一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法與流程

2023-06-23 07:46:42 2

本發明屬於物種鑑定及中藥材真偽鑑別技術領域。更具體地，涉及一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法。

背景技術：

白僵蠶(bombyxmori)，蠶蛾科昆蟲家蠶(bombyxmorilinnaeus)4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌beauveriabassiana(bals.)vuillant而致死的乾燥體(國家藥典委員會，2015)。白僵蠶中的白僵菌是一類寄生於昆蟲的病原真菌，據ncbi最新數據報導，將白僵菌歸類於：雙核亞界(dikarya)、子囊菌門(ascomycota)、盤菌亞門(pezizomycotina)、糞殼菌綱(sordariomycetes)、肉座菌亞綱(hypocreonycetidae)、肉座菌目(hypocreales)、蟲草菌科(cordycipitaceae)、蟲草屬(cordceps)。

白僵蠶作為我國傳統的中藥材，具有降血糖、降血脂、抗癌、抗驚厥、抗凝、抑菌、鎮靜催眠、美白等多種藥理作用，從而使得其在臨床治療上具有重要的作用。目前農戶養殖僵蠶所帶來的收益是很可觀的，可以作為農民致富的好途徑(張偉基，2016)。然而，由於僵蠶具有重要的藥理作用和良好的經濟效益，使得一些商家為了獲得更多利益，開始用假冒和不合格僵蠶充當合格僵蠶。目前傳統的偽品僵蠶大多為用石灰水將死家蠶摻白加工而成(趙啟有，1998)，也有將地蠶冒充正品僵蠶使用(胡大澤等，2003)，近年來，出現了新的偽品黑死蠶和空心僵蠶。由於偽品僵蠶的外觀、顯微等均與正品相似，難以應用常規方法進行有效鑑別，為了杜絕該類現象的出現，其真偽鑑別在白僵蠶質量評定工作上顯得尤為重要。

目前現行的僵蠶質量鑑定方法主要包括兩種，一是物理鑑定方法，包括外觀鑑別和顯微觀察(徐國均等，1996；國家藥典委員會，2015)、微量升華法(黃曉雪，2005)、sds-page(邱乙，2014)、灰色關聯度分析法(李峰，2011)、紫外指紋圖譜(冀憲領，2006)、紅外指紋圖譜(冀憲領，2007)、高效液相色譜法(王更先，2006)等方法對僵蠶藥材質量進行鑑定；二是分子鑑定方法，主要是賈靜(2016)等基於coi序列和its序列分別對僵蠶藥材的基原物種家蠶和白僵菌進行鑑定，從而對白僵蠶的質量及品質進行鑑定。其中，分子鑑定具有更準確、操作簡便等特點，應用前景更好。

目前對僵蠶中白僵菌真偽鑑定方面，一直缺少特異驗證白僵菌的引物，缺乏一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是克服現有僵蠶真偽鑑定技術的缺陷和不足，完成對廣東株白僵菌線粒體全基因組序列的高通量測序，比較白僵菌線粒體基因序列在地理種屬上的差異，發現白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯；並基於白僵菌線粒體rps3基因序列設計引物，尋找特異擴增真菌白僵菌的引物，提供一種特異鑑定白僵菌的分子標記方法，從而快速鑑別僵蠶中白僵菌的真偽，為中藥材僵蠶臨床用藥安全工作上提供分子技術支持。

本發明的目的是提供白僵菌的核糖體蛋白基因rps3序列。

本發明另一目的是提供一組鑑定驗證僵蠶中白僵菌真偽的引物組。

本發明再一目的是提供一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法。

本發明的再一目的是提供一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的試劑盒。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

本發明人在完成對廣東株白僵菌線粒體全基因組測序和13個蟲草科物種的線粒體全基因組生物信息學比較分析的基礎上，發現白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯，並基於廣東株白僵菌線粒體的rps3基因序列設計篩選得到了1對能特異檢測白僵菌的引物。

一組鑑定驗證僵蠶中白僵菌真偽的引物組，為引物對f935和r1385，序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示。

所述引物組在鑑定驗證僵蠶中白僵菌真偽中的應用，在構建快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法中的應用，以及在製備快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的試劑盒中的應用，均應在本發明的保護範圍之內。

一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法，以待測中藥材白僵蠶總dna為模板，利用引物組f935/r1385進行pcr擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據pcr擴增結果有無清晰的500bp目的電泳條帶來判斷待測中藥材白僵蠶樣品中是否含有白僵菌。

進一步優選地，還可繼續對pcr擴增產物進行測序及數據對比，構建系統進化樹，進一步確定結果。

其中，優選地，所述白僵蠶總dna的提取方法為：先將白僵蠶預處理成粉末後，進行總dna提取；所述預處理是指：用65～75％乙醇擦拭白僵蠶表面後，放於30～40℃環境中使酒精揮發，再粉碎磨粉。

具體更優選地，所述白僵蠶總dna的提取方法為：先用70％乙醇擦拭白僵蠶表面後，放於37℃環境中使酒精揮發，再用高速多功能粉碎機磨粉；然後加入液氮充分研磨，使用真菌基因組快速提取試劑盒抽提總dna，置於-20℃保存備用。

另外，優選地，所述pcr的反應體系為：2xtaqmastermix25μl，10pmol/μl的上下遊引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o2μl。

優選地，所述pcr的反應條件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25個循環；72℃10min。

一種包含有上述的引物對f935和r1385的快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的試劑盒，也在本發明的保護範圍之內。

優選地，所述試劑盒還可以包含有以待測中藥材白僵蠶總dna為模板，利用引物組f935/r1385進行pcr擴增所需的試劑。

該試劑盒的使用方法如上所述快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法。

本發明在完成對廣東株白僵菌線粒體全基因組測序和13個蟲草科物種的線粒體全基因組生物信息學比較分析的基礎上，發現白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯，並基於廣東株白僵菌線粒體全基因序列設計合成引物，最終篩選出了1對能特異檢測白僵菌的引物。並利用12株地理株系白僵菌以及市售僵蠶樣品進行引物有效性驗證，完成了對設計引物特異性、有效性的驗證，建立了高效、快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法。

本發明具有以下有益效果：

本發明基於對廣東株白僵菌線粒體全基因組測序結果和13個蟲草科物種的線粒體全基因組生物信息學比較分析，以及對12株不同地理株系白僵菌rps3基因進行多序列對比分析的基礎上，發現不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位點存在鹼基的替換現象，因此選擇基因rps3作為白僵菌線粒體全基因組的分子標記應用於中藥材僵蠶中白僵菌真偽鑑別，為僵蠶的真偽鑑別提供了理論基礎。

同時，通過提取廣東株白僵菌基因組總dna，構建高通量測序文庫，採用lluminahiseq2500平臺進行測序；denovo的方法將測序數據組裝成完整的白僵菌線粒體基因組序列。基於廣東株白僵菌線粒體全基因序列設計篩選出了1對能特異檢測白僵菌的引物，特異性好、靈敏度高，從而為不同產地市售僵蠶中基原白僵菌真偽鑑別的提供新的分子鑑定方法。

利用本發明設計的這對特異鑑定白僵菌的引物對不同產地市售僵蠶中白僵菌真偽進行鑑別，最終通過pcr擴增、電泳、測序及數據對比，構建系統進化樹，為僵蠶中白僵菌的分子鑑定提供了實驗參考和理論依據，為中藥材僵蠶的質量標準化和規範化提供新方法。

附圖說明

圖1為12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對結果。

圖2為12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對結果。

圖3為12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對結果。

圖4為廣東株白僵菌線粒體基因結構圖。

圖5為廣東株白僵菌近源物種所構建的系統進化樹。

圖6為基於廣東株白僵菌線粒體rps3基因設計的引物組f935/r1385的pcr擴增結果。註：m為dl2000dnamarker；1：實驗室保存株白僵菌b.bassiana，2：廣東英德株白僵菌b.bassiana，3：廣西南寧株白僵菌b.bassiana，4：廣東英德株白僵菌血清型b.bassiana(serum_types)，5：廣東英德株灰僵菌isariajavanica，6：麴黴aspergillusnomius，7：鐮刀黴fusariumproliferatum，8：水空白對照組。

圖7為基於引物組f935/r1385的12株地理株系白僵菌的pcr擴增結果。註：m：marker2000dl；1：實驗室保存株，2：廣西中平株，3：廣西中平浪洞村株，4：廣東茂名株，5：廣東化州株，6：廣西宜州石別株，7：廣西環江株，8：廣東翁源硝村株，9：廣西南寧株，10：廣東微生物研究所生防株，11：廣東英德株，12：湖南瀘溪株，13：水空白組。

圖8為基於12株地理株系白僵菌rps3基因構建的系統進化樹。

圖9為引物組f935/r1385對不同產地僵蠶的pcr擴增結果。註：m：marker2000dl；1-41號為不同產地市售僵蠶；a、b號為水空白組。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。

除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1白僵菌特異引物設計

1、發明人基於線粒體全基因組學分析法，比較了包括白僵菌在內的13個蟲草科物種的線粒體全基因組序列基因結構，找到了1個白僵菌差異蛋白編碼基因rps3，該基因為編碼核糖體蛋白s3的基因，核糖體蛋白s3是核糖體40s小亞基的組成蛋白，具有核糖體外功能，在dna損傷修復、基因表達調控、細胞凋亡等過程中發揮重要作用。

同時，應用clustalx1.81軟體12株不同地理株系白僵菌rps3基因進行多序列對比分析，結果發現12株不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位點存在鹼基的替換現象(12株地理株系白僵菌rps3基因序列比對結果如圖1、2、3所示。圖1、2、3是依次連續的)。

因此，選擇基因rps3作為白僵菌線粒體全基因組的分子標記應用於中藥材僵蠶中白僵菌真偽鑑別。

2、對廣東株白僵菌線粒體全基因組進行測序

廣東株白僵菌線粒體基因結構圖如圖4所示。廣東株白僵菌線粒體為閉合環狀結構，鹼基全長為29922bp，gc比例為27.26％，含有42個編碼基因(15個蛋白編碼基因、25個trna、2個rrna)，不含gap區域。

具體方法如下：

s1.廣東株白僵菌菌種的繁殖與分離純化

配置pda培養基，採用劃線法繁殖、分離純化廣東株白僵菌菌種；製備廣東株白僵菌單菌落。

s2.提取廣東株白僵菌基因組總dna

取適量白僵菌單菌落菌絲，加入液氮充分研磨，使用康為世紀真菌dna提取試劑盒按照其操作說明提取病葉總dna。

s3.構建高通量測序文庫

s4.illuminahiseq2500平臺測序

s5.質量檢測

為保障後續分析的可靠性，對測序數據進行必要的檢測和數據篩選，檢測的內容包括：數據質量檢測，測序數據量、測序數據質量、gc比例分布、測序正確率等；同時基於檢測結果，對數據進行篩選，篩選的標準為：測序數據q20(正確率在99％以上的鹼基的比例)不小於90％，q30(正確率在99.9％以上的鹼基比例)不小於83％。

s6.線粒體基因組序列捕獲

根據已經發布的近緣物種線粒體基因組序列，基於dna序列對比的方法，在總dna測序數據中分離測序樣品的線粒體基因組序列。

s7.基因組組裝與驗證

根據線粒體基因組數據的overlap關係，將測序的dna序列片段，組裝成完整的線粒體基因組。並通過測序質量和測序深度驗證組裝的正確性。

s8.基因組注釋

基因組的注釋先從trna開始，利用mitfi，trnascan-se(v1.21)和arwen對trna進行注釋，確保trna注釋的準確性；編碼基因和rrna基因的注釋，同時基於blastn&blastx(2.2.28+)的方法共同進行，通過對比結果確定具體的基因序列後，再將其翻譯成蛋白質序列並注釋以驗證基因組注釋是否正確。

s9.進化分析

採用raxml(v8.1.5)軟體最大似然法構建系統進化樹，bootstrap值為1000；採用的最優核苷酸模型是gtr+g+i，最優核苷酸模型為cprev+i+g+f。

s10.生物信息分析結果匯總

白僵菌線粒體基因組採用illuminahiseq2500平臺進行高通量測序，構建pe測序文庫，最終匯總測序數據。

進一步地，根據測序及數據對比，構建系統進化樹，如圖5所示，確定了廣東株白僵菌的種屬歸類。

3、引物設計

基於完成的廣東株白僵菌線粒體rps3基因高通量測序結果，設計了多組引物，經過初步篩選，確定了表1所示的6對引物組進一步實驗。

表1基於白僵菌線粒體rps3基因設計引物及序列信息

4、引物驗證

(1)建立pcr擴增體系和程序，如下所示：

表2pcr反應體系(50μl體系)

pcr反應條件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25個循環；72℃10min。

(2)pcr擴增

以表1所示的引物組進行pcr擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，引物組ⅰ，即引物組f935/r1385，能夠特異性的檢測白僵菌。

引物組f935/r1385的pcr擴增結果如圖6所示，泳道8(水空白對照)未出現反應條帶，說明pcr反應過程無汙染現象，反應結果可靠，pcr擴增結果得到目的片段大小在500bp左右的電泳條帶。基於廣東株白僵菌線粒體rps3基因設計的引物組f935/r1385能夠對白僵菌(泳道1、2、3)及白僵菌血清型(泳道4)進行擴增，而不能對灰僵菌(泳道5)、麴黴(泳道6)、鐮刀黴(泳道7)等真菌進行擴增，則引物組f935/r1385可作為快速鑑別白僵菌的特異引物。

實施例212株地理株系白僵菌rps3基因的pcr擴增

1、以12株地理株系白僵菌dna為模板，利用引物組f935/r1385進行pcr擴增，進一步驗證引物的有效性。

2、結果如圖7所示，泳道13(水空白對照)未出現反應條帶，說明pcr反應過程無汙染現象，反應結果可靠。12株地理株系白僵菌的pcr擴增結果均得到了清晰的電泳條帶，目的片段大小均在500bp左右。通過圖7完成了對引物的有效性驗證，該引物組f935/r1385可以作為鑑定白僵菌的特異引物。

3、進一步地，還可繼續對擴增產物進行測序及數據對比，構建系統進化樹，進一步確定結果。基於12株地理株系白僵菌rps3基因構建的系統進化樹如圖8所示。

實施例3基於引物組f935/r1385鑑別市售僵蠶樣品中白僵菌的真偽

1、實驗方法

(1)市售僵蠶總dna提取

樣品預處理：用70％乙醇擦拭白僵蠶表面後，放在玻璃皿中，並於37℃烘箱中使酒精揮發，用高速多功能粉碎機磨粉，裝於25ml滅菌塑料管中備用。

取適量僵蠶粉末，加入液氮充分研磨，使用購自上海生工生物工程有限公司的真菌基因組快速提取試劑盒抽提白僵菌菌絲體總dna，置於-20℃保存備用。

(2)不同產地市售僵蠶中白僵菌真偽鑑別

以中藥材僵蠶全基因組dna為模板，利用引物組f935/r1385進行pcr擴增。

2、pcr擴增結果如圖9所示，通過引物組f935/r1385對不同產地僵蠶的pcr擴增結果可以看出，根據有無清晰的500bp目的電泳條帶，則可以判斷市售產地僵蠶樣品中是否含有白僵菌，從而對不同產地市售僵蠶中白僵菌的真偽進行鑑別。

3、進一步地，還可繼續對擴增產物進行測序及數據對比，構建系統進化樹，進一步確定結果，為僵蠶中白僵菌真偽鑑別的分子鑑定方法提供依據。

sequencelisting

華南農業大學

一種快速鑑別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑑定方法

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