醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因的製作方法

2023-06-20 07:40:16 2

專利名稱：醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及醋酸桿菌的一種新的木糖醇脫氫酶、編碼此酶的基因以及生產木糖醇脫氫酶和木糖醇的方法。木糖醇在食品工業、醫藥工業等領域是很有用的。
木糖醇是一種天然糖醇，因為其含有較低的熱量卻具有與蔗糖相當的甜度，所以是一種有廣闊應用前景的低熱量甜料。此外，因為有抗齲齒的特性，其可以作為一種預防齲齒的甜料。另外，因為木醇糖並不升高葡萄糖的水平，因此被利用於糖尿病的流體療法。由於這些原因，可以預計將來木糖醇的需求會增加。
目前木糖醇的工業化生產主要利用如美國專利4008285中公開的方法即D-木糖的脫氫來進行。D-木糖作為原料通常由植物材料如樹木、稻草、玉米穗軸、燕麥殼和其它富含木聚糖的材料的水解作用而獲得。
然而，這種由植物材料水解而獲得的D-木糖因為成本高所以有價格較高的缺點。例如，植物材料水解處理的低產率導致了D-木糖醇的低純度。因此，水解處理後必須通過離子交換除去用於水解的酸和染料，並且合成的D-木糖必須進一步的結晶以除去其它的半纖維素糖類。為了獲得適於作為食品的D-木糖，還要求進一步的純化。這些離子交換處理和結晶處理導致了生產成本的增加。
因此，人們改進一些生產木糖醇的方法，利用易得到的原料並只產生了很小的浪費。例如，一些改進的方法利用其它的戊糖醇作為初始原料。其中一種易得到的戊糖醇是D-阿拉伯糖醇，並且D-阿拉伯糖醇可由酵母產生(加拿大微生物學雜誌，31.，1985，467-471；和普通微生物學雜誌，139，1993，1047-54)。
因而，一些利用D-阿拉伯糖醇為原料生產木糖醇的方法得到了發展。在應用微生物學，18，1969，1031-1035，上報導了一種方法，其中D-阿拉伯糖醇是由葡萄糖通過漢遜氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)ATCC 20121菌株發酵獲得，然後利用弱氧化醋桿菌(Acetobacter suboxydans)轉化為D-木糖，再在季也蒙氏假絲酵母(Candida guilliermondii)var.soya的作用下將D-木糖轉化為木糖醇。
EP 403 392A和EP 421 882A公開的方法通過利用耐滲透壓的酵母發酵產生D-阿拉伯糖醇，然後利用醋酸桿菌屬、葡糖桿菌或克雷白氏桿菌屬的桿菌將D-阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖，通過葡萄糖(木糖)異構酶的作用由D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，再通過氫化作用將木糖和D-木酮糖的混合物轉化為D-木糖醇。同時，也公開了木糖醇的產生包括木糖和D-木酮糖的混合物中的木糖的預濃縮以及通過氫化作用將濃縮的木糖轉化為木糖醇。
儘管上述利用D-阿拉伯糖醇作為原材料產生木糖醇的方法有比較高的產量，然而，存在著一個缺點即要求多個反應步驟，因此生產過程變得複雜。所以，在經濟上是不可能被接受的。
另一方面，人們試圖通過基因操作技術來繁殖木糖醇發酵微生物。國際公開的WO94/10325公開了使用重組微生物由葡萄糖發酵產生木糖醇的方法，所述重組微生物是通過將來自克雷白氏桿菌屬桿菌的阿拉伯糖醇脫氫酶基因和來自畢赤氏酵母(Pichia)屬桿菌的木糖醇脫氫酶基因導入阿拉伯糖醇發酵微生物(屬於念珠菌屬、球擬酵母屬或接合糖酵母屬的酵母)而獲得的。
然而，上面所述的通過基因操作技術來繁殖木糖醇發酵微生物作為一種實用方法是不完善的。
另外，木糖醇脫氫酶是一種催化由木糖生成木糖醇反應的酶，已知其存在於各種微生物中。例如，酵母具柄畢赤氏酵母(Pichia stipiti)(發酵生物工程雜誌，67.25(1989))，Pachysolen tannophilus(發酵技術雜誌，64.219(1986))，休哈塔假絲酵母(應用生物化學生物技術，26.197(1990))，近平滑假絲酵母(生物技術生物工程，58，440(1998))，漢遜氏德巴利氏酵母(應用生物化學生物技術，56，79(1996))和出芽茁黴(Pullularia pullulans)(An.Acad.Brasil.Cienc.，53，183(1981))，絲狀桿菌如黑色麴黴(微生物學，140，1679(1994))和粗糙鏈孢黴(FEMS Microbiol.lett.，146，79(1997))，藻類如Galdieria sulphuraria(植物，202，487(1997))，細菌如Morgannelamorganii(細菌學雜誌，162，845(1985))，等等。
關於木糖醇脫氫酶基因，已有具柄畢赤氏酵母(FEBS Lett，324，9(1993))和Morgannela morganii(DDBJ/GenBank/EMBL登記號L34345)的該基因核苷酸序列的報導。
然而，迄今為止人們對於來自醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因甚而其存在一無所知。
本發明的目的是提供一種與有較強木糖醇生產能力微生物的木糖醇生物合成有關的酶，及其基因，並且利用這些酶和基因以期建立一種技術用於有效地生產木糖醇或木糖醇發酵菌的繁殖。
為了達到上述目的，發明人尋找到一些有將D-阿拉伯醇直接轉化為木糖醇能力的微生物。結果，發現葡糖桿菌屬或醋酸桿菌屬的細菌有這種能力。此外，成功地純化了兩種得自氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)的木糖醇脫氫酶，並且成功地分離出編碼這些酶和決定其結構的基因。因而，本發明已經完成。
即本發明提供了(1)在如下(A)或(B)中定義的蛋白質(A)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列的蛋白質；(B)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質；和(2)在如下(C)或(D)中定義的蛋白質(C)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列的蛋白質；(D)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質。
本發明也提供了(3)編碼在(A)或(B)中定義的蛋白質的DNA；(A)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列的蛋白質；(B)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質；(4)編碼(C)或(D)中定義的蛋白質的DNA(C)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列的蛋白質；(D)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質；
(5)上述(3)中的DNA，其定義於如下(a)或(b)(a)至少含有一段對應於序列表中SEQ ID NO3第25到1053位的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴緊條件下可與具有對應於序列表中SEQ ID NO3第25到1053位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸製備的探針進行雜交，並且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質的DNA；(6)上述(5)中的DNA，嚴緊條件是在60℃下，鹽濃度相當於1x SSC和0.1％SDS時進行洗滌。
(7)上述(4)中的DNA，其定義於如下(c)或(d)(c)至少含有一段對應於序列表中SEQ ID NO5第1063到1848位的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴緊條件下可與具有對應於序列表中SEQ ID NO5第1063到1848位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸製備的探針進行雜交，並且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質的DNA；和(8)上述(4)中的DNA，嚴緊條件是在60℃下，鹽濃度相當於1x SSC和0.1％SDS時進行洗滌。
本發明還提供了(9)以由上述(3)至(8)中任一DNA編碼的木糖醇脫氫酶可被表達的方式被導入所述DNA的細胞。
本發明進一步提供了(10)生產木糖醇脫氫酶的方法，其中包括在培養基中培養上述(9)的細胞以便木糖醇脫氫酶可以在培養基中產生和積累，並且從培養基中收集木糖醇脫氫酶。
本發明更進一步提供了(11)生產木糖醇的方法，其中包括用上述(1)或(2)的木糖醇脫氫酶作用於D-木酮糖，並收集產生的木糖醇；和(12)生產木糖醇的方法，其中包括用上述(9)的細胞作用於D-木酮糖，並收集產生的木糖醇。
儘管本發明的木糖醇脫氫酶有催化還原D-木酮糖產生木糖醇和催化氧化木糖醇產生D-木酮糖的活性，「有木糖醇脫氫酶活性」在這裡是指至少有催化由D-木酮糖產生木糖醇的反應的活性。
依照本發明，提供了新的木糖醇脫氫酶和編碼此酶的DNA，並且木糖醇脫氫酶可以通過使用該DNA來產生。
此外，木糖醇可以通過使用被導入木糖醇脫氫酶或編碼此酶的DNA的細胞來產生。
而且，本發明的DNA可用於繁殖生產木糖醇的微生物。
附

圖1是純化XDH的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜；a)SDS-PAGE凝膠電泳後CBB染色，b)非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳後CBB染色，和c)非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳後活性染色。
附圖2是描繪XDH2酶活對pH依賴性圖譜。
本發明將在下文進行具體地說明。1本發明的木糖醇脫氫酶本發明的木糖醇脫氫酶是一類由氧化葡糖桿菌產生的酶。已經發現了兩種這樣的酶，一種稱為XDH1，另一種是XDH2。XDH1有SEQ ID NO4的胺基酸序列，XDH2在序列表中有SEQ ID NO6的胺基酸序列。通過SDS-PAGE凝膠電泳測得XDH1和XDH2的分子量分別為大約36000到40000，和大約27000到30000。這兩種木糖醇脫氫酶，XDH1和/或XDH2，在下邊可被統稱為「XDH」。
正如在後面實施例5所涉及的，還原反應中(由D-木酮糖產生木糖醇的反應)的XDH2的最適pH為5左右。已知木糖醇脫氫酶，例如得自黑色麴黴的木糖醇脫氫酶的還原反應，其最適pH嚴格地為6.5(Cor F.B.Witteveen，et al，微生物學，140，1679-1685，1994)，因此與本發明得自葡糖桿菌屬桿菌的XDH2在最適反應pH上有明顯的不同。
關於產生本發明的XDH的方法及分離和純化由氧化葡糖桿菌產生的XDH的方法的實施例將在下面說明。
首先，用如超聲波處理的機械方法或使用細胞壁消化酶等的酶方法對氧化葡糖桿菌例如ATCC621菌株的細胞進行破裂，然後通過離心或類似方法除去不溶解成分以製備細胞提取物。
可通過常規的例如陰離子交換層析、親和層析、疏水層析、凝膠過濾層析等蛋白質純化方法的聯合來分級分離如上述所獲得的細胞提取物以純化XDH。
作為陰離子交換層析的載體，可使用Q-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia生產)，Mono-Q(Pharmacia生產)等。含有XDH的提取物流過充滿此載體的柱以便酶被吸附到柱上，並且洗滌柱後，酶被高鹽濃度的緩衝液洗脫。在這種情況下，鹽濃度可以逐步增加，或應用一個濃度梯度。例如，當使用Q-瓊脂糖凝膠FF時，可用200到350mM KCl洗脫被吸附到柱上的XDH。當使用Mono-Q時，可用150到250mMKCl洗脫。
作為親和層析的載體，可使用HiTrap Blue(Pharmacia生產)。本發明的XDH是利用NAD或NADH作為輔酶，因此對這些物質有親和力。被吸附到載體上的XDH可用含有大約5mM的NAD的緩衝液洗脫。
作為疏水層析的載體，可使用苯基瓊脂糖HP(Pharmacia生產)，吸附到低鹽濃度載體上的XDH可用200到300mM硫酸銨洗脫。
按上述純化的XDH可通過凝膠過濾層析、SDS-PAGE凝膠電泳等方法進一步純化並分離為XDH1和XDH2。作為凝膠過濾層析的載體，可使用交聯葡聚糖200HP(Pharmacia生產)。
在上面所述的純化步驟中，級分中是否含有XDH可以通過用例如在後面實施例中所述的方法測量級分的XDH活性來證實。
如上所述已純化的XDH1和XDH2的N-端胺基酸序列分別示於序列表的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
儘管本發明的XDH可以如上所述通過分離和純化從氧化葡糖桿菌的細胞獲得，也可以通過將後面所述的編碼XDH的DNA導入合適的宿主從而使DNA得以表達再通過用常規方法發酵獲得異源的蛋白質。
下面所述的不同的基因重組技術描述在「分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)」。
作為用於獲得XDH基因表達的宿主，可使用多種原核細胞，包括埃希氏桿菌如大腸桿菌，葡糖桿菌如氧化葡糖桿菌，和枯草芽胞桿菌，多種真核細胞如釀酒酵母，具柄畢赤氏酵母和米麴黴。
用於將XDH基因導入宿主的重組DNA可通過將編碼XDH的DNA插入視宿主種類而定的載體中來獲得，在宿主中用這種方式可表達由DNA編碼的XDH。如果XDH基因的特定啟動子在宿主細胞中具有活性時，此啟動子可用作XDH基因表達的啟動子。此外，如果需要，另外一個在宿主細胞中有活性的啟動子可和編碼XDH的DNA連結在一起，在該啟動子的控制下獲得表達。當埃希氏桿菌屬作為宿主時，可使用lac啟動子，trp啟動子，trc啟動子，tac啟動子，PR啟動子，λ噬菌體的PL啟動子等。作為埃希氏桿菌的載體，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等也可以被使用。噬菌體DNA載體也可以使用。此外，含有啟動子且能表達插入DNA序列的表達載體也可被使用。
根據例如D.A.Morrison的方法(酶學方法，68，326(1979))或其中受體細胞用氯化鈣處理以增加DNA的透過性(Mandel，M.and Higa，A.，分子生物學雜誌，53，159(1970))的方法，通過導入質粒大腸桿菌可以被轉化。2編碼XDH的DNA通過PCR(聚合酶鏈反應，見White，T.J.et.al；Trends Genet.，5，185(1989))或雜交可以從氧化葡糖桿菌的cDNA文庫或染色體DNA文庫獲得編碼XDH的DNA。用於PCR反應引物的設計基於所測定的純化的XDH1和XDH2氨基端的胺基酸序列。此外，由於本發明已闡明XDH1基因(SEQ ID NO3)和XDH2基因(SEQ ID NO5)的核苷酸序列，所以引物或用於雜交的探針可以以這些核苷酸序列為基礎來設計。通過使用含與5』非翻譯區和3』非翻譯區相對應之序列的引物用於PCR，XDH編碼區的全長序列可以被擴增。
具體地，對於XDH2而言，含有SEQ ID NO5中第1063位核苷酸上遊區域之核苷酸序列的引物可用作5』引物，含有第1851位核苷酸下遊區域之核苷酸序列的引物可以用作3』引物。至於XDH1，含有SEQ ID NO3中第25位核苷酸上遊區域之核苷酸序列的引物可以用作5』引物。
引物的合成可通過常用的方法，例如磷醯胺化方法(見Tetrahedron Letters，22，1859(1981))，使用商購的DNA合成儀來進行(例如，380B型DNA合成儀，由Appied Biosystems生產)。此外，按照供應商指定的方法，使用例如，PERKIN ELMER生產的Gene Amp PCR系統和TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)可進行PCR。
本發明的DNA可編碼包括一個或幾個胺基酸在一個或多個位置發生替換、缺失、插入、增加、倒位的XDH1或XDH2，只要所編碼的XDH1或XDH2將D-木酮糖轉化為木糖醇的活性不變即可。儘管「幾個」胺基酸的數目的不同取決於蛋白質的三維結構中的胺基酸殘基的位置和類型，其可為2到100，優選為2到50，更優選為2到10。
例如，通過XDH1基因或XDH2基因的核苷酸序列的修飾，例如，通過定點誘變法以使基因特定位點處的一個或多個胺基酸殘基發生替換、缺失、插入、增加或倒位，即可獲得編碼與上述XDH1或XDH2基本上相同的蛋白質的DNA。上述的DNA修飾可通過已知的常規突變處理來得到。突變處理包括在體外用例如羥胺，處理編碼XDH的DNA的方法，和用紫外線照射或用通常用於突變處理的突變劑如N-甲基N`-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理微生物的方法，所述微生物如埃希氏桿菌屬攜有編碼XDH的DNA的細菌。
上述核苷酸的替換、缺失、插入、增加、倒位也包括自然發生的突變(突變體或變體)，例如，微生物的菌株、種或屬的差異。
通過在適當的細胞中表達上述具有突變的DNA並目檢測表達產物的XDH1或XDH2的活性可獲得編碼與XDH1或XDH2基本上相同的蛋白質的DNA。也可以通過從編碼具有突變的XDH1或XDH2的DNA中或從攜有所述DNA的細胞中分離DNA來獲得編碼與XDH1或XDH2基本上相同的蛋白質的DNA，所述DNA可在嚴緊條件下與例如含有SEQ ID NO3的第25到1053位核苷酸序列的DNA或由此DNA製備的探針雜交，或與含有SEQ IDNO5的第1063到1848位核苷酸序列的DNA或由此DNA製備的探針雜交，並且該DNA編碼有XDH1或XDH2活性的蛋白質。這裡所述的「嚴緊條件」是指在此條件下形成所謂的特異性雜合體，而不形成非特異性雜合體。使用任何數值都難以清楚地表述這種條件。然而，例如，嚴緊條件包括這樣一種條件，在此條件下，DNA有很高的同源性，例如，至少有50％同源性的DNA會相互雜交，DNA同源性低於上述值彼此則不雜交。可選擇地，嚴緊條件例示於這樣一種條件，在此條件下，DNA之間的雜交在與Southern雜交的一般洗滌條件一致的鹽濃度下進行，即60℃，1x SSC，0.1％SDS，優選為0.1x SSC，0.1％SDS。
在上述條件下可雜交的基因，包括那些有終止密碼子產生的基因，和那些由於活性中心的突變而無活性的基因。然而，通過將基因與可商購的活性表達載體連接，根據下面闡述的方法測定XDH1或XDH2活性，可很容易地去除這些突變基因。
本發明中編碼XDH的DNA除可用於上述XDH的生產方法和下述木糖醇的生產方法之外，還可用於生產木糖醇之微生物的繁殖。例如，通過增強具有將D-阿拉伯糖轉化為木糖醇的能力的如葡糖桿菌的微生物中的XDH基因，微生物將D-阿拉伯糖轉化為木糖醇的能力可得到提高。
3.生產木糖醇的方法通過將本發明的XDH或導入一段編碼XDH的DNA並表達XDH的細胞作用於D-木酮糖，並且收集產生的木糖醇，可以生產木糖醇。
XDH可以是提取自葡糖桿菌屬的酶，或利用可編碼XDH的DNA通過基因重組技術來生產的酶。此外，XDH可以是XDH1或XDH2，且可以是它們任意比例的混合物。
由D-木酮糖生產木糖醇的反應在20-60℃，更優選在30-40℃，且pH為4-10，更優選pH為4-8下進行時通常會得到理想的結果。至於反應，靜置培養或搖床培養均可以採用。反應時間可以根據所用XDH的濃度、細胞的數量、底物濃度進行變化，較理想地為1-100小時。
從完成反應的混合物中收集和分離產生的木糖醇，包括使用合成的吸附劑、沉澱劑等的任何常規的方法均可使用。
本發明將引用以下的實施例進一步明確地闡述。然而，本發明並不局限於實施例的描述。
實施例1通過氧化葡糖桿菌產生XDH和XDH的純化1氧化葡糖桿菌ATCC621的培養培養氧化葡糖桿菌ATCC621菌株以獲得有足夠XDH活性的細胞。30℃下，以PD培養基作為肉湯培養基振蕩培養。PD培養基的組成為24g/L的馬鈴薯葡萄糖(Difco)，30g/L的酵母抽提物(Difco)，5g/L肉汁提取物(Difco)，15g/L甘油，10g/L D-阿拉伯糖醇，10g/L D-木糖，10g/L木糖醇，20g/L碳酸鈣(Kanto Chemical)，pH7.0。
首先，作為種子培養物，ATCC621菌株被接種至含有40ml PD培養基的坂口氏瓶，30℃下振蕩培養過夜。將得到的濃度相當於1％的培養液接種至各含40ml PD培養基的坂口氏瓶，並且於30℃下振蕩培養3天(主培養物)。通過離心去除碳酸鈣後，離心收集到細胞。上述所獲細胞用於XDH的提純材料。
通過下面的酶活測定法測得XDH的活性。將30μl的酶液加至含有100mM的(終濃度)木糖醇、2mMNAD和100mM CAPS(PH10.0)的570μl的反應液中，30℃下進行酶解反應，利用分光光度計(BECKMAN生產的DU640分光計)測量340nm處的吸收來測定反應進程中NADH的增加。每分鐘產生1μmol NADH的活性被定義為一個單位(U)。利用NADH在340nm下的分子吸收係數ε為6.3×103進行計算。2XDH的純化(1)細胞提取物的製備將如上所獲的細胞懸浮於50mM磷酸鉀緩衝液中(pH7)，且5000xg下離心10分鐘重新收集沉澱部分，此過程中這些細胞的懸浮和離心均重複兩次以洗滌細胞。
將大約10g的已洗滌的細胞懸浮於50ml的緩衝液1中(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mMMgCl2，1mMDTT)，在4℃下用超聲波破碎20分鐘。將破碎細胞的懸浮液離心(8000rpm，10分鐘)以除去細胞碎片，進一涉超速離心(56000rpm，30分鐘)以除去不溶解的部分。因而，就獲得了可溶的部分。
(2)陰離子交換層析將上述所獲的可溶部分上樣於用緩衝液1平衡過的陰離子交換層析柱Q-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia生產)。通過此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩衝液1洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質(非吸附蛋白質)，用含有KCl的緩衝液作為洗脫液洗脫被吸附的蛋白質。在此洗脫過程中，緩衝液中KCl的濃度是從0M到0.5M線性變化的。測得洗脫過程中得到的每一個洗脫級分的XDH活性。在對應於大約200到350 mMKCl的濃度時發現洗脫級分中XDH的活性。
(3)NAD親和層析合併上面獲得的含XDH活性的部分，對緩衝液1進行透析。用0.45μm的濾器過濾經透析後的溶液。將濾液上樣於用緩衝液1平衡過的5ml NAD親和柱HiTrap Blue(Pharmacia生產的)。通過此操作，XDH被吸收到載體上。
用緩衝液1洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質(非吸附蛋白質)，然後用含NAD的緩衝液2(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，1mMDTT，5mM NAD)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質。結果，在被洗脫的級分中測到XDH。
(4)陰離子交換層析通過0.45μm的濾器過濾上述含有XDH活性的洗脫級分。將獲得的濾液上樣於用緩衝液1平衡過的陰離子交換層析柱Mono-Q(Pharmacia生產的)。通過此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩衝液1洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質，然後用含有KCl的緩衝液作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質，在此洗脫過程中，洗脫液中KCl的濃度是從0mM到500mM線性變化的。測得洗脫過程中得到的每一個洗脫級分的XDH活性。在對應於大約150到250mMKCl的濃度時發現洗脫級分中的XDH活性。
(5)疏水層析對著緩衝液3(50mM磷酸鉀緩衝液，1M硫酸銨，pH7.0)透析需檢測活性的洗脫級分。通過0.45μm的濾器過濾透析後的溶液。將得到的濾液上樣於用緩衝液3平衡過的疏水層析柱苯基瓊脂糖凝膠HP(Pharmacia生產)。通過此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩衝液3洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質，然後用緩衝液4(50mM磷酸鉀緩衝液，pH7.0)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質，此洗脫過程中，緩衝液中硫酸銨濃度呈從1M到0M的線性變化。測得洗脫過程中得到的每一個洗脫級分的XDH活性。在對應於大約200到300mM硫酸銨的濃度時發現洗脫級分中的XDH活性。
(6)純化級分的分析對通過上述純化獲得的XDH活性組分進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色。結果，確認XDH被純化到可被檢測到兩條帶的水平，所述帶的分子量估計分別為大約27000到30000和大約37000到40000(見圖1)。自此以後，與分子量大約為36000到40000的帶相對應的蛋白質被稱為XDH1，與分子量大約為27000到30000的帶相對應的蛋白質被稱為XDH2。
此外，對獲得的活性組分進行Native-PAGE電泳(非變性PAGE)和考馬斯亮藍染色。結果，兩條對應於大於100kDa的分子量的帶被證實。當經Native-PAGE電泳後的凝膠被活性染色液(25mM甘氨酸緩衝液，2.5mMNAD，50mM木糖醇，0.2nM吩嗪硫酸甲酯，0.2mM四硝基藍四氮唑氯化物)活性染色時，在兩個對應的帶裡測到XDH的活性，已證實與在SDS-PAGE電泳中檢測到的兩個帶對應的蛋白質都有XDH活性(圖1)。含有這些XDH1和XDH2的已純化組分有時在後面被簡稱為XDH。
已測得作為上述純化的結果的XDH比活的增加。已測到上述細胞提取物和通過純化獲得的活性組分的XDH活性。結果，發現通過一系列純化過程，每單位蛋白質重量的比活增加550倍。通過用於這種測量的活性測定方法，純化的XDH的比活估計大約為130U/mg(30℃，pH10)。
(7)XDH氨基端胺基酸序列的測定按下述測定上述純化XDH氨基端的胺基酸序列。即，在SDS的存在下，在聚丙烯醯胺凝膠中電泳已純化的大約10μg XDH蛋白質，然後將凝膠中的XDH印跡至濾膜上，通過蛋白質測序儀從N端分析胺基酸序列。具體地，利用Milliblot(Millipore)將經半乾法電泳後的凝膠中的目的酶印跡至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Tanpakushitu Kozo Kaiseki[蛋白質結構的分析]，H.Hirano，Tokyo Kagaku Dojin)。然後，通過蛋白質測序儀(ABI生產的476A型)分析PVDF膠片上的目的酶(XDH1或XDH2)以進行N端胺基酸序列分析。
結果，測得XDH1 N端27個殘基的胺基酸序列，和XDH2N端25個殘基的胺基酸序列。測得的XDH1 N端胺基酸序列示於序列表中的SEQ IDNO1，XDH2 N端胺基酸序列示於序列表中的SEQ ID NO2。
實施例2利用XDH將D-木酮糖轉化為木糖醇使用實施例1獲得的純化的XDH(XDH1和XDH2)將D-木酮糖轉化為木糖醇。將0.2U的純化的XDH加至含21mM D-木酮糖、20mM NADH、100mMTris-HCl緩衝液(pH 8.0)的0.25ml反應液中，30℃保溫1小時使其反應。反應完的溶液在下面的條件下經過高效液相層析(HPLC)分析產物木糖醇。
柱Shodex SC1211 (Show Denko Co.，Ltd.生產)流動相50％乙腈/50％50ppm含水的Ca-EDTA流速0.8ml/分鐘溫度60℃檢測RI檢測器結果，反應後在溶液中發現產生了18mM的木糖醇，且顯示了使用純化的XDH可由D-木酮糖產生木糖醇。
實施例3得自葡糖桿菌的XDH基因的分離
1通過PCR擴增XDH基因(1)製備以XDH的N端胺基酸序列作為基礎的PCR引物以來自上述氧化葡糖桿菌ATCC621的每個XDH(XDH1，XDH2)的N端胺基酸序列(SEQ ID NO1和2)為基礎，分別製得具有如SEQ ID NO7-10所示核苷酸序列的混合引物。
(2)製備氧化葡糖桿菌ATCC621的染色體DNA在如下條件下培養氧化葡糖桿菌ATCC621菌株。首先，在20ml的YPG培養基(3％葡萄糖，0.5％的Bacto酵母抽提物，0.3％Bacto蛋白腖，pH6.5)中將ATCC621菌株培養過夜作為種子培養物。使用5ml此培養物作為接種菌，使用100ml YPG培養基進行主培養，在30℃下振蕩培養。
細菌在上述的條件下培養到對數生長後期後，離心100ml的培養物肉湯(12000xg，4℃，15分鐘)以收集細胞，將細胞懸浮於10ml的50∶20TE(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM EDTA)中，洗滌細胞並離心回收之。將細胞再懸浮於10ml的50∶20TE中。將0.5ml的20mg/ml的溶菌酶溶液和1ml的10％的SDS溶液加至此懸浮液中，55℃保溫20分鐘。保溫後，加入等體積的10∶1的TE-飽和的苯酚進行脫蛋白質作用。通過將等體積的2-丙醇加至已分離的水層得到DNA沉澱，然後收集之。沉澱DNA溶解於加入了5μl 10mg/ml的核糖核酸酶和5μl 10mg/ml的蛋白酶K的0.5ml的50∶20 TE中，55℃反應2小時。反應後，通過加入等體積的10∶1的TE-飽和的苯酚進行脫蛋白質作用。在分離的水層中再加入等量的24∶1的氯仿/異戊醇，攪拌，並收集水層。此步驟重複兩次後，在得到的水層中加入3M的醋酸鈉溶液(pH5.2)以獲得0.4M的終濃度，再加入兩倍體積的乙醇。產物DNA作為沉澱被收集，用70％的乙醇洗滌，乾燥，溶解於1ml的10∶1的TE中。
(3)通過PCR製備DNA片段通過使用TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(TaKaRa Shuzo公司提供)進行PCR以擴增和分離含有來自葡糖桿菌屬的編碼XDH的基因的DNA分子。除非另有說明實驗是按照試劑盒附帶的說明書進行的。
將上述(2)得到的5μg染色體DNA用限制性酶PstI或HindIII進行降解。然後，將一個PstI盒或HindIII盒與用乙醇沉澱收集得到DNA片段連接。此外，乙醇沉澱後，使用引物C1和下述引物的聯合對收集的DNA進行首次PCR。即將與一個PstI盒連接的DNA作為基於XDH1胺基酸序列的引物XDH1-S1的模板DNA，將與一個HindIII盒連接的DNA作為基於XDH2胺基酸序列的引物XDH2-S1的模板DNA。引物C1、引物XDH1-S1、引物XDH2-S1的核苷酸序列分別示於序列表的SEQ ID NO11、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9。引物C1包含在TaKaRaLAPCR體外克隆試劑盒中，且對應於PstI盒和HindIII盒的序列。PCR反應是通過基因擴增PCR系統9600(由PERKIN ELMER生產)進行的，反應在如下條件下重複30個循環。
94℃ 30秒55℃ 2分鐘72℃ 1分鐘然後，將反應的混合物稀釋100倍，並新加入引物C2和引物XDH1-S2或引物XDH2-S2，進行第二次PCR擴增。反應條件與第一次的相同。引物C2、引物XDH1-S2、引物XDH2-S2的核苷酸序列分別示於序列表的SEQ IDNO12、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10。引物C2包含於TaKaRaLAPCR體外克隆試劑盒中，且具有對應於PstI盒和HindIII盒之序列的序列。按已知的胺基酸序列設計的引物XDH1-S2和XDH2-S2分別含有一個序列，該序列對應於EcoRI和EcoRI位點。
反應結束後，對3μl的反應混合物進行0.8％的瓊脂糖凝膠電泳。結果，證實當使用XDH1-S2為引物時，大約1kb的DNA被擴增，使用XDH2-S2為引物時，大約1.7kb的DNA被擴增。
(4)將經PCR擴增的DNA片段克隆到pUC19中通過將PCR擴增得到的大約1kbp(XDH1)和大約1.7kbp(XDH2)的DNA片段與pUC19連接而進行克隆。連接反應是通過使用DNA連接試劑盒Ver.2(TaKaRa Shuzo公司提供)進行的。除非另有說明，實驗是按照試劑盒附帶的說明書進行的。
用PstI和EcoRI消化使用引物XDH1-S2擴增得到的400ng大約1kb的DNA片段，然後純化之，與經PstI和EcoRI消化的pUC19連接。使用這種連接反應混合物轉化大腸桿菌JM109。
另外，用HindIII和EcoRI消化使用引物XDH2-S2擴增得到的400ng大約1.7kb的DNA片段，然後純化之，與經HindIII和EcoRI消化的pUC19連接。使用這種連接反應混合物轉化大腸桿菌JM109。
每次從獲得的轉化細胞中，選擇用pUC19轉化的含有大約1kbp(XDH1)或大約1.7kbp(XDH2)目的DNA片段的幾個JM109菌株。選擇的方法描述於「分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)」。
(5)XDH2基因片段核苷酸序列的測定製備被pUC19轉化的JM109攜帶的質粒，其中pUC19含有大約1.7kbp(XDH2)的DNA片段，製備方法描述於「分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)」，測定插入的DNA片段的核苷酸序列。測序反應是通過使用DyeTerminator Cycle測序試劑盒(ABI生產)，按照試劑盒附帶的說明書進行的。使用DNA測序儀373(ABI生產)進行電泳。
結果，發現PCR擴增的DNA片段中具有從序列表中SEQ ID NO5所示核苷酸序列的第1160位胸苷殘基到第2774位胸苷殘基的序列。
(6)通過PCR製備XDH2基因上遊區域的DNA片段使用如上測定的核苷酸序列通過PCR擴增和分離XDH2基因和XDH2基因上遊區域的DNA片段。PCR反應是使用TaKaRa LAPCR體外克隆試劑盒(TaKaRa Shuzo公司提供)進行的。除非另有說明，實驗是按照試劑盒附帶的說明書進行的。
將(2)中製備的5μg染色體DNA用限制性酶SalI消化。然後，將SalI盒與用乙醇沉澱收集的DNA片段連接。再用乙醇沉澱，通過使用引物C1和引物XDH2UP-S1對收集的DNA進行首次PCR。引物C1、引物XDH2UP-S1的核苷酸序列分別示於序列表的SEQ ID NO11和SEQ ID NO13。引物XDH2UP-S1是和SEQ ID NO5所示的編碼葡糖桿菌屬XDH2的基因簇核苷酸序列的第1317位胞嘧啶殘基到第1283位胞嘧啶殘基區域互補的序列。
PCR反應是通過基因擴增PCR9600系統(由PERKINELMER生產)進行的，反應在如下條件下重複30個循環。
94℃ 30秒55℃ 2分鐘72℃ 1分鐘然後，將反應的混合物稀釋100倍，並新加入引物C2和引物XIDH2UP-S2，進行第二次PCR擴增。反應條件與第一次的相同。引物C2、引物XDH2UP-S2的序列分別示於序列表的SEQ ID NO12和SEQ ID NO14。引物XDH2UP-S2是由與SEQ ID NO5所示的編碼葡糖桿菌屬XDH2的基因的核苷酸序列中的第1255位鳥嘌呤殘基到1225位鳥嘌呤殘基區域互補的一段序列組成。反應完成後，將3μl的反應混合物用於0.8％瓊脂糖凝膠電泳。結果證實大約1.3kb的DNA片段被擴增。
(7)XDH2基因的核苷酸序列和含有其上遊序列的DNA片段的檢測將上述PCR擴增得到的大約1.3kbp DNA片段進行純化，並且測定其核苷酸序列。通過使用Dye Terminator循環測序試劑盒(ABI生產)，按照試劑盒附帶的說明書進行測序。通過使用DNA373測序儀(ABI生產)進行電泳。
結果發現(6)中擴增的DNA片段中具有序列表中SEQ ID NO5所示核苷酸序列的從第1位鳥嘌呤殘基到第1224位鳥嘌呤殘基的一段序列。示於SEQ ID NO5的核苷酸序列包括與(5)中測定的核苷酸序列結合的這段核苷酸序列。可能由該段核苷酸序列編碼的胺基酸序列可由通用密碼子來推導，該胺基酸序列一起示於SEQ ID NO5，也顯示於SEQ ID NO6。從第2到26位胺基酸殘基的序列完全對應於SEQ ID NO2所示XDH2的N端胺基酸序列的從第1到25位胺基酸殘基的序列。自此證實了PCR擴增得到的DNA片段為來源於葡糖桿菌屬的靶XDH2基因及其上遊區域。
(8)含有全長XDH2基因編碼區的DNA片段的克隆通過PCR擴增含有全長XDH2基因編碼區的DNA片段，並將其連接到pUC18上以進行克隆。該PCR反應利用TaKaRa LAPCR試劑盒(由TakaraShuzo Co.，Ltd.提供)進行。除非另有說明，實驗是按照試劑盒附帶的說明書進行的。
PCR是通過將使用與(2)中相同的方法生產的氧化葡糖桿菌ATCC621菌株的1μg染色體DNA用作模板，並且利用引物XDH2-5』和引物XDH2-3』來進行的。引物XDH2-5』的核苷酸序列示於序列表的SEQ ID NO15，引物XDH2-3』的核苷酸序列示於序列表的SEQ ID NO16。引物XDH2-5』含有一個序列，此序列對應於含有SEQ ID NO5所示XDH2基因的核苷酸序列的從第1043位胞嘧啶殘基到第1063位胞嘧啶殘基區域，引物XDH2-3』含有互補於上述核苷酸序列的第1957位胞嘧啶殘基到1978位胞嘧啶殘基區域的一段核苷酸序列。
該PCR反應是通過基因擴增PCR9600系統(由PERKIN ELMER生產)進行的，反應在如下條件下重複30個循環。
94℃ 30秒55℃ 2分鐘72℃ 1分鐘反應完成後，將3μl的反應混合物用於0.8％的瓊脂糖凝膠電泳。結果證實大約1kbp的DNA片段被擴增。
將通過上述PCR擴增得到的大約1kbp的DNA片段連接到pUC18上進行克隆，此克隆利用DNA連接試劑盒Ver.2(由Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)進行。除非另有說明，實驗是按照試劑盒附帶的說明書進行的。用BamHI和EcoRI消化400ng大約1kb的擴增DNA片段，然後純化之，與用BamHI和EcoRI消化的pUC18連接。利用這種連接反應混合物轉化大腸桿菌JM109。
從獲得的轉化子中，選擇用pUC18轉化的含有大約1kbp目的DNA片段的幾個JM109菌株。選擇的方法描述於「分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)」。
來源於氧化葡糖桿菌的XDH2基因可由上述方法克隆。通過上述方法獲得的含有XDH2目的基因片段的質粒被稱作pUCXDH2。
(9)測定XDH1基因片段的核苷酸序列提取從(4)中選擇的被含大約1kbp(XDH1)DNA片段的pUC18轉化的JM109菌株所攜帶的質粒，提取方法描述於「分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)」，測定插入的DNA片段的核苷酸序列。測序反應是通過使用DyeTerminator循環測序試劑盒(ABI生產)，按照試劑盒附帶的說明書進行的。使用DNA測序儀373(ABI生產)進行電泳。
結果，發現PCR擴增的DNA片段含有序列表的SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第52位的鳥嘌呤殘基到1011位鳥嘌呤殘基的序列。
(10)從染色體DNA文庫克隆XDH1基因i)染色體DNA文庫的構建用HindIII完全消化上文(2)中製備的1μg染色體DNA。用乙醇沉澱收集DNA，然後溶解於10μl的10∶1的TE中。將5μg的此溶液和1ng用HindIII消化過並經BAP(細菌的鹼性磷酸酶)脫磷酸化的pUC19(Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)混合，連接反應是通過使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)進行的。將3μl的此連接反應混合物與100μl的大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)的感受態細胞混合以轉化大腸桿菌JM109。將此塗布於適當的固體培養基從而構建染色體DNA文庫。
ii)探針的製備用(3)中得到的XDH1基因的一部分作為探針。將(3)中得到的使用引物C2和引物XDH1-S2擴增的大約1kbDNA片段在1％瓊脂糖凝膠上電泳進行分離。切下靶帶，用Gene CleanII試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA。最終獲得16μl的50ng/μlDNA溶液。根據產品說明書用DIG High Prime(Boehringer Mannheim生產)和此DNA片段製得地高辛標記的探針。
iii)通過菌落雜交進行篩選為了得到全長的XDH1基因，利用上述的探針通過菌落雜交進行染色體DNA文庫的篩選。菌落雜交的方法見「分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)」。
將染色體DNA文庫的菌落印跡至尼龍濾膜上(Amershm生產的Hybond-N)，鹼變性，中和，固定。用EASYHYB(Boehringer Mannheim生產)進行雜交。將濾膜浸入緩衝液(EASYHYB)，且於42℃預雜交1小時。然後，加入上述標記的探針，42℃雜交16小時。接著，在室溫下用含有0.1％SDS的2x SSC衝洗濾膜20分鐘。而後，65℃用含有0.1％SDS的0.1x SSC衝洗濾膜15分鐘兩次。
根據試劑盒的說明書用DIG核苷酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim生產)檢測可與上述探針雜交的菌落。結果，檢測得到四株可與探針雜交的菌落。
(11)XDH1基因的DNA序列用與(5)中相同方法，檢測到插入pUC19的DNA片段的核苷酸序列，結果示於序列表的SEQ ID NO3。通過通用密碼子推導出的由核苷酸序列編碼的胺基酸序列連同核苷酸序列示於SEQ ID NO3，也示於SEQ ID NO4。從第2到第28位胺基酸殘基的胺基酸序列完全對應於SEQ ID NO1所示的由第1到第27位的27個胺基酸殘基組成的序列。自此證實獲得的DNA片段是來源於葡糖桿菌屬的靶XDH1基因及其側翼區。
實施例4來源於葡糖桿菌屬細菌的XDH1基因在大腸桿菌中的表達及產物的純化1攜有重組XDH2基因的大腸桿菌的培養與表達的誘導實施例3所獲的pUCXDH2中，來源於葡糖桿菌屬細菌的編碼XDH2基因的DNA與lacZ啟動子的下遊區域相連，因此其表達是在lacZ啟動子的控制下進行的。
於37℃，在50ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振蕩培養用pUCXDH2轉化的大腸桿菌JM109和用pUC18轉化的大腸桿菌JM109(對照)過夜，以作為種子培養物。將1％量的用pUCXDH2轉化的大腸桿菌JM109種子培養物接種在含新鮮培養基的燒瓶中作為平行實驗1。另一方面，將1％量的用pUC18轉化的大腸桿菌JM109種子培養物接種在含新鮮培養基的燒瓶中作為平行實驗2(對照)。培養每一個實驗組，當培養物在610nm處的光吸收變為0.7時，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖)至1mM的終濃度。然後，4小時後，培養結束。
2驗證由誘導表達獲得的蛋白質培養結束後，通過離心(12000xg，15分鐘)10ml的肉湯培養基收集細胞。將細胞懸浮在2ml的10mM Tris-HCl，pH7.5溶液中，洗滌後離心回收。將細胞懸浮於1ml相同的緩衝液中，使用多珠粒震蕩儀(Yasui Kikai)通過用0.1mm氧化鋯珠粒搖蕩3分鐘破裂細胞。將破碎後的細胞懸浮液經過SDS-PAGE，並用CBB(考馬斯亮藍)染色。結果證實一條對應於分子量大約27000到30000的帶，僅僅能在實驗1中觀察到(用pUCXDH2轉化的大腸桿菌JM109)。從分子量可推導出已表達了所需的XDH2蛋白質。
3XDH活性的證實表達蛋白質的XDH活性已被測得。根據實驗1的方法，使用上述破碎細胞懸浮液檢測XDH活性。結果，在用pUCXDH2轉化的大腸桿菌JM109中檢測到XDH的活性為14U/mg，然而作為對照的用pUC18轉化的大腸桿菌JM109中沒有檢測到XDH活性。從此結果可確認用pUCXDH2轉化的大腸桿菌JM109顯示了XDH的活性。
4從重組的大腸桿菌JM109中純化XDH2離心收集上述2中培養的用pUCXDH2轉化的大腸桿菌JM109細胞。獲得的細胞用作純化XDH的材料。通過實施例1所述的方法測得XDH活性。
(1)細胞提取物的製備將上述的細菌細胞懸浮於50mM的磷酸鉀緩衝液(pH7)中，通過5000xg離心10分鐘再收集所獲得的沉澱部分。進行包括懸浮和離心的步驟的目的是洗滌細胞。重複兩次洗滌細胞的過程。
將3g已洗滌的細胞懸浮於20ml的緩衝液1(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，1mM DTT)，4℃時用超聲波破碎20分鐘。離心(8000rpm，10分鐘)破碎細胞的懸浮液以去除細胞殘渣，並超速離心(56000rpm，30分鐘)以去除不可溶部分。
(2)陰離子交換層析將所獲的可溶部分上樣於用緩衝液1平衡過的Q-瓊脂糖FF陰離子交換層析柱(Pharmacia生產)。通過此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩衝液1洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質(非吸附蛋白質)，用含有KCl的緩衝液作為洗脫液洗脫被吸附的蛋白質。在此洗脫過程中，洗脫液中KCl的濃度是從0M到0.5M線性變化的。測定洗脫過程中得到的每一個洗脫組分的XDH活性，且發現對應於大約200到350mM KCl濃度的洗脫組分中有XDH活性。
(3)NAD親和層析合併上面獲得的含XDH活性的成份，對緩衝液1進行透析。用0.45μm的過濾器過濾經透析後的溶液。將濾液上樣於用緩衝液1平衡過的5ml NAD親和柱HiTrap Blue(Pharmacia生產)。通過此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩衝液1洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質(非吸附蛋白質)，然後用含NAD的緩衝液2(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，1mMDTT，5mM NAD)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質。結果，在被洗脫的成分中測到XDH。
(4)疏水層析對著緩衝液3(50mM磷酸鉀緩衝液，1M硫酸銨，pH7.0)透析需檢測活性的洗脫級分。通過0.45μm的濾器過濾透析後的溶液。將得到的濾液上樣於用緩衝液3平衡過的疏水層析柱苯基瓊脂糖凝膠HP(Pharmacia生產)。通過此操作，XDH被吸附到載體上。
用緩衝液3洗去沒有被吸附到載體上的蛋白質，然後用緩衝液4(50mM磷酸鉀緩衝液，pH7.0)作為洗脫劑洗脫被吸附的蛋白質，此洗脫過程中，緩衝液中硫酸銨濃度呈從1M到0M的線性變化。測得洗脫過程中得到的每一個洗脫級分的XDH活性。在對應於大約200到300mM硫酸銨的濃度時發現洗脫級分中的XDH活性。
對純化獲得的XDH活性成分進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色。結果，確認XDH2被純化到僅能檢測出一條帶的水平，分子量估計大約為27000到30000。也就是說，在大腸桿菌JM109中表達的XDH2能夠被純化為單酶。
實施例5XDH最適pH的測定通過使用實施例4獲得的XDH2酶，如下測定依賴於反應pH的酶活的差異以確定最適pH。
醋酸鈉緩衝液(pH3.3，4，4.5，5和6，)，Tris-HCl(pH7和8)，甘氨酸-氫氧化鈉(pH9)，和CAPS-NaOH(pH10)緩衝液被用作酶反應緩衝液。XDH還原反應活性測定如下30℃時將30μl的酶液加至570μl含有100mM(終濃變)D-木酮糖，0.2mM NADH，和100mM緩衝液的反應液中進行酶反應，通過使用分光光度計(BECKMAN生產的DU 640分光計)測定340nm處的光吸收來測定反應進程中NADH的減少。每分鐘減少1μmol NADH的活性定義為1U。利用NADH在340nm下的分子消光係數ε為6.3×103進行計算。加入每一種緩衝液使反應溶液有100mM的濃度。用上面純化的XDH組分作酶源，且反應在30℃下進行。測定結果被表示為相對於各個反應溶液實際測定的pH值的酶活值。為了方便起見，將pH5時的氧化反應活性定義為100。測量的結果示於圖2。
本發明的XDH2的還原反應(從D木酮糖到木糖醇的反應)的最適pH大約為5(見圖2)。由於據Cor.F.B.Witteveen，et al(微生物學，140，1679-1685，1994)報導，得自黑色麴黴的XDH的還原反應的最適pH嚴格為6.5，因此本發明得自葡糖桿菌屬的XDH2在反應的最適pH上與已知的XDH明顯不同。也就是說，已證明通過本發明發現了得自葡糖桿菌屬的XDH，至少XDH2的特徵在於在還原反應中有較低的最適pH。
序列表110Ajinomoto Co.，Inc.120(醋酸桿菌的木糖醇脫氫酶及其基因)130OP8801411999-07-16016170PatentIn Ver.2.0210121127212PRT213氧化葡糖桿菌4001Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro Leu1 5 10 15Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys20 25210221125212PRT213氧化葡糖桿菌4002Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly1 5 10 15Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg20 2521032111056212DNA213氧化葡糖桿菌220221CDS222(25)..(1053)4003cacccgccag aaggagtctt ttcc atg gct gat aca atg ctc gcc gcc gtc51Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val1 5gtc cgt gaa ttc ggc aag ccg ctc tcc atc gag cgg cta ccc atc ccg 99Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro10 15 20 25gac atc aag ccc cac cag atc ctc gtg aag gtc gat acc tgt ggc gtc 147Asp Ile Lys Pro His Gln Ile Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val30 35 40tgc cac act gac ctg cac gcc gcg cgc ggg gac tgg ccg tcc aag ccc 195Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro45 50 55aac ccg ccg ttc att ccc ggg cat gaa ggc gtc gga cac 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579Gly Gln Trp Val Ala Val Ser Gly Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala170 175 180 185gtg cag tac gcc gtc gcc atg ggc atg aat gtc gtc gcg gtg gac atc 627Val Gln Tyr Ala Val Ala Met Gly Met Asn Val Val Ala Val Asp Ile190 195 200gat gac gaa aaa ctc gcc aca gcc aaa aag ctc ggc gca tcc ctg acc 675Asp Asp Glu Lys Leu Ala Thr Ala Lys Lys Leu Gly Ala Ser Leu Thr205 210 215gtc aac gcc aag gac acg gac ccg gcc agg ttc atc cag cag cag atc 723Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Pro Ala Arg Phe Ile Gln Gln Gln Ile220 225 230ggc ggc gca cat ggc gct ctc gtc acc gct gtc gga cgg acg gcg ttt 771Gly Gly Ala His Gly Ala Leu Val Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Phe235 240 245tcg cag gcc atg ggc tat gcc cgc cgc ggc ggc acc atc gtc ctg aac 819Ser Gln Ala Met Gly Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Thr Ile Val Leu Asn250 255 260 265gga ctg ccg ccc ggc gat ttc ccg gtc tcg atc ttc gac atg gtc atg 867Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe Pro Val Ser Ile Phe Asp Met Val Met270 275 280aac ggc acc acc atc cgt ggc tcc atc gtc gga aca cgg ctg gac atg 915Asn Gly Thr Thr Ile Arg Gly Ser Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met285 290 295atc gag gcc atg gat ttc ttc gcc cgc ggc aag gtc aaa tcc gtc gtc 963Ile Glu Ala Met Asp Phe Phe Ala Arg Gly Lys Val Lys Ser Val Val300 305 310acc ccc gga aaa ctt gaa aac atc aat acg atc ttc gac gat ctg cag 1011Thr Pro Gly Lys Leu Glu Asn Ile Asn Thr Ile Phe Asp Asp Leu Gln315 320 325aat ggt cgc ctc gaa ggc cgg aca gtg ctc gac ttc cgg tcc tga 1056Asn Gly Arg Leu Glu Gly Arg Thr Val Leu Asp Phe Arg Ser330 335 340210421l343212PRT213氧化葡糖桿菌4004Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro1 5 10 15Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys Pro His Gln Ile20 25 30Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala35 40 45Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro Asn Pro Pro Phe Ile Pro Gly50 55 60His Glu Gly Val Gly His Ile Val Ala Val Gly Ser Gln Val Gly Asp65 70 75 80Phe Val Lys Thr Gly Asp Val Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala85 90 95Cys Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr 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Asn Thr Ile Phe Asp Asp Leu Gln Asn Gly Arg Leu Glu Gly Arg325 330 335Thr Val Leu Asp Phe Arg Ser3402l052112774212DNA213氧化葡糖桿菌22022lCDS222(1063)..(1848)4005gcgcaatgat cttgcgaccc gtcaggccgg cgtcgccgtc cggtccgccg atgacgaagt 60taccggtcgg gttcacgtag aactcgtctt ccgggcaggt ccagccttcc ggcaggatgc 120cgttgaccac gtcgcgcagg gtttcgccgg atcgtgttct ggctcatgcc ctcgacatgc 180tgcgtggaaa tcacgacgga cgtgacgcca accggcttgc catcgacata acgcagcgtg 240acctggctct tggcatccgg cagaaggccg acgccacggg cgtcgccgtt cttgcggtag 300tcgcggatgc gctcgaggat cgtctgcgcg taatacagcg gcgcaggcat caggtgttcg 360gtttcgcgcg tggcgtagcc gaacatgatg ccctggtcac cagcgccctc gtccttgtcg 420ctgccgctgt caacgccctg ggcgatgtcg gcggactgtg cgtgcaggta ggaggtgatg 480tcggccttct tccaggagaa accttcctgg tcgtagccga tgtccttgat ggcttcacgg 540gcacggtcga tcagcgtgtc ctcgacctct ttggggccgc ggacttcacc ggccaggatg 600acgcggttgg tggtgaccag cgtctcacag gcaacacgtg cttccggatc ggcctgcaga 660taggcgtcca gaacggtatc ggaaatgcgg tccgccacct tgtcgggatg gccctcggaa 720acggactcgg acgtgaaaag gaaatcgccg tgattgcgca ctcagggacc tcgcagggaa 780tgagtggtga gaagggccac agggtgtctt ggcagacagg ctgtggcatt cagggaggtg 840acggcttggc ggaattggtc gcaagggtca aggggctgca tggggtctga acgcggtttt 900ctgcgggaaa gtcccgaaaa ccgccgtgag atcacaaaaa agagagccgg cgcccccgtt 950tcatttttca acgacaccgt ccatgctgcg ttcgtgttcc cgcgaccctt gttgcccgtc 1020acgggtgcgg tcccgggaaa aacagagttt gaggcattcg ga atg tcg aag aag1074Met Ser Lys Lys1ttt aac ggt aaa gtc tgt ctg gtc acc ggc gcg ggt ggc aat atc ggt 1122Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly Asn Ile Gly5 10 15 20ctt gcg acc gcc ctc cgt ctg gca gaa gag ggc acg gcc atc gcc ctt 1170Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr Ala Ile Ala Leu25 30 35ctg gac atg aac cgc gag gcg ctg gaa aag gcg gaa gcc tcc gtc cgt 1218Leu Asp Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu Ala Ser Val Arg
40 45 50gaa aag ggc gtc gaa gcc cgc tcc tat gtc tgt gac gtc acg tcc gaa 1266Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp Val Thr Ser Glu55 60 65gag gcc gtg atc ggg acg gtg gat agc gtg gtc cgg gac ttc ggg aag 1314Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg Asp Phe Gly Lys70 75 80atc gac ttc ctg ttc aac aat gcc ggc tat cag ggc gcc ttc gcc ccc 1362Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly Ala Phe Ala Pro85 90 95 100gtg cag gac tac ccg tcc gac gat ttc gcg cgc gtg ctg acg atc aac 1410Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val Leu Thr Ile Asn105 110 115gtc acc ggt gcc ttc cac gtc ctc aaa gcc gtt tcg cgc cag atg atc 1458Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser Arg Gln Met Ile120 125 130acg cag aac tac ggg cgc atc gtc aac acc gcc agc atg gcc ggt gtg 1506Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn Thr Ala Ser Met Ala Gly Val135 140 145aag gga ccg cca aac atg gcc gcc tat ggt gcg tcc aag ggc gcc atc 1554Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Ala Ser Lys Gly Ala Ile150 155 160atc 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1958gtcctgcgag ccatcttgcg gccagcaggg cgcctcttgc gaagaccctg cggtccagtg 2018cgcggtgcga cagagtgatc tgttcgtctg cggccatcag aacgagatca tgttcgccta 2078cgatctgtcc gccgcgcagg gaggcgaatc cgatcgcgcc atccggacgt cggccgttct 2138ggtcggtccg ggccacgtcc tcgaaactga caccacgtcc ttccgccaca gcccggccga 2198tcgccagtgc cgtgccggac ggcgcgtcca gcttctggcg gtgatgaact tccagaattt 2258ccgcatcata atccggcagc cctgcaccaa gctgacgggc gagctccaga aacagcgtca 2318gcgccggtga gaaattggcg gcctgaagaa cgggaatatg ctgcgccgcc gcgttcacgg 2378catcctgcgc gccctgatcg agccccgtcg tccccagaac ccaggcgcat ccggcctgcg 2438caaaggctgc cgcatgggcc ggaacggtcg aagcatggct gacatcgatc acgacatcgc 2498agtttttcgc gagtgcggcg ggatcggtgg tgatgttgcg ctgggggtct gctgtccggg 2558agaggccgcc gacgagggca gaaccagcct cttcggcaca aagcgttcca agccggcccg 2618taatgccggc gataccaata cggggagcag aaatcagggt catggtcggt ccatcagaac 2678ggaaaaatca ggtgttggcg tcaagccggg catcgaaacg ggcacgggcc gcctcgattt 2738cgggacggtt cgacagcgcc cactgaccga aagctt 27742106211262212PRT213氧化葡糖桿菌4006Met Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly1 5 10 15Gly Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr20 25 30Ala Ile Ala Leu Leu Asp Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu35 40 45Ala Ser Val Arg Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp50 55 60Val Thr Ser Glu Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg65 70 75 80Asp Phe Gly Lys Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly85 90 95Ala Phe Ala Pro Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val100 105 110Leu Thr Ile Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser115 120 125Arg Gln Met Ile Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn Thr Ala Ser130 135 140Met Ala Gly Val Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Thr Ser145 150 155 160Lys Gly Ala Ile Ile Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu Asp Leu Ala165 170 175Pro Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro180 185 190Gly Phe Met Trp Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys Val Gly Ser195 200 205Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln Met Ile Gly210 215 220Ser Val Pro Met Arg Arg Tyr Gly Asp Ile Asa Glu Ile Pro Gly Val225 230 235 240Val Ala Phe Leu Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr Gly Val Asn245 250 255Leu Pro Ile Ala Gly Gly260210721129212DNA213人工序列220221不確定222(19)223n＝a or c or g or t220223人工序列XDH1-S1引物的描述4007gcngayacna tgytngcngc ngtngtnmg29210821137212DNA213人工序列220221不確定222(19)223n＝a or c or g or t220223人工序列XDH1-S2引物的描述4008cggaattcgc ngcngtngtn mgngarttyg gnaarcc37210921135212DNA213人工序列220221不確定222(19)223n＝a orc or g or t220223人工序列XDH2-S1引物的描述4009aaraarttya ayggnaargt ntgyytngtnacngc 352101021137212DNA213人工序列220221不確定222(19)223n＝a orc or g or t220223人工序列XDH2-S2引物的描述40010cggaattcgt nacnggnggn ggnaayathg gnytngc 372101121135212DNA213人工序列220223人工序列C1引物的描述40011gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca 352101221135212DNA213人工序列220223人工序列C2引物的描述40012cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga 352101321131212DNA213人工序列220223人工序列XDH2UP-S1的描述40013gatcttccga agtcccggac cacgctatcc g 312101421139212DNA213人工序列220223人工序列XDH2UP-S2引物的描述40014cggaattccg tcacagacat aggagcgggc ttcgacgcc 392101521129212DNA213人工序列220223人工序列XDH2-5』引物的描述40015ccgggattcc agagtttgag gcattcgga 292101621130212DNA213人工序列220223人工序列XDH2-3』引物的描述40016ccgggatccg caagatggct cgcaggacgc 30
權利要求
1.在如下(A)或(B)中定義的蛋白質(A)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列的蛋白質；(B)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質。
2.在如下(C)或(D)中定義的蛋白質(C)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列的蛋白質；(D)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質。
3.編碼在如下(A)或(B)中定義的蛋白質的DNA(A)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列的蛋白質；(B)具有序列表中SEQ ID NO4胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質。
4.編碼在如下(C)或(D)中定義的蛋白質的DNA(C)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列的蛋白質；(D)具有序列表中SEQ ID NO6胺基酸序列，其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質。
5.權利要求3中的DNA，其定義於如下(a)或(b)(a)至少含有一段對應於序列表的SEQ ID NO3中第25到1053位的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴緊條件下可與具有對應於序列表的SEQ ID NO3中第25到1053位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸製備的探針進行雜交，並且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質的DNA。
6.權利要求5中的DNA，嚴緊條件是在60℃下，鹽濃度相當於1x SSC和0.1％SDS時進行洗滌。
7.權利要求4中的DNA，其定義於如下(c)或(d)(c)至少含有一段對應於序列表SEQ ID NO5中第1063到1848位的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴緊條件下可與具有對應於序列表的SEQ ID NO5中第1063到1848位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸製備的探針進行雜交，並且能編碼有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質的DNA。
8.權利要求7中的DNA，嚴緊條件是在60℃下，鹽濃度相當於1x SSC和0.1％SDS時進行洗滌。
9.以由權利要求3至8中任一DNA編碼的木糖醇脫氫酶可被表達的方式被導入所述DNA的細胞。
10.生產木糖醇脫氫酶的方法，所述方法包括在培養基中培養權利要求9的細胞以便木糖醇脫氫酶可以在培養基中產生和積累，並且從培養基中收集木糖醇脫氫酶。
11.生產木糖醇的方法，所述方法包括用權利要求1或2的木糖醇脫氫酶作用於D-木酮糖，並收集產生的木糖醇。
12.生產木糖醇的方法，所述方法包括用權利要求9的細胞作用於D-木酮糖，並收集產生的木糖醇。
全文摘要
通過木糖醇脫氫酶或被導入編碼木糖醇脫氫酶的DNA的細胞產生木糖醇,木糖醇脫氫酶是一種作用於D－木酮糖的(A)或(B)蛋白質,並收集產生的木糖醇:(A)具有序列表中SEQIDNO:4胺基酸序列的蛋白質;(B)具有序列表中SEQIDNO:4胺基酸序列,其中有一個或幾個胺基酸發生替換、缺失、插入、增加或倒位,且有木糖醇脫氫酶活性的蛋白質。
文檔編號C12N9/04GK1247230SQ99119628
公開日2000年3月15日 申請日期1999年7月30日 優先權日1998年7月30日
發明者杉山雅一, 外內尚人, 鈴木俊一, 橫關健三 申請人:味之素株式會社