單鏈分 子 型質粒DNA及其對應的胺基酸特徵從1bp至180bp為ILII的結合功能區(BINDING DOMAIN)從193bp至1275bp為綠膿毒素基因片段來源人和綠膿桿菌性質IL-2與綠膿毒素融合蛋白的表達性重組體ATG GCA CCT ACT TAC CGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG CTA CAA CTG GAGMet Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu5 10 15CAT TTA CTG CTG GAT TTA CAG ATG ATT TTG AAT GGA ATT AAT AAT TACHis Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30AAG AAT CCC AAA CTC ACC AGG ATG CTC ACA TTT AAG TTT TAC ATG CCCLys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro35 40 45AAG AAG GCC ACA GAA CTG AAA CAT CTT CAG TGT CTA GAC GAG CTC ATGLys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Asp Glu Leu Met50 55 60GGC GGC AGC CTGGCCGCG CTG ACC GCG CAC CAG GCT TGC CAC CTG CCGGly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro65 70 75 80CTG GAG ACT TCC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG GAA CAA CTGLeu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu85 90 95GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCGGlu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala100 105 110GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC AGC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTGAla Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
115 120 125GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG AGC CGC GAG CAGAla Ser Pro Gly Ser Gly Gly AsP Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln130 135 140CCG GAG CAG GCC CGT CTT GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG AGC GAGPro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu145 150 155 160CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GAC GGC GCG GCC AACArg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn165 170 175GCC GAC GTG GAG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC CGGAla Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala180 185 190GGC CCG GCG GAC AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACTGly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr195 200 205GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC CGCGly Ala Glu Phe Leu Gly Ala Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg210 215 220GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC CGC CAAGly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln225 230 235 240CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC ACC TTC CTCLeu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu245 250 255GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC AAC CAGGlu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln260 265 270GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC GAT CCG GCGAsp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala275 280 285CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA CGC GGC CGGLeu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg
290 295 300ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC TCG AGC CTGIle Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu305 310 315 320CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC GCG CCG GAG GCG GCGPro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala325 330 335GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG CTG CGC CTG GACGly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp340 345 350GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG ACC ATT CTCAla Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu355 360 365GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCCGly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro370 375 380ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCCPhr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro385 390 395 400GAC AAG GAA CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCCAsp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro405 410 415GGC AAA CCG CCG CGC GAT TAC CTG AAG TAA TAG 1404Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys420 425序列標識號3序列類型核苷酸序列長度1404 bp鏈數單鏈分 子 型質粒DNA特徵從44bp至66bp為T7啟動子序列，從109bp至115bp為核糖體結合位點，從124bp至303bp為ILII的結合功能區(BINDING DOMAIN)從316bp至1398bp為綠膿毒素基因片段，從1399bp至1404bp為串聯終止子，來源人和綠膿桿菌性質IL-2與綠膿毒素融合蛋白的表達性重組體CGATTCGAAC TTCTCGATTC GAACTTCTGA TAGACTTCGA AATTAATACG ACTCACTATA 60GGGAGACCAC AACGGTTTCC CTCTAGAAAT AATTTTGTTT AACTTTAAGA AGGAGATATA 120CATATGGCAC CTACTTACCG TTCTACAAAG AAAACACAGC TACAACTGGA GCATTTACTG 180CTGGATTTAC AGATGATTTT GAATGGAATT AATAATTACA AGAATCCCAA ACTCACCAGG 240ATGCTCACAT TTAAGTTTTA CATGCCCAAG AAGGCCACAG AACTGAAACA TCTTCAGTGT 300CTAGACGAGC TCATGGGCGG CAGCCTGGCC GCGCTGACCG CGCACCAGGC TTGCCACCTG 360CCGCTGGAGA CTTCCACCCG TCATCGCCAG CCGCGCGGCT GGGAACAACT GGAGCAGTGC 420GGCTATCCGG TGCAGCGGCT GGTCGCCCTC TACCTGGCGG CGCGGCTGTC GTGGAACCAG 480GTCAGCCAGG TGATCCGCAA CGCCCTGGCC AGCCCCGGCA GCGGCGGCGA CCTGGGCGAA 540GCGAGCCGCG AGCAGCCGGA GCAGGCCCGT CTTGCCCTGA CCCTGGCCGC CGCCGAGAGC 600GAGCGCTTCG TCCGGCAGGG CACCGGCAAC GACGAGGACG GCGCGGCCAA CGCCGACGTG 660GAGAGCCTGA CCTGCCCGGT CGCCGCCGGT GAATGCCGGG GCCCGGCGGA CAGCGGCGAC 720GCCCTGCTGG AGCGCAACTA TCCCACTGGC GCGGAGTTCC TCGGCGACGG CGGCGACGTC 780AGCTTCAGCA CCCGCGGCAC GCAGAACTGG ACGGTGGAGC GGCTGCTCCA GGCGCACCGC 840CAACTGGAGG AGCGCGGCTA TGTGTTCGTC GGCTACCACG GCACCTTCCT CGAAGCGGCG 900CAAAGCATCG TCTTCGGCGG GGTGCGCGCG CGCAACCAGG ACCTCGACGC GATCTGGCGC 960GGTTTCTATA TCGCCGGCGA TCCGGCGCTG GCCTACGGCT ACGCCCAGGA CCAGGAACCC1020GACGCACGCG GCCGGATCCG CAACGGTGCC CTGCTGCGGG TCTATGTGCC GCGCTCGAGC1080CTGCCGGGCT TCTACCGCAC CAGCCTGACC CTGGCCGCGC CGGAGGCGGC GGGCGAGGTC1140GAACGGCTGA TCGGCCATCC GCTGCCGCTG CGCCTGGACG CCATCACCGG CCCCGAGGAG1200GAAGGCGGGC GCCTGGAGAC CATTCTCGGC TGGCCGCTGG CCGAGCGCAC CGTGGTGATT 1260CCCTCGGCGA TCCCCACCGA CCCGCGCAAC GTCGGCGGCG ACCTCGACCC GTCCAGCATC 1320CCCGACAAGG AACAGGCGAT CAGCGCCCTG CCGGACTACG CCAGCCAGCC CGGCAAACCG 1380CCGCGCGATT ACCTGAAGTA ATAG 140權利要求
1.一種含有白介素II基因片段和綠膿毒素基因片段的核苷酸序列，其特徵是所述的白介素II結合其受體的功能區的基因片段直接與綠膿毒素基因片段融合。
2.如權利要求1所述的核苷酸序列，其特徵是所述的白介素II基因片段具有第一功能區的功能。
3.如權利要求1或2所述的核苷酸序列，其特徵是所述的綠膿毒素基因片段具有第二和第三功能區的功能。
4.如權利要求1所述的核苷酸序列，其特徵是所述的核苷酸序列可為ATGGCACCTA CTTACCGTTC TACAAAGAAA ACACAGCTAC AACTGGAGCA TTTACTGCTG 60GATTTACAGA TGATTTTGAA TGGAATTAAT AATTACAAGA ATCCCAAACT CACCAGGATG 120CTCACATTTA AGTTTTACAT GCCCAAGAAG GCCACAGAAC TGAAACATCT TCAGTGTCTA 180GACGAGCTCA TGGGCGGCAG CCTGGCCGCG CTGACCGCGC ACCAGGCTTG CCACCTGCCG 240CTGGAGACTT CCACCCGTCA TCGCCAGCCG CGCGGCTGGG AACAACTGGA GCAGTGCGGC 300TATCCGGTGC AGCGGCTGGT CGCCCTCTAC CTGGCGGCGC GGCTGTCGTG GAACCAGGTC 360AGCCAGGTGA TCCGCAACGC CCTGGCCAGC CCCGGCAGCG GCGGCGACCT GGGCGAAGCG 420AGCCGCGAGC AGCCGGAGCA GGCCCGTCTT GCCCTGACCC TGGCCGCCGC CGAGAGGCGAG480CGCTTCGTCC GGCAGGGCAC CGGCAACGAC GAGGACGGCG CGGCCAACGC CGACGTGGAG 540AGCCTGACCT GCCCGGTCGC CGCCGGTGAA TGCCGGGGCC CGGCGGACAG CGGCGACGCC 600CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG GCGACGGCGG CGACGTCAGC 660TTCAGCACCC GCGGCACGCA GAACTGGACG GTGGAGCGGC TGCTCCAGGC GCACCGCCAA 720CTGGAGGAGC GCGGCTATGT GTTCGTCGGC TACCACGGCA CCTTCCTCGA AGCGGCGCAA 780AGCATCGTCT TCGGCGGGGT GCGCGCGCGC AACCAGGACC TCGACGCGAT CTGGCGCGGT 840TTCTATATCG CCGGCGATCC GGCGCTGGCC TACGGCTACG CCCAGGACCA GGAACCCGAC 900GCACGCGGCC GGATCCGCAA CGGTGCCCTG CTGCGGGTCT ATGTGCCGCG CTCGAGCCTG 960CCGGGCTTCT ACCGCACCAG CCTGACCCTG GCCGCGCCGG AGGCGGCGGG CGAGGTCGAA1020CGGCTGATCG GCCATCCGCT GCCGCTGCGC CTGGACGCCA TCACCGGCCC CGAGGAGGAA1080GGCGGGCGCC TGGAGACCAT TCTCGGCTGG CCGCTGGCCG AGCGCACCGT GGTGATTCCC 1140TCGGCGATCC CCACCGACCC GCGCAACGTC GGCGGCGACC TCGACCCGTC CAGCATCCCC 1200GACAAGGAAC AGGCGATCAG CGCCCTGCCG GACTACGCCA GCCAGCCCGG CAAACCGCCG 1260CGCGATTACC TGAAGTAATA G1281
5.一種合有權利要求1所述的核苷酸序列的重組表達載體。
6.如權利要求5所述的重組表達載體，其特徵是所述的表達載體合有如權利要求4所述的核苷酸序列。
7.如權利要求6所述的重組表達載體，其特徵是所述的表達載體是重組質粒pZM10。
8.一種含有如權利要求5或6所述表達載體的大腸桿菌。
9.如權利要求8所述的大腸桿菌，其特徵是所述的大腸桿菌含有如權利要求2所述的核苷酸序列，該大腸桿菌已於1994年8月22日在中國武漢CCTCC保藏，其保藏號為CCTCC M 94054。
10.一種經權利要求8所述的的大腸桿菌表達出的融合蛋白，其特徵是該蛋白具有如下胺基酸序列Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu5 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro35 40 45Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Asp Glu Leu Met50 55 60Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro65 70 75 80Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu85 90 95Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala100 105 110Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu115 120 125Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln130 135 140Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu145 150 155 160Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn165 170 175Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala180 185 190Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr195 200 205GIy Ala Glu Phe Leu Gly Ala Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg210 215 220Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln225 230 235 240Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu245 250 255Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln260 265 270Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala275 280 285Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg290 295 300Ile Arg Ash Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu305 310 315 320Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala325 330 335Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp340 345 350Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu355 360 365Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro370 375 380Phr Asp Pro Arg Asn Val GIy Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro385 390 395 400Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro405 410 415Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys420 42全文摘要
本發明提供了一種含有白介素II基因片段和綠膿毒素基因片段的分子導向藥物的核苷酸序列，該序列是將白介素II結合其受體的功能區的基因片段直接與綠膿毒素基因片段融合，本發明還提供含有上述核苷酸序列的重組表達載體，以及含有這種表達載體的大腸桿菌。
文檔編號B27M3/00GK1119677SQ9411659
公開日1996年4月3日 申請日期1994年9月29日 優先權日1994年9月29日
發明者盧聖棟, 張萌, 李煥婁 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所