一種連續提取番茄紅素的方法
2023-06-23 10:21:01 1
專利名稱：一種連續提取番茄紅素的方法
技術領域：
本發明屬於生物分離領域，涉及一種連續提取番茄紅素的方法。利用該方法可以 有效地從毛黴菌屬真菌三孢布拉黴菌(Blaleslea trispora)發酵菌絲體中提取番茄紅素。
背景技術：
番茄紅素是一種脂溶性天然色素，屬於類胡蘿蔔素。番茄紅素具有比其他類胡蘿 卜素更為優越的性能，如其抗氧化性在類胡蘿蔔素中最強，猝滅單線態氧能力是VE的100
倍，是β-胡蘿蔔素的2倍多，清除自由基的能力也優於其他類胡蘿蔔素。其具有極強的抗 氧化作用，可抑制癌細胞生長，減緩低密度脂蛋白(LDL)的氧化，防治動脈硬化，保護心血 管，清除香菸和汽車廢氣中的有毒物質等。番茄紅素的生產方法主要有天然提取、化學合成、微生物發酵等，而微生物發酵 法生產番茄紅素具有成本低、汙染小、安全及工藝簡單等優勢，近年來成為研究熱點之一。 目前，不少研究人員開始研究利用微生物生產番茄紅素，其中研究最多的是利用三孢布拉 黴(Blakeslea trispora)真菌發酵獲得番茄紅素的方法(CN 1353765A ；CN 1370241A ；US 2005/0106657A1 ；US 3369974 ；GB 1008469)。目前報導的提取方法絕大多數為有機溶劑提 取，溶劑消耗大，提取過程中番茄紅素受到光照、空氣等影響極易氧化，番茄紅素損失較大。 專利CN1760282A報導超臨界CO2萃取番茄紅素，提取率高，無溶劑殘留，提取時間短，但因 設備昂貴，成本高而無法實現工業化生產。
發明內容
本發明的目的是在於克服現有技術的不足，而提供一種適合於工業化生產番茄紅 素，並且生產成本低、操作方便安全、提取率高的利用三孢布拉黴菌工業化生產番茄紅素的 方法。本發明的目的可以通過下列技術措施來達到一種利用混合溶劑連續提取番茄紅素的方法，其特徵在於包含以下步驟a.三孢布拉黴菌發酵菌絲體加入乙醇進行脫水處理，過濾分離菌絲體與乙醇處理 液；對溼菌絲體通過真空乾燥和粉碎，得到乾燥菌絲體；b.經步驟a處理的菌絲體，加入混合溶劑進行固相_液相萃取在連續提取系統 的各提取單元中加入經步驟a處理的菌絲體，採用混合提取溶劑連續循環提取一定時間使 各單元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取乾淨，收集萃取液；c.步驟(b)中萃取液經真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。所述的方法，其中步驟a中乙醇濃度在50% -100%之間，乙醇與三孢布拉黴菌發 酵菌絲體的體積質量比(L/Kg)在1 1-10 1，常溫下處理5-180分鐘。 所述的方法，其中乙醇處理液經低壓蒸餾處理可循環使用。 所述的方法，其中步驟a中真空乾燥溫度在30°C -80°C，真空乾燥時間在1_24小
時，優選4-12小時。
所述的方法，其中步驟b中固相-液相萃取階段所用的混合提取溶劑以正己烷 為主要溶劑，以丙酮、乙酸乙酯或石油醚為輔助溶劑，主要溶劑與輔助溶劑的體積比為 1 1-10 1，優選正己烷/丙酮混合溶劑，正己烷與丙酮的體積比為1 1-5 1，優選 2:1-5:1。所述的方法，其中步驟b中連續提取系統由6-16根層析柱、儲液罐、循環泵、閥門 和管道組成；每一提取單元由2-5根層析柱串聯而成，包括配套儲液罐、循環泵、閥門和管 道；連續提取系統能避光操作。所述的方法，其中步驟b中每個單元按濃度梯度排列按以下操作實現單元1-5分 別加入等量經步驟a處理的菌絲體，單元5加入新鮮混合提取溶劑提取t ( 一次階段提取時 間)後排出提取液，單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4(即為1/4、2/4、3/4階段提取時間)的 提取，將單元2和4的溶劑互換，最後在單元5加入新鮮混合提取溶劑，使各個單元按照圖 2過程一開始提取時所示的濃度梯度排列，即製造好濃度梯度。所述的方法，其中連續提取系統每一過程均提取t1/4後對番茄紅素被提淨的單元 5進行排渣裝料，對不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；經過六個 操作過程，所有單元又回到起始濃度狀態，實現連續操作，如圖2所示。所述的方法，其中連續提取的方式為逆流提取；提取溫度在於20-60°C，優 選30-50°C ；提取溶劑用量在於5-40mL/g菌絲體，優選5_20mL/g菌絲體；回流速度為 0. 6-3. 6BV/h (BV為床體積)，優選0. 6-1. 8BV/h ；回流次數在於3_6次，優選2_3次；提取時 間為2-8h，優選於2-4h ；提取單元組數為3-6組，優選5-6組。所述的方法，其中各提取單元中加入等量經步驟a處理的菌絲體。進一步，具體操作過程如下(1)三孢布拉黴菌發酵液經過濾處理後，得到溼菌絲體。(2)將步驟(1)中的溼菌絲體進行預處理，其預處理條件優選為a).溼菌絲體與乙醇在常溫下攪拌，過濾得到脫水菌絲體和乙醇處理液，溼菌絲體 與乙醇質量體積比為1 1-1 10之間，優選於1 1-1 5之間；b).乙醇處理液經低壓蒸餾處理可循環使用；脫水溼菌絲體通過真空乾燥和粉 碎，得到乾燥菌絲體。(3)經步驟(2)的乾燥菌絲體，加入混合溶劑進行固相_液相萃取，在連續提取系 統的各提取單元中加入等量經步驟(2)處理的菌絲體，採用混合提取溶劑連續循環提取一 定時間使各單元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取乾淨，收集萃取液。其提 取條件優選於a).各單元濃度梯度排列按以下操作實現單元5加入新鮮混合提取溶劑提取 t ( 一次階段提取時間)後排出提取液，單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4階段提取時間的提 取，將單元2和4的溶劑互換，最後在單元5加入新鮮混合提取溶劑，使各個單元按照圖2 過程一開始提取時所示的濃度梯度排列，即製造好濃度梯度；b).連續提取過程按以下操作實現每一過程均提取t1/4後對番茄紅素被提淨的 單元5進行排渣裝料，對不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；經過 六個操作過程，所有單元又回到起始濃度狀態，實現連續操作，如圖2所示；c).混合提取溶劑以正己烷為主要溶劑，丙酮為輔助溶劑，其體積比為1 1-10 1之間，優選於2 1-5 1之間；d).連續提取的方式為逆流提取；e).提取溫度在於20_60°C之間，優選於30_50°C之間；f).提取溶劑用量在於5_40mL/g菌絲體之間，優選於5_20mL/g菌絲體之間；g) ·回流速度為0. 6-3. 6BV/h的流速之間，優選於0. 6-1. 8BV/h之間；h).回流次數在於2-6次之間，優選於2-3次之間；i).提取單元組數為3-6組，優選於5-6組之間；j).提取時間為2_8h，優選於2_4h之間。(4)將步驟(3)中萃取液經真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。連續提取系統主要包括層析柱、儲液罐、循環泵、控制閥、管道。連續提取系統中的層析柱是指可裝填菌絲體進行萃取的柱狀容器。本發明的優點在於1、本發明採用混合溶劑提取番茄紅素，充分發揮各溶劑對番茄紅素的溶解作用。2、本發明的技術優勢在於操作的連續性，且可避光操作，減少了間歇操作對番茄 紅素不穩定的影響。3、本發明與傳統溶劑提取法比，溶劑消耗少，處理量大，提取時間短，能耗低，成本 相對較低，易工業化生產。
圖1為實施例中的連續提取系統裝置簡圖，該系統由5個提取單元組成，每個提取 單元包括層析柱、儲液罐、循環泵、控制閥、管道。圖中1管道，2層析柱，3儲液罐，4控制 閥，5循環泵，6總管道(連接各單元)。圖2為連續提取工藝流程示意圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。本發明所述的三孢布拉黴菌發酵菌絲體是採用下列方法製備得到的本發明採用三孢布拉黴菌(Blaleslea trispora) (+)(-)為發酵菌種，經搖瓶一級 種子培養、二級種子發酵培養和發酵罐三級發酵培養得到三孢布拉黴菌發酵液；發酵完成 後採用板框壓濾法去除發酵液中過多的水分，溼菌絲體經95%乙醇攪拌處理2h，再經板框 壓濾乾燥得預處理菌絲體，酒精處理液經精餾塔回收利用。本發明採用的提取過程結合圖1和圖2，提取「過程一」至「過程五」各提取單元溶劑遷移路線、進料和排 渣、加入新鮮溶劑和提取液導出等操作規律(系經過多個過程後建立的)，「過程六」及以後 的四個提取過程為「過程一」至「過程五」的重複。具體操作包括a.造梯度先分別將單元1和5裝入預處理後菌絲體，單元5加入新鮮混合提取 溶劑提取一次階段提取時間t後排出提取液，單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4階段提取時 間的提取，將單元2和4的溶劑互換，最後在單元5加入新鮮混合提取溶劑，使各個單元按照圖2過程一開始提取時所示的濃度梯度排列，即製造好圖2所示濃度梯度；b.排渣裝料每一過程均再提取t1/4後對番茄紅素被提淨的單元5進行排渣，裝 料；c.飽和溶劑遷移將單元1的飽和溶劑轉移入儲液罐中，本過程只涉及溶劑已飽 和的單元(即被提淨單元5的下一單元)；d.不飽和溶劑遷移①3— 1;②5 — 3;③2 — 5;④4 — 2，本過程涉及4個單 元，其遷移遵循規律即按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；e.填充溶劑對單元4填入新鮮混合提取溶劑；f.經過六個操作過程，所有單元又回到起始濃度狀態，實現連續操作。實施例1將三孢布拉黴菌(Blaleslea trispora)原菌株單菌落自斜面接種到500mL搖瓶 中進行搖瓶種子培養，裝液量10%，培養溫度30°C，轉速200r/min，培養30h。將一級搖瓶 種子液接種至2. 5L搖瓶中進行二級種子培養，培養溫度維持在30°C，轉速200r/min，培養 30h。種子培養完畢將其接種到50L發酵罐中進行發酵培養，裝料係數60 %，裝料量30L，培 養溫度維持在30°C，轉速200r/min，通氣量0. 2-0. 5L/min,培養120h。發酵完成後得28L發酵液，採用離心法去除發酵液中過多的水分，得到3kg溼菌 絲體，然後加入3L 95%乙醇混合攪拌2h，再經板框壓濾得到0. 8kg菌絲體，溼菌絲體通過 真空乾燥(真空乾燥溫度在30°C -80°C之間，真空乾燥時間優選4-12小時)和粉碎，得到 預處理後的乾燥菌絲體，乙醇處理液經低壓蒸餾處理可循環使用；預處理菌絲體用正己烷 /丙酮混合溶劑(體積比為1 1-10 1，優選3 1)採用連續提取系統進行逆流提取 (提取過程如前所述)，提取條件為提取溫度30°C，提取溶劑用量10mL/g菌絲體，回流速 度1. 2BV/h,回流2-3次，提取時間2-4h，提取單元組數5組；提取液經真空濃縮得到番茄紅 素濃縮液。實施例2取實施例1所述經預處理的菌絲體10g，置500mL圓底燒瓶中，加入400mL正己 烷/丙酮混合提取溶劑，40°C攪拌提取lh，提取三次，該操作條件下番茄紅素的提取率達 81. 42%o取實施例1所述經預處理的菌絲體50g裝入層析柱中，加500mL正己烷/丙酮混 合溶劑，30°C下以1. 2BV/h的流速逆流循環提取1. 5h，回流三次，該操作條件下番茄紅素的 提取率達88%。實施例3取實施例1所述經預處理的菌絲體250g，等量加入如圖1所示的具有5個提取單 元的連續提取系統的各層析柱中，單元5加入新鮮溶劑一次階段提取1. 5h後排出提取液， 單元2-4分別進行22. 5min、45min、67. 5min的一次階段提取，將單元2和4的溶劑互換，最 後在單元5加入新鮮溶劑，使各個單元按照圖2所示的濃度梯度排列；繼續提取22. 5min後 對已被提淨的單元5進行排渣裝料，將單元1的飽和溶劑轉移至儲液罐中；對不飽和溶劑按 番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；遷移完後對單元4填入新鮮溶劑。各單元提 取條件為溫度30°C，提取單元組5組，每組10mL/g菌絲體的溶劑，以1. 2BV/h的流速逆流 循環提取1. 5h。其他同實施例1，該操作條件下番茄紅素的提取率可達94. 76%。
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各種工藝的提取結果見表1 表1提取工藝比較
攪拌提取 81.423 120 40
單柱提取 884.5 60 30
連續逆流提取 94.761.875 20 30 連續動態逆流提取的番茄紅素提取率最高，分別比攪拌法和單柱法高了 13. 34% 和6. 76%，提取時間比單柱法縮短了三分之一，溶劑用量僅為攪拌法的1/6，提取溫度近乎 常溫，顯示出了連續逆流提取的優越性。
權利要求
1.一種利用混合溶劑連續提取番茄紅素的方法，其特徵在於包含以下步驟a.三孢布拉黴菌發酵菌絲體加入乙醇進行脫水處理，過濾分離菌絲體與乙醇處理液； 對溼菌絲體通過真空乾燥和粉碎，得到乾燥菌絲體；b.經步驟a處理的菌絲體，加入混合溶劑進行固相-液相萃取在連續提取系統的各 提取單元中加入經步驟a處理的菌絲體，採用混合提取溶劑連續循環提取一定時間使各單 元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取乾淨，收集萃取液；c.步驟(b)中萃取液經真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a中乙醇濃度在50%-100%之間，乙 醇與三孢布拉黴菌發酵菌絲體的體積質量比在1 1-10 1，常溫下處理5-180分鐘。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於乙醇處理液經低壓蒸餾處理可循環使用。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a中真空乾燥溫度在30°C-80°C，真空 乾燥時間在1-24小時，優選4-12小時。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟b中固相-液相萃取階段所用的混 合提取溶劑以正己烷為主要溶劑，以丙酮、乙酸乙酯或石油醚為輔助溶劑，主要溶劑與輔 助溶劑的體積比為1 1-10 1，優選正己烷/丙酮混合溶劑，正己烷與丙酮的體積比為 1:1-5: 1，優選 2 1-5 1。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟b中連續提取系統由6-16根層析柱、 儲液罐、循環泵、閥門和管道組成；每一提取單元由2-5根層析柱串聯而成，包括配套儲液 罐、循環泵、閥門和管道；連續提取系統能避光操作。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟b中每個單元按濃度梯度排列按以下 操作實現單元1-5分別加入等量經步驟a處理的菌絲體，單元5加入新鮮混合提取溶劑提 取t(一次階段提取時間)後排出提取液，單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4(即為1/4、2/4、 3/4階段提取時間)的提取，將單元2和4的溶劑互換，最後在單元5加入新鮮混合提取溶 劑，使各個單元按照圖2過程一開始提取時所示的濃度梯度排列，即製造好濃度梯度。
8.根據權利7所述的方法，其特徵在於連續提取系統每一過程均提取t1/4後對番茄紅 素被提淨的單元5進行排渣裝料，對不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一 單元；經過六個操作過程，所有單元又回到起始濃度狀態，實現連續操作，如圖2所示。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於連續提取的方式為逆流提取；提取溫度在 於20-60°C，優選30-50°C ；提取溶劑用量在於5_40mL/g菌絲體，優選5_20mL/g菌絲體；回 流速度為0. 6-3. 6BV/h (BV為床體積)，優選0. 6-1. 8BV/h ；回流次數在於3-6次，優選2-3 次；提取時間為2-他，優選於2-4h ；提取單元組數為3-6組，優選5-6組。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於各提取單元中加入等量經步驟a處理的菌 絲體。
全文摘要
本發明屬於生物分離領域，公開了一種連續提取番茄紅素的方法。該方法將三孢布拉黴菌發酵菌絲體加入乙醇進行脫水處理，過濾分離菌絲體與乙醇處理液；對溼菌絲體通過真空乾燥和粉碎，得到乾燥菌絲體；將所得乾燥菌絲體加入混合溶劑進行固相-液相萃取在連續提取系統的各提取單元中加入菌絲體，採用混合提取溶劑連續循環提取一定時間使各單元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取乾淨，收集萃取液；萃取液經真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。該方法採用混合溶劑提取番茄紅素，充分發揮各溶劑對番茄紅素的溶解作用，操作具有連續性且可避光操作，溶劑消耗少，處理量大，提取時間短，能耗低，成本相對較低，易工業化生產。
文檔編號C07C7/10GK102140052SQ20101061557
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者萬紅貴, 盧定強, 吳啟賜 申請人:南京工業大學