一種高效表達v8蛋白酶的方法
2023-06-23 08:10:26
一種高效表達v8蛋白酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效表達V8蛋白酶的方法，屬於酶工程【技術領域】。本發明將融合了SUMO標籤的V8蛋白酶基因，在大腸桿菌中進行表達，獲得含有SUMO標籤的V8蛋白酶，然後利用SUMO蛋白酶移除SUMO標籤，獲得具有活性的V8蛋白酶。酶活可達15.5U/mg，已經適用於重組蛋白製備和肽指紋圖譜鑑定。
【專利說明】-種高效表達V8蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高效表達V8蛋白酶的方法，屬於酶工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002] V8 蛋白酶（V8protease 又稱 GluV8 或Glu_c)英文名 Endoproteinase Glu_C from Staphylococcus aureus V8,屬於穀氨醯內切酶I (EC3. 4· 21. 19)家族，是一種絲氨酸蛋白 酶，具有嚴格的底物特異性，能水解多肽鏈中穀氨酸和（或）天冬氨酸殘基的羧基形成的肽 鍵。
[0003] 目前V8蛋白酶主要來源於金黃色葡萄球菌的提取，由於金黃色葡萄球菌的致病 性，使其在生產和應用上受到很大的限制。很多異源表達方法大多存在一定的不足，例如該 蛋白酶的強烈活性會對宿主產生傷害致使產量低等。
[0004] 本發明旨在用Sumo作為酶原來抑制GluC的活性，以提高GluC在大腸桿菌中的產 量。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種新型V8蛋白酶酶原，是在成熟V8蛋白酶的 N端融合SUM0標籤形成酶原。
[0006] 所述成熟V8蛋白酶是以SEQ ID N0. 2所示的序列為出發序列，將第一位纈氨酸突 變為亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸之外的疏水胺基酸。
[0007] 所述成熟V8蛋白酶的胺基酸序列優選如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQID N0. 5、 SEQ ID NO. 6所示的序列。是將V8蛋白酶第1位的纈氨酸分別突變為丙氨酸（A)、甘氨酸 (G)、甲硫氨酸（M)或苯丙氨酸（F)。
[0008] 所述成熟V8蛋白酶還優選在C端進一步融合His Tag。
[0009] 所述SUMO標籤的胺基酸序列如SEQ ID Ν0· 7所示。
[0010] 所述SUMO標籤優選在N端還添加 His標籤和TEV酶切位點，得到胺基酸序列如 SEQ ID N0. 8所示的融合標籤。
[0011] 本發明要解決的第二個技術問題是構建一種高效表達所述V8蛋白酶酶原的大腸 桿菌，是將成熟V8蛋白酶基因與SUM0標籤基因融合，形成酶原基因，在大腸桿菌中進行表 達，獲得含有SUM0標籤的V8蛋白酶，然後利用SUM0蛋白酶移除SUM0標籤，獲得具有活性 的V8蛋白酶。
[0012] 本發明要解決的第三個技術問題是提供一種構建所述大腸桿菌的方法，包括如下 步驟：
[0013] (1)人工合成優化過的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶基因（簡稱V8基因）。
[0014] ⑵使用PCR方法在V8基因上下遊加上與pET21-SUM0載體同源的序列，以便構建 包含蛋白酶編碼基因的載體質粒。
[0015] (3)使用同源重組的方法完成pET21-SUM0載體和V8基因的連接，獲得重組表達質 粒，序列正確的質粒轉化BL21 (DE3)，塗板，篩選陽性轉化子。
[0016] 所述重組表達質粒還可以通過先融合SUM0標籤和V8基因，再與載體連接獲得。
[0017] 本發明還提供一種應用所述大腸桿菌生產V8蛋白酶的方法，包括如下步驟：
[0018] (1)挑取重組菌菌落轉接試管培養至〇D_約0. 8,添加最終濃度為ImMIPTG，誘導 培養。
[0019] (2)離心收集菌體，緩衝液重懸後破碎菌體，離心取上清；Ni2+柱吸附蛋白，咪唑洗 脫後脫鹽，使用SUM0蛋白酶剪切SUM0標籤，得到具有活性的V8蛋白酶。
[0020] (3)使用MonoQ、MonoS等柱子進一步純化蛋白。
[0021] 由於V8蛋白酶對大腸桿菌的毒性，任何沒有完全抑制活性的酶原都能使大腸杆 菌死亡而不能生產V8蛋白酶。並且，V8蛋白酶是一個很特殊的蛋白酶，它的成熟序列的N 端靠近活性中性（圖5)，如果N端添加胺基酸，它就會伸向活性中心而顯著影響V8蛋白酶 的活性。現有技術中，對於重組表達蛋白酶的研究主要是改造蛋白酶自身的酶原序列。Sumo 標籤有13kd足夠大而且是個完整的球狀結構域，當向V8蛋白酶N端添加 Sumo標籤時，既 能很好地抑制V8蛋白酶在宿主體內的活性，避免對宿主造成傷害，又能通過Sumo蛋白酶將 Sumo tag完全切除不殘留一個胺基酸殘基。但Sumo tag對與之相連的酶的首位胺基酸有 選擇性，不能是V、L、P、K。
[0022] 本發明中，我們將V8蛋白酶首位的纈氨酸突變為丙氨酸（A)、甘氨酸（G)、甲硫氨 酸（M)、苯丙氨酸（F)，並首次與Sumo tag融合形成一種新型酶原，實現了 V8蛋白酶在大腸 桿菌中的高效表達，並通過後期處理獲得活性很好的V8蛋白酶，大大提高了 GluC在大腸杆 菌中的產量，搖瓶產量達到20mg/L培養基，酶活可達15. 5U/mg，已經適用於重組蛋白製備 和肽指紋圖譜鑑定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1 :移除標籤激活後的v8蛋白酶LC-MS檢測結果
[0024] 圖2 :V8蛋白酶酶活測定使用底物分子結構
[0025] 圖3 :激活後的V8蛋白酶米氏常數雙倒數計算圖
[0026] 圖4 :0D值與底物濃度的標準曲線
[0027] 圖5 :原始V8蛋白酶結構
[0028] 圖6 :突變後的V8蛋白酶結構，A :V1A突變酶，B :V1G突變酶，C :V1M突變酶，D :V1F 突變酶。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1可溶性表達V8蛋白酶的大腸桿菌基因工程菌株的構建和培養
[0030] (1)所用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶基因的出發核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 其編碼的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶成熟區胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。SUMO標籤的 胺基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0031] 從V8蛋白酶的3維結構可以看出，在它成熟序列的N端增加任何胺基酸都會影響 它的活性，因此V8蛋白酶的N端不能有任何胺基酸的增加。然而，在成熟區N端添加 Sumo Tag時，Sumo Tag之後的胺基酸不能是P、K、L或V，因此，可以通過定點突變將GluC第1位 的胺基酸V突變為A、G、M或F。突變後的V8蛋白酶的成熟區胺基酸序列分別如SEQ ID. 3、 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 所示，結構如圖 6 所示。
[0032] (2)對於VIA突變體，使用PCR方法在編碼突變後的V8蛋白酶的基因上下遊加上 與PET21-SUM0載體同源的序列，以便構建包含蛋白酶編碼基因的載體質粒，其中SUM0標 籤N端添加了 His標籤和TEV酶切位點，V8蛋白酶的C端還添加了 His tag，胺基酸序列如 SEQ ID N0. 9。Sumo標籤前的His tag在V8蛋白酶激活後被一同切除。pET21-sumo載體 來源於 pET21a(novagen)和 pET-sumo (Invitrogen)。用 PCR 從 pET-sumo 載體上獲取 sumo tag，N端再融合His Tag和TEV酶切位點，並將其插入pET21a載體上得到pET21a-sumo載 體。
[0033] PCR 上遊引物：CACAGAGAAC AGATTGGTGG CGCCATCCTGCCGAACAACG AC
[0034] PCR 下遊引物：CACCACCACC ACCACCACTG ATGAGATCCGGCTGCTAACA AAGC
[0035] PCR反應體系如表1，反應條件如表2
[0036] 表1V8基因 PCR體系
[0037]
【權利要求】
1. 一種V8蛋白酶酶原，其特徵在於，是在成熟V8蛋白酶的N端融合SUMO標籤形成酶 原。
2. 根據權利要求1所述的酶原，其特徵在於，所述成熟V8蛋白酶是以SEQ ID NO. 2所 示的序列為出發序列，將第一位纈氨酸突變為亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸之外的疏水胺基酸。
3. 根據權利要求1所述的酶原，其特徵在於，所述成熟V8蛋白酶的胺基酸序列分別如 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示。
4. 根據權利要求1所述的酶原，其特徵在於，所述成熟V8蛋白酶的C端進一步融合His Tag〇
5. 根據權利要求1所述的酶原，其特徵在於，所述SUMO標籤的胺基酸序列如SEQ IDN0. 7 所示。
6. 根據權利要求1所述的酶原，其特徵在於，所述SUMO標籤的N端還添加了 His標籤 和TEV酶切位點，得到胺基酸序列如SEQ ID NO. 8所示的融合標籤。
7. 編碼權利要求1-6任一所述酶原的基因。
8. -種高效表達權利要求1-6任一所述酶原的大腸桿菌，其特徵在於，是將成熟V8蛋 白酶基因與SUMO標籤基因融合，形成酶原基因，在大腸桿菌中進行表達，獲得含有SUMO標 籤的V8蛋白酶。
9. 一種構建權利要求8所述大腸桿菌的方法，其特徵在於，包括如下步驟： (1) 人工合成金黃色葡萄球菌V8蛋白酶基因； (2) 使用PCR方法在V8基因上下遊加上與pET21-SUM0載體同源的序列，以便構建包含 蛋白酶編碼基因的載體質粒； (3) 使用同源重組的方法完成PET21-SUM0載體和V8基因的連接，序列正確的質粒轉化 BL21 (DE3)，塗板，篩選陽性轉化子。
10. -種應用權利要求8所述大腸桿菌生產V8蛋白酶的方法，其特徵在於，包括如下步 驟： (1) 挑取重組菌培養； (2) 離心收集菌體，緩衝液重懸後破碎菌體，離心取上清；Ni2+柱吸附蛋白，咪唑洗脫後 脫鹽，使用SUMO蛋白酶剪切SUMO標籤，得到具有活性的V8蛋白酶； (3) 使用MonoQ、MonoS柱子進一步純化蛋白。
【文檔編號】C12R1/19GK104059898SQ201410261929
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月12日 優先權日:2014年6月12日
【發明者】周小滿, 高敏奇, 吳家權, 蕭國平 申請人:無錫佰翱得生物科學有限公司, 江陰市科裡生物醫藥研究院有限公司