一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法

2023-06-23 05:16:51

專利名稱：一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，可用於藥物的篩選。
背景技術：
乙型腦炎病毒不僅引起人的中樞神經系統疾病，還可引起豬的繁殖障礙性疾病，是一種重要的人畜共患傳染病病原。乙型腦炎病毒主要侵入神經系統，包括丘腦，基底神經節，腦幹，小腦，大腦皮層和脊髓，導致嚴重的中樞神經系統疾病，例如脊髓灰質炎樣嚴重癱瘓，無菌性腦膜炎和腦炎，71%的患者都是基底神經節和丘腦損傷，嚴重出現運動障礙，43%患者腦幹損傷，經常出現急性呼吸衰竭症狀，甚至死亡。患者的病死率與臨床症狀高達 10% 50%，而且大約一半乙型腦炎病毒感染倖存者都有嚴重的神經後遺症。在亞洲每年大約50，000乙腦病例中就有15，000例死亡。2006年7月山西發生日本乙型腦炎流行，共60多人發病，其中19人死亡，造成了較大的社會影響。目前已研製出乙型腦炎病毒的弱毒疫苗和滅活疫苗，具有較好的免疫效果，但仍有免疫失敗的報導。同時，日本乙型腦炎發病後在腦中複製，給病人造成不可逆的智力損傷，如果能使用藥物對該病起到一定的早期預防和治療效果，則對於該病的治療手段的研究具有重大意義。而目前仍未有關於乙型腦炎病毒藥物及其篩選方法的報導。乙型腦炎病毒病毒NS3的C端440個胺基酸為解旋酶和NTP酶，它可以利用水解ATP釋放的能量，將病毒在複製過程中形成的RNA雙鏈解旋。解旋酶是乙型腦炎病毒的複製所必需，該酶失去活性後病毒增殖停止，因此成為良好的抗病毒靶標。根據解旋酶的酶活性特徵，具有多種靶向藥物篩選與設計的策略，如a.阻止ATP的結合；b.阻止RNA底物的結合；c.阻止解旋酶的空間變構。Borowski P等(2002)合成了一種環擴大核苷(ring-expanded nucleoside),對於西尼羅病毒解旋酶具有一定的抑制活性(IC50=25-30uM)。Kaczor A等(2010)根據日本乙型腦炎病毒的解旋酶結構，建立了一個基於酶結構的藥效團模型，用該模型對116萬個化合物進行了虛擬篩選，發現了 15個化合物具有較好的結合活性，並且預測了其可以通過血腦屏障，但未進行酶抑制活性的試驗研究。但是，到目前為止針對乙型腦炎病毒解旋酶的藥物設計模型仍然沒有建立，也未見針對乙型腦炎病毒解旋酶的藥物報導。本發明建立了一種針對乙型腦炎病毒解旋酶的藥物篩選模型，應用該模型可在蛋白水平進行高通量、低成本的進行乙型腦炎抗病毒藥物篩選，為乙型腦炎病毒的藥物發現提供了一種手段。

發明內容
本發明的目的是提供了一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，方法簡單，易於操作。解旋酶是乙型腦炎病毒基因組編碼的一種功能蛋白，該蛋白負責將病毒複製過程中形成的基因組RNA雙鏈解旋，解旋後的正鏈RNA參與子代病毒的包裝過程，如果抑制解旋酶的活性，乙型腦炎病毒的增殖也將受到抑制。本發明是基於解旋酶活性的機制，採用螢光共振能量轉移的方法，在兩條底物DNA的兩端分別標記螢光和淬滅基團，當兩條底物形成雙鏈後，螢光基團的能量被淬滅基團吸收，因此體系中不發出螢光。當解旋酶將雙鏈解開後，兩個基團在空間上距離變大，螢光基團則發出螢光，螢光強度越高則說明酶活性越高。基於該酶活性的評價體系，進一步建立了抑制劑篩選方法，並進行了初步應用。
為了達到上述目的，本發明採取如下技術措施
一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，其製備步驟如下
(I)解旋酶蛋白的表達與純化人工合成乙型腦炎病毒NS3基因(Genbank登錄號U47032)，用Nco I和Xho I分別酶切解旋酶片段與大腸桿菌原核表達載體pET30a， T4 DNALigase (TakaRa,大連寶生物工程有限公司)16 °C過夜連接，得到重組質粒 pET30a_helicase,構建好的重組質粒pET30a_helicase轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)plysS 中進行表達，得到一種解旋酶蛋白，其序列為SEQ ID NO.1所示。收集表達蛋白上清用Ni2+ 親和純化，純化的解旋酶蛋白經SDS-PAGE及Western blot鑑定後加甘油至終濃度20%(v/ V)，用BCA法測定濃度，_80°C凍存備用。
用大腸桿菌大量表達解旋酶蛋白，在表達蛋白上帶有6 X His標籤，收集表達蛋白的上清，用Ni2+親和層析法純化解旋酶蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。
(2)解旋酶DNA底物的設計人工合成3條DNA鏈，分別命名為F、Q、C，序列分別為
F: (Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT ；
Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)；
C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC。
其中F和Q、C和Q互補，F帶有一段polyT的末端突出，以利於解旋酶的結合併起始反應。
(3)在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待篩化合物以及反應緩衝液 (溶解蛋白的緩衝液，即20mM的Tris-base，150mM的Nacl，5%的甘油)，混合孵育5分鐘後， 加入F鏈200nM與Q鏈240nM，再孵育5分鐘，加入C鏈2. 4uM、15mM Mg2VlOmM的Mn2+和ATP 2mM，置37°C反應90分鐘後，在螢光檢測儀(TECAN infinite F200多功能酶標儀)中檢測體系中的螢光強度。同時設置不加入待篩化合物的對照組(C組)以及不加入底物的對照組 (Cl 組)。
(4)計算化合物抑制率抑制率=1-(實驗組螢光平均值-Cl組螢光平均值)+ (C 組螢光平均值-Cl組螢光平均值)。選擇抑制率最高的化合物進行抗病毒的研究。
發明人對40種化合物進行了蛋白水平上的篩選，共初步篩得四種能夠抑制解旋酶活性的化合物。其分別為
2-[4-(氨基磺醯基)苯胺基]-4-{4-硝基苯基}-N-苯基_1，3_噻唑_5_甲醯胺；
4-( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)-N_ [6_(甲基磺醯基)_1，3_苯並噻唑_2_基] 苯甲醯胺；
3- [5-( {3- [2-( 4-乙氧基)_甲基_2_氧代乙基]_2，4_ 二氧代_1，3_噻唑烷_5_亞基}甲基)-2_呋喃基]苯甲酸；N-[6- ({[ (2-噻吩基羰基)氨基]硫代甲醯基}氨基)-1, 3-苯並噻唑_2_基]丁醯胺；對解旋活性的抑制率分別為30. 52%、56. 29%、39. 83%、55. 63%。與現有技術相比，本發明具有以下優點1.傳統解旋酶的檢測，主要採用放射性同位素標記，該技術需要放射性防護，產生很多放射性廢物，對實驗室要求比較高。而且，標記的探針只能使用兩周左右，因此該技術已漸漸被淘汰。本發明純化出的可溶性的活性高的解旋酶蛋白，並在蛋白水平上利用螢光共振能量轉移的方法，對最佳酶濃度、最佳底物濃度、最佳二價金屬離子濃度、最佳捕獲鏈濃度、最佳ATP濃度、最佳反應反應溫度進行了試驗，確定了酶活檢測的最佳反應體系，該方法簡單易行，在普通實驗條件即可進行，靈敏度高，成本相對較低，所需樣品少，而且可以 對解旋酶反應的過程進行監測。2.本發明中建立的解旋酶抑制劑篩選方法，在細胞外進行，不受細胞狀態及細胞中雜蛋白的影響，反應穩定、重複性好，避免了化合物或DMSO對細胞的毒性而造成的試驗誤差。3.本發明中建立的解旋酶抑制劑篩選方法，使用的解旋酶蛋白為原核表達的可溶性蛋白，使用的底物為合成的短DNA鏈，篩選的成本非常低廉，同時該篩選體系可在96孔板甚至384孔板中進行微量操作，進一步降低了篩選的成本，可輕易完成高通量的操作。


圖1為一種純化的解旋酶蛋白SDS-PAGE效果示意圖經Ni2+親和純化後，得到了較高純度的蛋白圖2為一種酶蛋白解旋反應曲線示意中說明反應體系在解旋酶蛋白存時,解旋反應在90min仍保持增長的趨勢,反應速度基本保持不變圖3為一種不同濃度下解旋酶的解旋活性示意中說明解旋酶蛋白濃度在3uM時檢測到的螢光值最高，反應速率最快。圖4為一種不同底物濃度下解旋酶的反應曲線示意中說明在螢光底物濃度在200nM，淬滅底物濃度在240nM時解旋反應速率最快。圖5為一種反應體系中不同濃度的Mg2+及Mn2+下反應速度示意中說明在15mM的Mg2+或IOmM的Mn2+時解旋酶活性最好，而且相同濃度的離子存在下，Mn2+比Mg2+對解旋酶活性的促進作用更明顯。圖6為一種反應體系中不同濃度的ATP存在時檢測到的螢光值示意中說明在ATP濃度達到2mM時解旋反應速率最快，2mM以後隨著ATP濃度的升高，解旋反應速率反而降低。圖7為一種反應體系在不同溫度下檢測到的螢光值示意中說明在37°C的溫度下，解旋酶活性最好，解旋反應速率最快。圖8為一種反應體系中不同濃度捕獲鏈存在時檢測到的突光值不意中說明捕獲鏈在1. 2uM時反應已達到平衡，為保證反應的充分進行，以後的實驗中均使用2. 4uM的濃度。圖9為一種解旋酶抑制劑篩選的初步應用示意圖應用本發明建立的解旋酶抑制劑篩選體系，對40種化合物進行了初步篩選，並得到了 4種具有酶抑制活性的化合物。
具體實施例方式本發明中的實驗方法如未特別說明，均為常規實驗方法。實施例1:一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型檢測條件優化( I)解旋酶蛋白的製備
人工合成乙型腦炎病毒NS3基因(Genbank登錄號U47032)，用Nco I和Xho I分別酶切解旋酶片段與大腸桿菌原核表達載體pET30a，T4 DNA Ligase (TakaRa,大連寶生物工程有限公司)16 °C過夜連接，得到重組質粒pET30a_heI icase，構建好的重組質粒pET30a-helicase轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) PlysS中進行表達。收集表達蛋白上清用Ni2+親和純化，純化的解旋酶蛋白經SDS-PAGE及Western blot鑑定後加甘油至終濃度20%(v/v)，用BCA法測定濃度，_80°C凍存備用。(2)底物的設計、合成與製備人工合成3條DNA鏈，分別為 F:(Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTTQ:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)C (捕獲鏈)TAGTACCGCCACCCTCAGAACC。在使用時將帶有螢光基團Cy5的DNA底物F與帶有淬滅基團BHQ-2的DNA底物Q按照1:1. 2 (摩爾比)比例進行混合，室溫放置lOmin，以保證兩條鏈退火完全。(3)Ni2+親和層析純化的解旋酶蛋白經SDS-PAGE及Western blot鑑定大小正確且純度較高(圖1)。(4)解旋反應在酶蛋白存在下的時間依賴性反應過程設置加入解旋酶實驗組和無蛋白的對照組，並依次加入200nM的F鏈、240nM的Q鏈、3. 6uM的捕獲鏈(C鏈)、IOmM的Mn2+，加入2mM ATP起始反應，37°C下檢測螢光值，每隔5min檢測一次。37°C檢測120min，實驗結果顯示，螢光值在此時間段內仍呈增長趨勢(圖2)。(5)解旋酶反應最佳蛋白和底物濃度的研究最佳蛋白濃度研究BCA法檢測蛋白濃度後，使50uL體系中分別含有0、50、200、500、800、1200、2000、3000nM, 8個不同濃度的蛋白，每個濃度做三個平行。並依次加入200nM的F鏈，240nM的Q鏈，3. 6uM的C鏈，IOmM Mn2+，然後加入2mM ATP起始反應，37°C溫箱放置90min後，檢測螢光值。實驗結果顯示，在蛋白濃度達到3uM時，檢測到的螢光值最高，反應速率最快，故確定最佳蛋白濃度為3uM (圖3)。底物濃度的研究501^體系中分別含有0、20、50、100、200、2501^，6個不同濃度的螢光底物F，每個濃度作三個平行。蛋白濃度為3uM，C鏈濃度為3. 6uM，加入2mM ATP起始反應，IOmM Mn2+，37°C溫箱放置90min後，檢測螢光值。實驗結果顯示200nM時反應速率曲線漸趨於平緩，故最終確定最佳螢光底物(F鏈)濃度200nM，則淬滅底物(Q鏈)濃度240nM(圖 4)。
(6)解旋酶反應最佳Mg2+或者Mn2+濃度的研究
本次研究共做兩組，一組含有Mg2+，另一組含有Mn2+。50uL體系中Mg2+ (或Mn2+) 濃度分別為0，2. 5，5，7. 5，10，15，20，25，每個濃度作三個平行。體系中蛋白濃度為3uM， 200nM的F鏈，240nM的Q鏈，3. 6uM的C鏈，加入2mM ATP起始反應，37°C溫箱放置90min 後，檢測突光值。最終確定最佳Mg2+濃度為15mM,最佳Mn2+濃度為IOmM,而且相同濃度下， Mn2+比Mg2+對解旋酶的活性促進作用更明顯，在以後的實施例中，若無特別說明，二價金屬離子均使用IOmM的Mn2+ (圖5)。
(6)解旋酶反應最佳ATP濃度的研究
50uL 體系中 ATP 濃度分別為0. 5、1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,15. 0、20mM，每個濃度作三個平行。並依次加入3uM的蛋白，200nM的F鏈，240nM的Q鏈，3. 6uM的C鏈，IOmM的Mn2+， 加入不同濃度的ATP起始反應，37°C溫箱放置90min後，檢測螢光值。結果顯示，在ATP濃度達到2mM時，檢測到的螢光值最高，在2mM以後，隨著ATP濃度的升高螢光值反而降低，故確定了 ATP的最佳濃度為2mM (圖6)。
(7)解旋酶反應最佳溫度的研究
50uL反應體系中，3uM的解旋酶蛋白，200nM的F鏈，240nM的Q鏈，3600nM的C鏈， IOmM Mn2+，2mM的ATP。將上述反應體系分別置於55°C、37°C、27°C、16°C、4°C，同時每個溫度設置不加解旋酶蛋白的對照組，每個組作三個平行。90min後檢測螢光值，實驗結果顯示在 55°C時蛋白出現沉澱，而且不加蛋白的對照組由於溫度過高雙鏈變性，檢測到很高的螢光值。其餘相同的體系在37°C條件下螢光值最高，故確定了解 旋反應的最佳反應溫度為37°C (圖 7)。
(8)解旋酶反應最佳捕獲鏈濃度的研究
以Q鏈240nM為標準，50uL體系中C鏈濃度分別為其0、2、5、10、15、20倍，每個濃度作三個平行，加入2mM ATP起始反應，37°C 90min後檢測螢光值。結果表明，捕獲鏈並不是解旋反應起始所必需的，但是其存在能促進解旋反應進行的程度。為了最大程度的促進解旋反應進行的程度，最終確定了捕獲鏈的最佳反應濃度為Q鏈的10倍，即2. 4uM (圖8)。
確定了 50uL的反應體系3uM的解旋酶蛋白，200nM的F鏈，240nM的Q鏈，2. 4uM 的 C 鏈，IOmM Mn2+/15mM Mg2+，2mM 的 ATP，pH 8. O, 37°C 的最佳反應體系。
實施例2 :—種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的應用，其步驟如下
(I)在黑色96孔或384孔板中分別加入實施例1中製得的解旋酶蛋白3uM、待篩化合物以及反應緩衝液(溶解蛋白的緩衝液，即20mM的Tris-base，150mM的Nacl，5%的甘油)，混合孵育5分鐘後，加入F鏈200nM與Q鏈240nM，再孵育5分鐘，加入C鏈2. 4uM和 ATP 2mM，置37°C反應90分鐘，加入反應終止液，在螢光檢測儀中檢測體系中的螢光強度。 同時設置不加入待篩化合物的對照組(C組)以及不加入底物的對照組(Cl組)。
(2)計算化合物抑制率抑制率=1-(實驗組螢光平均值-Cl組螢光平均值)+ (C 組螢光平均值-Cl組螢光平均值)。
對40 (1-40)種化合物進行了蛋白水平上的篩選，這40種化合物分別為
1:2_[4-(氨基磺醯基)苯胺基]-4-{4-硝基苯基}N_苯基_1，3_噻唑_5_甲醯胺；2_[4_(aminosulfonyl)anilino]~4~{4-nitrophenyl}-N-phenyl-1, 3-thiazole-5_carboxamide2 1- (3-羧基丙醯基)-5- (1，3-二苯基-1H-吡唑-4-基)-3- (4_甲氧基苯基)_4，5- 二氫-1H-批唑；1-(3-carboxypropanoyl) -5-(1, 3-diphenyl-lH-pyrazol-4-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-4, 5-dihydro-lH-pyrazole ；3 2-( {5-[(1，3-苯並噻唑-2-基磺醯基)甲基]-4-苯基-4H-1，2，4-三唑-3-基}橫酉先基)_N_ (2-呋喃基甲基)乙酉先胺；2~ ({5-[ (I, 3-benzothiazol-2-y lsulf any I) methyl]-4-phenyl-4H-l, 2，4-triazol-3-yl}sulfanyl)-N- (2-furylmethyl)acetamide;4 N-{l-[(苄基硫基)甲基]-2_[2- (2_羥基亞苄基)肼基]_2_氧代乙基}_4_硝基苯甲酉先胺；N-{l-[ (benzylsulfanyl)m ethyl]-2-[2-(2-hydroxybenzylidene)hydrazino]-2-oxoethyl}-4-nitrobenzamide;5:N』-{2- (二異丁胺)-5-硝基亞苄基}-2- (4-甲氧基苯胺)乙醯肼；N』-{2_(diisobutylamino) -5-nitrobenzylidene}~2~(4-methoxyaniIino)acetohydrazide;6 :6-[2-(l，3-苯並間二氧雜環戊烯-5-基)-4-羥基-3-4-甲基苯甲醯基)_5_氧代-2-4, 5- 二氫-1H-批略-1-基]己酸；6_[2_(1，3-benzodioxol-5-yl) -4-hydroxy-3-(4-methylbenzoyl)-5-oxo-2, 5-dihydro-lH-pyrrol-l-yIJhexanoic acid ；7 2, 7_ 雙-(4-嗎琳基)_1，8_ 二苯基-1，8_ 辛二麗；2，7-bis (4-morpholinylmethyl)-1,8-diphenyl-l, 8-octanedione ；8 4-{[7- (3，4-二羧基苯氧基)-2-萘基]氧基}鄰苯二甲酸；4_{[7_(3，4-dicarboxyphenoxy)-2-naphthyl]oxy}phthalic acid;9 N- (4-{[ (4-甲基-2-嘧啶基)氨基]磺醯基}苯基)[1，I』 -聯苯]-4-甲酉先胺；N-(4_ {[ (4-methyl_2-pyrimidinyl)amino]sulfonyl}phenyl)[1， Γ -biphenyl]-4-carboxamide10 :4-{[3-(4-溴苯基)-3-氧代-1-丙烯基]氨基}_N_(3-甲氧_2_吡嗪基)苯磺酉先胺；4_ {[3- (4-bromophenyl) -3-oxo-l-propenyl] amino} -N- (3-methoxy-2-pyrazinyl)benzenesulfonamide;11 :N I'N』 6 雙(IH-苯並咪唑-2-甲基)己烷二醯肼；N』 I'N』 6 -bis (lH_benzimidazol-2-ylmethylene)hexanedihydrazide;12:4-苯甲醯基-N- (4-{[ (4_甲基嘧啶_2_基)氨基]磺醯基}苯基)苯甲醯胺；4-benzoyl-N- (4_{[(4-methylpyrimidin-2-yl)amino]sulfonyl}phenyl) benzamide ；13 2-{5-[ (5-{4-硝基苯基}-2-呋喃基)亞甲基]-4-氧代_2_硫代-1，3_噻唑焼-3-基}己二酸；2~ {5- [ (5- {4-nitrophenyl} -2-furyl) methylene] -4-oxo-2-thioxo-l，3-thiazolidin-3-yl}hexanedioic acid;142-[(4-甲氧基苯甲醯基)氨基]-N-{3-[2-(4-甲氧基苯甲醯基)肼基]_3_氧代丙基}苯甲酉先 1 ；2-[(4-methoxybenzoyl)amino]-N-{3-[2-(4-methoxybenzoyl)hydrazino]-3-oxopropyl}benzamide;15 :N-[4-(氨基磺醯基)苯基]-2-[(4，5-二苯基-1，3-惡唑-2-基)硫基]乙醯胺；N-[4- (aminosulfonyl)phenyl]-2-[(4，5-diphenyl-l，3-oxazol-2-yl) thio]acetamide;16 2-[ (4-乙基-5-苯基-4H-1，2，4-三唑-3-基)硫基]-N-{4-[ (2_ 吡啶基氨基)橫酸基]苯基}乙酉先胺;2_[ (4-ethyl-5-phenyl-4H_l，2，4-triazol_3-yl) sulfanyl]-N- {4-[ (2-pyridinylamino)sulfonyl]phenyl}acetamide;
17 :3-(4-氟苯基)-N-{4-[(2-喹喔啉基氨基)磺醯基]苯基}_丙烯醯胺；3_(4_f IuorophenyI) -N-{4_[(2-quinoxalinylamino)sulfonyl]phenyl}aerylamide ；
18 2, 4- 二氯-N-{4-[ (2_喹喔啉基氨基)磺醯基]苯基}苯甲醯胺；2，4-dichl oro-N-{4-[(2-quinoxalinylamino)sulfonyl]phenyl}benzamide;
19:N』-[ (1，3-苯並噻唑-2-基硫基)乙醯基]-2-[ (6_乙氧基-1，3_苯並噻唑-2-基)硫基]乙酉先月井;N，-[(1，3-benzothiazol-2-ylsulfanyl) acetyl] -2- [ (6-ethoxy -1，3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetohydrazide;
20 2- (3，4-二甲氧基苯基)-N- (6_{[ (3，4_ 二甲氧基苯基)乙醯基]氨基} -2-卩比 P定基)乙酉先胺；2~ (3, 4-dimethoxyphenyl) N- (6- {[ (3, 4-dimethoxyphenyl) acetyl]amino}-2-pyridinyl)acetamide;
21 3-[ (2-氯苯氧基)甲基]-N-{4_[ (2_嘧啶基氨基)磺醯基]苯基}苯甲酉先胺；3-[(2-chlorophenoxy)methyl]-N-{4_[(2-pyrimidinylamino)sulfonyl]phenyl} benzamide;
22 4- ( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)N_[6_ (甲基磺醯基)_1，3_苯並噻唑-2-基]苯甲酉先胺;4_ ({4-nitro-lH-pyrazol-l-yI jmethyl) -N-[6- (methylsulfonyl)-1，3-benzothiazol-2-yIJbenzamide;
23 3- (1，3-苯並間二氧雜環戊烯-5-基)-N- (4_{[ (2，6_ 二甲基_4_嘧啶基) 氨基]磺醯基}苯基) 丙烯醯胺；3-(1，3-benzodioxol_5-yl)N-(4-{[(2，6-dimethyl_4-py rimidinyl)amino]sulfonyl}phenyl)acrylamide;
24 :乙基4_ ( {3_{3_硝基苯基}_2_[ (4_甲氧基苯甲酉先基)氛基]丙酉先基}氛基) 苯甲酸甲酯；ethyl 4- ({3- {3-nitrophenyl} ~2~[ (4-methoxybenzoyl) amino] acryloyl} amino)benzoate;
25 6- ( {2-[ (3_溴苯甲醯基)氨基]_3_苯基丙烯醯基}氨基)己酸； 6-({2-[ (3-bromobenzoyl)amino]-3-phenylacryloyl}amino)hexanoic acid;
26 2~ {[3-氛基-6_ (3，4-—甲氧基苯基)卩比卩定~2~基]硫基}-N-[5_ (丙基硫基)-1，3，4-噻二 唑-2-基]乙酸胺；2-{[3-cyano_6-(3，4-dimethoxyphenyl) pyridin-2-yl] sulfanyl} N-[5_(propylsulfanyl)_1，3，4-thiadiazol-2-yl]acetamide;
27 :4-[( {[(4-甲氧基苯基)乙醯基]氨基}硫代甲醯基)氨基]_N_(2_苯乙基)苯磺酉先胺；4_[ ({[ (4-methoxyphenyl) acetyl] amino} carbothioyl) amino] -N- (2-phenylethyl) benzenesulfonamide;
28 N-{4-[ (6-氯-3-吡啶基)甲氧基]_3_甲氧基苄基}-N_{2_[ (7_氯_4_喹啉基)氨基]乙基}胺；N- {4- [ (6-chloro-3-pyridinyl) methoxy] -3-methoxybenzyl} -N- { 2-[(7-chloro-4-quinolinyl)amino]ethyl}amine;
29 4-[5- ({[2- (3，4_ 二甲氧基苯基)乙基]氨基}甲基)_2_呋喃基]苯甲酸； 4-[5-({[2-(3，4-dimethoxyphenyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyIJbenzoic acid;
30 3-[5- ({3-[2- (4_ 乙氧基)-甲基 _2_ 氧代乙基]-2，4_ 二氧代-1，3_ 噻唑焼-5-亞基}甲基)-2-呋喃基]苯甲酸；3-[5-({3-[2-(4-ethoxyaniIino)-2-oxoethyl] -2，4-dioxo-l, 3-thiazolidin-5-ylidene}methyl)-2-furyIJbenzoic acid ；
31 :3-( {5-[5-溴-2-(羧基甲氧基)亞苄基]-3-甲基-4-氧代-1,3-噻唑烷-2-亞基}氨基)苯甲酸；3-({5-[5-bromo-2-(carboxymethoxy)benzylidene]-3-methyl-4-oxo-1,3-thiazolidin-2-ylidene}amino)benzoic acid ；32 :乙基[2- ( {[ (5-甲基-5H-[1, 2，4]均三嗪並[5，6_B]吲哚 _3_ 基)硫基]乙醯基}氨基)-1，3_ 噻唑-4-基]乙酸甲酯；ethyl[2-({[(5-methyl-5H-[l，2，4]triazino[5, 6_b]indol-3-yl)sulfanyl]acetyl}amino)-1, 3-thiazol-4-yl]acetate;33 N-[3- (5-{[2- (4_ 甲氧基)_2_ 氧代乙基]硫基}_4_ 甲基-4H-1，2，4_ 三唑-3-基)苯基]-2-甲基苯甲酸；N-[3- (5- {[2- (4-methoxyani I ino) -2-oxoethyl] sulfanyI}-4-methy1-4H-1, 2, 4-triazol-3-yl)phenyl]-2-methylbenzamide; 34:2-(4-{2_[3-氰基-4-(甲氧基甲基)-6-甲基_2_吡啶基]糖基}_2_甲氧基苯氧基)-N_(3,4_ 二甲基苯基)乙酸胺；2_ (4- {2-[3-cyano_4- (methoxymethyl) -6-methyl-
2-pyridyl]carbohydrazone}-2-methoxyphenoxy)-N-(3,4-dimethylphenyI)acetamide ；35 :3-{[2-氯-5-(苯磺醯基)苯甲醯基]氨基}苯甲酸；
3-{[2-chloro_5-(phenylsulfonyl)benzoyl]amino}benzoicacid;36 N-[6- ( {[ (2-噻吩基羰基)氨基]硫代甲醯基}氨基)_1，3_苯並噻唑-2-基]丁酸胺；N-[6-({[ (2-thienylcarbonyl) amino] carbothioyl}amino)-1, 3-benzothiazol-2-yl]butanamide;37 :3-(稀丙氧基)_4，5，6-二 (節氧基)-1，2-環己_-醇；3-(allyloxy)-4，5，6-tris (benzyloxy)-1, 2-cyclohexanediol;38 :N-(，3，4-二氯苯基)-4-( {[(3-甲氧基苯基)磺醯基]氨基}甲基)苯甲醯胺；N-(3, 4-dichlorophenyl)~4~({[(3-methoxyphenyl)sulfonyl]amino}methyl)benzamide;39 :2-甲基-N-{3-[4-甲基-5- ( {2_[ (4_甲基苄基)氨基]_2_氧代乙基}硫基)-4H-1，2，4-三唑-3-基基]苯基}苯甲醯胺；2-methyl-N- {3- [4-methyl_5- ({2-[(4-methylbenzyI)amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)-4H-1, 2, 4-triazol-3-yl]phenyl}benzamide;40:伊維菌素。確定了四種能夠抑制解旋酶活性的化合物(圖9)。其分別為I 2-[4-(氨基磺醯基)苯胺基]-4-{4-硝基苯基}N-苯基-1,3-噻唑-5-甲醯22:4- ( {4-硝基-1H-吡唑-1-基}甲基)N-[6-(甲基磺醯基)-1，3_苯並噻唑-2-基]苯甲醯胺；30 3-[5- ( {3-[2- (4_ 乙氧基)-甲基 _2_ 氧代乙基]_2，4_ 二氧代-1，3_ 噻唑烷-5-亞基}甲基)-2-呋喃基]苯甲酸；36 N-[6-( {[(2-噻吩基羰基)氨基]硫代甲醯基}氨基)_1，3_苯並噻唑_2_基]丁醯胺；對解旋活性的抑制率分別為30. 52%,56. 29%,39. 83%,55. 63%。
權利要求
1. 一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，其製備步驟如下 (1)解旋酶蛋白的表達與純化人工合成乙型腦炎病毒NS3基因，用NcoI和Xho I分別酶切解旋酶片段與大腸桿菌原核表達載體pET30a，T4 DNA Ligase 16°C過夜連接，得到重組質粒pET30a_helicase,構建好的重組質粒pET30a_helicase轉化到大腸桿菌BL21(DE3)plysS中進行表達，得到一種解旋酶蛋白，其序列為SEQ ID NO.1所示，收集表達蛋白上清用Ni2+親和純化，純化的解旋酶蛋白經SDS-PAGE及Western blot鑑定後加甘油至終濃度20% v/v，用BCA法測定濃度，_80°C凍存備用；用大腸桿菌大量表達解旋酶蛋白，在表達蛋白上帶有6XHis標籤，收集表達蛋白的上清，用Ni2+親和層析法純化解旋酶蛋白，用BCA法測定蛋白濃度； (2)解旋酶DNA底物的設計人工合成3條DNA鏈，分別命名為F、Q、C，序列分別為F: (Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT ；Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)；C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC ； (3)在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待篩化合物以及反應緩衝液，混合孵育5分鐘後，加入F鏈200nM與Q鏈240nM，再孵育5分鐘，加入C鏈2. 4uM、15mM Mg2VlOmM的Mn2+和ATP 2mM，置37°C反應90分鐘後，在螢光檢測儀中檢測體系中的螢光強度，同時設置不加入待篩化合物的對照組以及不加入底物的對照組； (4)計算化合物抑制率抑制率=1-(實驗組螢光平均值-Cl組螢光平均值)+(C組螢光平均值-Cl組螢光平均值)，選擇抑制率最高的化合物進行抗病毒的研究。
全文摘要
本發明公開了一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，步驟1、解旋酶蛋白的表達與純化人工合成乙型腦炎病毒NS3基因，用NcoI和XhoI分別酶切解旋酶片段與大腸桿菌原核表達載體過夜連接，得一種解旋酶蛋白，其序列為SEQIDNO.1所示，收集表達蛋白的上清，用Ni2+親和層析法純化解旋酶蛋白，用BCA法測定蛋白濃度；2、解旋酶DNA底物的設計；3、在黑色96孔中加入解旋酶蛋白3uM、待篩化合物以及反應緩衝液，混合孵育，在螢光檢測儀中檢測體系中的螢光強度，不加入底物的對照組；4、計算化合物抑制率。方法簡單易行，靈敏度高，成本低，樣品少，對解旋酶反應的過程進行監測，對今後的乙型腦炎病毒藥物的開發具有極大意義。
文檔編號G01N21/64GK102994611SQ201210497118
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者宋雲峰, 方金娥, 曹勝波, 陳煥春 申請人:華中農業大學